Summary
Burada bir iletişim kuralı açıklamak yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri ortaya çıkarmak için istihdam için özellikle rhabodvirus ve vaksinia virüs tedavisi, ama -ebilmek var olmak diğer oncolytic için kolayca adapte virüs platformlar veya virüs çoğaltma genellikle modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için.
Abstract
Yüksek işlem hacmi genom çapında RNAi (RNA müdahale) tarama teknoloji virüs çoğaltma etkileyen ana faktörler keşfetmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada bu teknoloji uygulama özellikle Maraba virüs, bir oncolytic rhabdovirus ve vaksinia virüs çoğaltma terapi artırılması amacı ile modüle ortaya çıkarılması ana hedefleri için mevcut. Protokol oncolytic Maraba virüs ve oncolytic vaksinia virüs ile kullanım için test edilmiştir, bu yaklaşım diğer oncolytic virüsler için uygulanabilir ve ayrıca virüs çoğaltma memeli hücrelerinde modüle ana hedefleri belirlemek için yararlı olabilir Genel. Geliştirme ve doğrulama için yüksek üretilen iş RNAi tarama memeli hücrelerinde, kritik noktalar ve hazırlık adımları bir birincil yüksek üretilen iş RNAi ekran ve bir adım adım kılavuz için yürütmek için önemli bir testin Bu protokolünü açıklar birincil bir yüksek-den geçerek RNAi ekran yürütülmesi; Buna ek olarak, genel olarak ikincil ekran doğrulama ve Tersiyer doğrulama çalışmaları yürütmek için yöntemleri özetlenmektedir. Bir katalog, bir kapsamlı ve tarafsız biçimde, virüs çoğaltma için bir infektivite gibi bir vitro tahlil geliştirmek herhangi bir yönünü modüle ana faktörler sağlar tarama olduğu yüksek üretilen iş RNAi yararına veri bloğu boyutu, ve sitotoksisite. Güç biotherapeutic hedefleri beklenmedik geçerli bilgiye dayalı ortaya çıkarmak için vardır.
Introduction
Yüksek işlem hacmi genom çapında RNAi tarama çalışmanın virüs Biyoloji de dahil olmak üzere çeşitli alanlarda biyolojik anlayışlar ifşa için paha biçilmez bir araç olarak kanıtlamıştır. Son on yıl ya da daha fazla, çok sayıda gruplar hücre tabanlı büyük ölçekli RNAi yoğun virüs çoğaltma (1,2,3,4 yorum modüle ana bilgisayar genlerin tanımlamak için eleme üstlendik , 5 , 6 , 7). İlginçtir, bu ekranlar, çok sayıda gerçekleştirdik kanser hücrelerinin ve birkaç vaksinia virüs8,9,10 da dahil olmak üzere geçerli oncolytic virüs aday olan virüs ile , Miksoma virüs11, herpes simpleks virüs12, vesicular Stomatit virüs13,14ve Maraba virüs15. Bu çalışmaların çoğu odak virüs çoğaltma bazı yönlerini etkileyen ana faktörler tanımlama ve oncolytic virüs tedavisi arttırmak için biotherapeutic hedef belirlemekle değil iken, değerli veri içinde bu veri kümelerinden mayınlı Bu konuda. Bu oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri tanımlamak için güçlü potansiyel tam olarak istismar olmayan ki açıktır.
Oncolytic virüs platformlarına bir bolluk şu anda test ediliyor hangi gözle son aşama klinik çalışmalarda başarıya sahiptir herpes simpleks virüs, reovirus ve vaksinia virüsü, dahil olmak üzere preklinik ve klinik çalışmalar. Bu platformlar çoğunluğu için çabaları virüs genleri değiştirerek doğru tedavi geliştirmek için yönetti. Örneğin, tümör özgüllüğü artırmak için belirli virüs genleri silinmiş veya önemli ölçüde viral çoğaltma normal hücreleri ama tümör hücreleri kısıtlamak için mutasyona uğramış. Bazı durumlarda, transgenes GM-bağışıklık yanıtı artırmak için CSF (granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör) içinde vivo görüntüleme ve hücresel radioiodide alımı etkinleştirmek için NIS (sodyum iyodür simporter) gibi için eklenmiş olabilir veya tedavi amaçlar. Ancak, ana bilgisayar/tümör genler manipüle ve oncolytic virüs çoğaltma ana bilgisayar/tümör genler etkilerini keşfetmek odaklanmış çok az çalışma olmuştur. Yüksek üretilen iş tarama teknoloji çıkışıyla, şimdi ana bilgisayar virüs etkileşimleri bir genom ölçekte soruşturma için ve oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için ana bilgisayar genom işlemek için fırsatlar deşifre etmek mümkündür (16', gözden 17,18).
Biz ilk çalışma gösteren,-yüksek-den geçerek oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri tanımlamak için eleme genetik kullanmak için prototip bildirdi. Maraba virüs oncolysis, bir oncolytic rhabdovirus aşamasında sınanmakta modüle ana bilgisayar genler keşfetmek için ı ve II denemeler, biz genom çapında RNAi ekranlar yinelenen bir siRNA (kısa RNA müdahale) ile üç farklı tümör hücre hatları üzerinden yapılan Kütüphane 18,120 genler15hedefleme. Ekranları tespit sayısı yolu analizini zenginleştirme ER (endoplazmik retikulum) stres yanıt yolları üyelerinin saptandı. Biz 10 hits içinde bu yollar bu birincil ekranın farklı hedefleme serileri ile siRNA kullanarak ikincil doğrulama için seçildi. Tersiyer doğrulama bir parçası olarak, biz bir kurtarma IRE1α ile deney (hit hedef olduğunu onaylamak için inositol gerektiren enzim 1 alfa). Vitro ve in vivo küçük molekül inhibitörü olan IRE1α kullanarak test önemli ölçüde geliştirilmiş oncolytic etkinlik sonuçlandı.
Workenhe vd. 12 de yürütülen bir havuza alınan lentiviral shRNA (kısa saç tokası RNA) kullanarak bir genom geniş RNAi perde 1 (HSV-1) mutant KM100-aracılı oncolysis meme tür kitaplığına insan herpes simpleks virüsü kısıtlayan ana faktörleri tanımlamak için 16,056 genler hedefleme kanser hücreleri. Birincil ekranında, sahte enfekte hücreleri üzerinde gelişmiş sitotoksisite KM100 enfekte hücre için hangi yol nakavt 343 genleri tespit; 24 bu genlerin ikincil doğrulama için seçtikleri. 24 genlerin dışarı 8 genler bir tanesi ile ikincil ekranında teyit edildi daha sonra üçüncül doğrulama sırasında bir genetik kurtarma deneyi kullanarak teyit edildi (serin/arginin-zengin Uçbirleştirme faktör 2) SRSF2 olmak. Grup SRSF2 fosforilasyon azaltılmış ve HSV-1 KM100 kombinasyon tedavisi ile genişletilmiş TUBO tümörü taşıyan fareler yaşama bu inhibitörü yol gösterdi ki bir DNA topoizomeraz inhibitörü ilaçlar tanımlamak için devam etti.
Söz konusu çalışmalarda, benzer bir iş akışı izledi. Her birincil ekran tanımlanan sayısı belirli bir sayıda tarafından ikinci bir ekran izledi birincil bir genom geniş RNAi perde ile başladı. Bu hit hedef üzerinde olduğunu onaylayan dahil Tersiyer doğrulama çalışmaları tarafından izledi genetik gerçekleştirerek deneyleri içinde vitro hedef gen ürün içinde vivomanipüle ederek son doğrulaması ile kurtarma. Bu makalede, biz ilk bir genel protokol geliştirme ve en iyi transfection koşulları, virüs miktarı ve enfeksiyon uzunluğunu belirleme içerir yüksek üretilen iş siRNA-tarama testin doğrulama için sağlar. Ayrıca birincil yürütmek için detaylı bir protokol yönteminin ikinci ekran doğrulama ve Tersiyer doğrulama gerçekleştirmek için genel bir açıklama yanı sıra yüksek üretilen iş siRNA ekran sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. geliştirme ve tahlil eleme yüksek üretilen iş siRNA doğrulama
Not: Tüm deneyler için Hepes tampon büyüme medya her hücre satırı için uygun kullanın. Tahlil optimizasyonu akışından Tersiyer doğrulama için genel bir bakış için bkz: şekil 1 .
- En iyi transfection koşullar belirlenmesi
- Bir tümör hücre satırı seçin veya ideal satırları da transfection koşulları (örneğin 786-O, ncı-H226, SF268, U373, OVCAR-8, U20; tartışma hücre hatları yelpazesi daha fazla bilgi için bkz:) en iyi duruma getirmek birden fazla tümör hücreleri.
- Transfection reaktif veya birkaç test etmek için seçin. Bazı daha toksik veya belli bir hücre satırı diğerlerinden daha verimli olabilir gibi birkaç transfection reaktifler, test etmek gerekli olabilir. Ayrıca, bazı virüs enfeksiyonu üzerinde etkisi olabilir veya görüntüleme üzerine yüksek arka plan sinyal verebilir göz önünde bulundurun.
- Olumlu karar [e. g. hücre ölümüne neden olmaktadır PLK-1(Polo Like Kinase 1) mRNA hedefleme siRNA] ve negatif transfection denetimleri (örneğin hedefleme-siRNA).
- Belirli transfection reaktif için geriye doğru transfection iletişim kuralı izleyin ama transfection reaktifi (örneğin 0,05 0,1, 0,15 ve 0,2 μL/de) ve hücre yoğunluğu (örneğin 625, 1250, 2500 hücreler/iyi) tohum miktarı değişir. Çoğaltır aşağıdaki koşulları içerir: hücreleri tedavi edilmezse, alay transfected hücreleri (Yani hücreleri artı transfection reaktif) ve pozitif ve negatif transfection denetim siRNA ile transfected hücreleri ( şekil 2A örnek plaka için bkz. Düzen).
- Genel olarak, her siRNA, 80 nM dilutions 10 iyi son bir konsantrasyon için hazırlamak nM (bağlı olarak Kütüphane, siRNA daha yüksek bir konsantrasyon gerekli olabilir). Aksi belirtilmediği sürece, transfection reaktif Dilüent ile siRNA oranında seyreltin. Dilutions transfection reaktif hazırlayın.
- Damlalıklı 5 μL siRNA seyreltilmiş transfection reaktif 5 μL tarafından takip de başına. Bu adımı kolaylaştırmak için bir sütununda bir U-alt 96-şey plaka, siRNA karışımları ve siRNA seyreltici (tedavi edilmemiş ve sahte transfected hücreler için) yalnız dağıtın. İkinci bir sütun, seyreltilmiş transfection reaktif ve transfection reaktif seyreltici (tedavi edilmemiş hücreler için) yalnız boyunca dağıtabilirsiniz.
- Bir elektronik damlalıklı, damlalıklı 5 μL/iyi siRNA veya siRNA Dilüent 384-şey plaka karşılık gelen kuyu içeren ilk sütunun içeriğini kullanarak seyreltilmiş transfection reaktif veya transfection reaktif Dilüent üzerinden 5 μL/iyi izledi ikinci sütun.
- Plakayı vasıl 1026 x g için oda sıcaklığında 1 dk santrifüj kapasitesi ve transfection reaktif için reçete kez kuluçkaya (örneğin 5-20 dk).
- Tabakları kuluçka iken, hücre süspansiyonlar farklı yoğunlukları, hazır olun. Damlalıklı 30 μL hücre süspansiyon iyi başına. Tabakları da kuluçka makinesine koymadan önce tek tip hücreler19yerleşme izin vermek için oda sıcaklığında 45-60 dakika için oturup plakaları ver.
Not: siRNA ile transfection reaktif için reçete kuluçka süresi kısa ise, hücre süspansiyonlar kuluçka önce hazırlayın. - Belgili tanımlık perde için seçilen nakavt istenen uzunluğuna bağlı olarak 48 ila 72 h için kuluçkaya.
- Bir sabitleme ve formaldehit, Höchst 33342 ve PBS (fosfat tamponlu tuz) % 4 formaldehit ve 5 ug/mL Höchst 33342 de her şey bir son konsantrasyon için oluşan çözüm boyama hazırlayın. Sinyal çok zayıf veya çok güçlü, sırasıyla ise gerektiği gibi bir daha yüksek (örneğin 7,5 ug/mL) veya düşük yoğunluklu (örneğin 2 ug/mL) Höchst deneyin.
- Sabitleme ve boyama çözüm 30 μL doğrudan tüm kuyu dağıtmak. Plakayı 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Plakayı 4 ° C'de depolayın Confocal mikroskop kullanıyorsanız, tabak tabak yıkama PBS ile yıkayın; Çoğu durumda, çamaşır confocal mikroskop kullanırken gereksizdir.
- İyi başına hücre sayısı ölçmek için bir komut dosyası geliştirin.
Not: Kullanılabilir birkaç yazılım paketleri bu amaç için ve her komut dosyaları oluşturma farklı şekillerde olabilir iken, tüm genellikle yanı sıra hesaplama yoğunluklarda nükleuslar, hücreleri ve ilgi bölgeleri tanımlayan bir anlamı var ve Morfolojik özellikleri. Bir tarama komut dosyası geliştirirken, plaka başına komut dosyasını çalıştırmak için ve belki de işlem zamanı en aza indirmek için sadece gerekli ölçümler için gereken süreyi dikkate almak önemlidir. Örneğin, cep numarası ölçmek için bir ücret oldukça üzerinde belirtilen bir yoğunluk Höchst alanını hesaplamak; ve virüs yaymak ölçmek için bir ücret oldukça üzerinde belirtilen bir yoğunluk GFP (yeşil flüoresan protein) alanını hesaplamak. "Aşağı pared" komut dosyası temel bilgi kayıp olduğundan emin olmak için daha ayrıntılı komut dosyasına karşılaştırılmak üzere gerekir. - Transfection reaktif tutar ve bu önemli hücre ölümü (0-%30 hücre hayatta kalma) ve hücrelere (örneğin 90-%100 en az toksik olan yoğunluğu tohum cep en iyi transfection koşulları belirlemek için sonuçlarını analiz hücre hayatta kalma). Not: Hücre ölüm fenotip uzun katlama kez hücre satırı gözlemlemek için daha uzun sürebilir. Bkz: şekil 2B ve 2 C temsilcisi sonuçları için. Ayrıca, daha sonra bir bu confluency olan hücreleri enfekte isteyeceksiniz gibi hedefleme-siRNA ile transfected hücreleri yaklaşık 90-%100 birleşmesi fiksasyon anda olduğundan emin olun.
- Virüs en uygun miktarda ve enfeksiyon uzunluğu belirlenmesi
- (Bkz. yukarıda 1.1.4.1-1.1.4.4) açıklandığı gibi aynı ters transfection adımları uygulayın; Ancak, sadece en iyi transfection koşulları (bkz: 1.1.8) kullanın (örneğin 786-O hücreler için: 1500 hücreler/iyi ve 0,05 μL/iyi RNAiMAX) ve buna ek olarak, var olmak bulaştırmak ile virüs [örneğin wells ile tedavi edilmezse hücreleri, alay etmek için ilave wells dahil transfected hücreleri, hücre hedefleme-siRNA ve olanlar (Yani inhibe veya çoğaltma geliştirmek ana bilgisayar genlerin hedefleme siRNA) biliniyorsa olumlu virüs kontrolleri ile transfected hücreleri ile transfected].
- Şekil 3A için bir örnek plaka düzen bakın. 48-72 saat için kuluçkaya.
- Ek virüs wells bir floresan muhabir protein (örneğin GFP) çeşitlilikler enfeksiyon (MOIs) (örneğin 0,001-10; bir dizi ifade bir oncolytic virüs ile enfekte Seçilen Aralık olması bağlı olacaktır direnç seviyesi veya duyarlılık hücre satırı.). Bulaşmamış wells de içerir. Damlalıklı 40 80 μL son hacmi için iyi başına her virüs seyreltme μL. Her plaka 400 x g için oda sıcaklığında 30 dk santrifüj kapasitesi.
- Aşağıdaki enfeksiyon, hücreleri yüksek içerikle canlı görüntü otomatik mikroskop düzenli aralıklarla (örneğin her 4-8 h). Bkz: şekil 3B ve 3 C.
- Virüs yaymak (örneğin iyi başına GFP alan) ölçmek için bir komut dosyası geliştir (1.1.7 bakın). Görüntüleri analiz ve süresi noktası ve artar ve azalır formada tespiti için izin bir MOI seçin. Zaman noktası ve MOI sonbahar küçük değişiklikler formada tespiti kolaylaştırmak için doğrusal bir aralık içinde olun. Z-faktör tahmin etmek (veya Z') için verilen zaman noktası ve MOI.
Not: Z-faktör tahmini 1-3 (σp + σn) = / | μp- μn|, nerede σp örnekleme standart sapması pozitif virüs denetimlerinin ve σn negatif virüs örnek standart sapması denetimleri; ve μp olumlu virüs denetimleri ve μn negatif denetimleri örnek ortalaması örnek ortalaması. Bir tahmini Z-0,5 - 1,0 mükemmel bir tahlil için düşünülmüş ve20,21süzmek için uygun faktördür. - Negatif virüs denetimi siRNA herhangi bir etkisi virüs çoğaltma'sahte transfected ve tedavi edilmezse wells karşılaştırarak olduğunu onaylayın. Genellikle birden çok olumsuz denetim denetimleri virüs çoğaltma üzerinde etkisi olabilir bazı olumsuz siRNA olarak test etmek gereklidir.
- (Bkz. yukarıda 1.1.4.1-1.1.4.4) açıklandığı gibi aynı ters transfection adımları uygulayın; Ancak, sadece en iyi transfection koşulları (bkz: 1.1.8) kullanın (örneğin 786-O hücreler için: 1500 hücreler/iyi ve 0,05 μL/iyi RNAiMAX) ve buna ek olarak, var olmak bulaştırmak ile virüs [örneğin wells ile tedavi edilmezse hücreleri, alay etmek için ilave wells dahil transfected hücreleri, hücre hedefleme-siRNA ve olanlar (Yani inhibe veya çoğaltma geliştirmek ana bilgisayar genlerin hedefleme siRNA) biliniyorsa olumlu virüs kontrolleri ile transfected hücreleri ile transfected].
- Yüksek işlem hacmi tarama testin son doğrulama
- 1.2.1 ve 1.2.2 yukarıdaki adımları, ama en iyi MOI ile yalnızca bu zaman bulaştırmak hücreleri tekrar. Canlı görüntüleme, yerine tamir ve plaka (1.1.5 ve 1.1.6 bölümünde açıklandığı gibi) en uygun leke süresi-noktası (1.2.4 bakın).
- Görüntü plaka. Belgili tanımlık perde için kullanılan aynı komut dosyası kullanarak sonuçları analiz (bkz: 1.1.7 ve 1.2.4). (Yani iyi nakavt Wells ile pozitif transfection hakim olmak ve en az toksisite Wells ile negatif transfection denetim transfected transfected) transfection koşulları onaylayın. Z-faktör tahlil sağlamlık belirlemek için tahmin (1.2.4 bakın).
- Daha fazla test ve yüksek üretilen iş tarama yapmak için dikkat edilmesi gereken noktalar
- Bir kaç tabak Santrifüjü sırasında özellikle kapakları tutulur ve birden çok tabak hemen centrifuged çatlayabilir microtiter plakaları dayanıklılığını test. Çatlama azaltmak için kapakları santrifüj kapasitesi (plakaları mühürler varsa), ya da kova centrifuged tabak sayısını azaltın.
- Zaman içinde transfection reaktif mix kararlılığını sınayın. Transfection reaktif plakaları için eklendikten sonra daha önce hücreleri eklenmesi önemli bir gecikme olabilir; Bu nedenle, transfection reaktif mix yürürlükte kalacaktır süre bilmek önemlidir. Belgili tanımlık perde için hücreleri transfection reaktif karıştırın tabakları için ekleme öncesinde hazırlamak gerekli olabilir.
- Sıvı Sabunluk kullanmak için hazır olun. Transfection reaktif, hücreleri, virüs dağıtmak için gereken birimleri belirlemek ve tüp tutar, birim (birim bu özellik varsa) önceden dağıtımı için kayıp hacmi ve kalan hacimli için kullanılan şişelerde gerekli dikkate alarak tamir dağıtımı.
- Ayarla ve transfection reaktif, hücreleri ve virüs dağıtımı için kullanılacak programları test. Transfection reaktif kaybı en aza indirmek için sınırı, mümkünse, sayısını önceden dağıtır. Sıvı Sabunluk ayarlama ve onun doğruluk ve kesinlik test için bir iletişim kuralı oluşturun.
- Toplu transfection reaktif, hücreleri ve virüs dağıtım için hazırlamak
- İlk tabak tabak feasibly hemen trypsinized hücre sayısı dikkate alınarak bir toplu iş iş işlemde işlenecek sayısını belirlemek, -ebilmek var olmak microtiter tabak sayısını bir kez, bir dizi işlemek için gereken sürenin uzunluğu centrifuged Sıvı Sabunluk ve görüntüleme için gereken süreyi ile plakalar. Not: Genel olarak, yaklaşık 30 plakaları teker teker işlem oldukça uygun ve plakaların 3 toplu işleme bir günde yönetilebilir.
- Ampirik plakaların bir toplu işi için gerekli transfection reaktif hacmi doğrulayın. Bu birimin birden çok kez bir plaka arasında tek bir toplu işlemek için gereken eşdeğer sayısını distile su dağıtım 5 μL tarafından yeterli olduğunu test.
- Hücreler eşit dağılımı sağlamak için hücreleri plakaları bir dizi dağıtmak için gereken süreyi tahmin etmek. Bir toplu iş için gerekli hücre hacmi içeren bir şişe hazırlamak ve hücreleri bir tabak birden çok sütuna bir zamanda, bu toplu iş plakalar arasında dağıtmak için gerekli süreyi aynı boyunca düzenli aralıklarla dağıtmak. Test ne sıklıkta eşit dağılımı hücreleri korumak için hücreleri karıştırmak gerekli olacaktır.
- Virüs eşit dağılımı sağlamak için aynı işlemi olarak (bkz: 1.4.4.3), yukarıda ama virüs Konfluent wells üzerine dağıtımı bu sefer tekrarlayın. Virüs eşit olarak dağıtılır değil, konik boru ve vortexing virüs her tüp dağıtım öncesinde hazırlanması göz önünde bulundurun.
- Yeterince hücre ekranı büyütmek için zaman çizelgesi belirlemek hücrelerinin büyümesini izlemek. Ayrıca, plaka log fazı içinde belgili tanımlık perde için gereken miktar tahmin edebilmek için büyüyen hücre başına hasat hücrelerin ortalama sayısı belirleyin.
- Son hazırlık ve sunuş adımları yüksek üretilen iş taraması
- Yukarıya için tarama, başlama tarihinden bir ay önce tüm belgili tanımlık perde için gerekli malzemelerin belirleyin. (Bkz: malzemeler) herhangi bir gerekli reaktifler sipariş. Yandan virüs gerekli miktarda olduğundan emin olun (tercihen, en iyileştirme sırasında kullanılan aynı hisse senedi kullanın.).
- Yukarıya için tarama, başlamadan önce iki hafta çözülme ve belgili tanımlık perde için gerekli hücreleri büyümek. Santrifüj ve kare santrifüj kovaları kullanılabilirliğini sağlamak.
- Tarama başlıyor önce haftasında medya şişe ters transfection ve enfeksiyon, bir hisse senedi % 70 etanol, 2 X transfection reaktif seyreltici için hazırlamak (örneğin 2 X Opti-MEM), eğer gerekli (Eğer siRNA Kütüphane içinde seyreltilmişörneğin RNase-free su, bir 2 X hücreleri transfect kullanmak isteyeceksiniz) ve aliquots virüs (bir tabak dizi başına). Hücreleri durumunu doğrulayın.
- Höchst 33342 leke stok çözeltisi hazırlamak (örneğin 5 mg/mL). Bir centrifuging için gerekli olması durumunda bir denge tabak hazırlamak.
- O-var olmak kullanılmış Eğer tabak yıkama iyi çalışır durumda olduğundan emin olun. Sıvı Sabunluk düzgün kalibre edilmiş ve dağıtım tam ve doğru olduğundan emin olun. Ayrıca, programlar üzerinde Sıvı Sabunluk düzgün ayarlandığından emin olun.
2. birincil yüksek üretilen iş ekran yürütülmesi
Not: RNAi ekran başlayan önce microtiter Tabaklar (örneğin 384-iyi tabaklar) siRNA Kütüphane ve tarama denetimler ile dizilmiş gerekir. Aşağıdaki adımları en iyi transfection reaktif ve hücreler arasında plakaları ve ikinci kişi (Yani kişi B) olması sorumlu dağıtımı için öncelikle sorumlu bir kişi (Yani kişi A) ile iki kişi tarafından yapılmaktadır Plakayı hemen önce transfection ve hücrelerin hazırlanması için centrifuging. Parantez içinde dahil 33 plakaların bir toplu işleme için bazı özellikleri vardır (Yani yarım Kütüphanesi) 786-O hücre ile.
- Ters transfection için hazırlık
- Kişi A: yeterli medya, tripsin ve PBS 37 ° C su banyosunda plakaların bir toplu işi için gerekli yerleştirin. İsteğe bağlı: bir tabak hücre Trypsinize ve toplu iş gerekli tabak sayısını gerçek zamanlı bir tahmin sağlamak için plaka başına hücre sayısını saymak.
- Dondurucudan plakaların (örneğin 33 plakaları) bir toplu iş elde etmek ve defrost plakaları izin vermek için 20-30 dakika bekleyin. Tabakları defrost, aşağıdaki adımlarla devam edin.
- Kişi A: damlalıklı 50 mL konik içine transfection reaktif seyreltici plakaların bir toplu işlem için gerekli miktarda tüpler (örneğin 2 x 37.125 mL) ve bir 37 ° C su banyosunda koyun. İki şişe % 70 etanol (örneğin 250-500 ml'lik şişe) ile doldurun. İki 50 mL konik tüp PBS ve distile su ile doldurun.
- Kişi A: % 70 etanol bir şişe içine tüp Sıvı Sabunluk bırakın. Tüm belgili tanımlık keyif transfection reaktifi (plaka dış kuyu değil kullanılıyorsa,örneğin ) dağıtımı için değil kullanılacaksa, gereksiz boru ilk bağlantısını kesin. Maskeleme bandı aşağıda steril tüp kabul edilebilir noktaya işaretlemek için tüp etrafında bir parça yerleştirin. Yaklaşık 25 mL ile Başbakan. Ek etanol kayıp birim yerine şişe içine dökün. Tüp izin etanol en az 5 dk içinde oturmak.
- Kişi b hücreleri trypsinize için hazırla. Doku kültürü (TC) hood % 70 etanol ile sprey. Sprey ve gerekli pipets, ipuçları, şişe ve başlık hücrelerde hazırlanması için microfuge tüpleri yerleştirin (bkz: 2.2.1.1 ve 2.2.1.2). Mühürlü plakalar setleri vasıl 1026 x g için oda sıcaklığında 2 dk santrifüj kapasitesi. Kapakları (bkz 1.4.1) tutulur plakaları Santrifüjü sırasında çatlamak önceden belirlediyseniz TC başlıklı tabak kapakları kaldırın.
- Kişi A: mühürler plakalar kaldırın. Daha önce sırasında veya sonrasında mühürler (gerekli kuluçka uzunluğuna bağlı olarak), kaldırılmıştır damlalıklı transfection reaktifi (örneğin 375 RNAiMAX/iyi 0,05 μl son bir konsantrasyon için μL/tüp) konik tüpler içine gerekli miktarda Önceden ısıtılmış transfection reaktif seyreltici (örneğin 37.125 mL/tüp) içeren.
- Aşağı yukarı 10 kez pipetting karıştırın. Oda sıcaklığında kullanılan transfection reaktif için (örneğin 0-10 dk) reçete kez kuluçkaya.
- Geriye doğru transfection
- Kişi aşağıdaki görevleri tamamlamanız B var.
- Hücreleri (örneğin 3 tabak 786-O hücre) trypsinizing başlar. Her plaka medyadan Aspire edin. Durulama PBS ile 9 mL. Tripsin plaka başına 3 mL damlalıklı. Yaklaşık 5 dk. Resuspend için medya 22 mL hücrelerle 37 ° C'de kuluçkaya. Damlalıklı yukarı ve aşağı 10 kez.
- Hücre süspansiyon her doku kültürü plaka steril bir şişe birleştirin. Hücre süspansiyon ters çevirme ile karıştırın. İki ayrı microfuge tüp içine hücre süspansiyon damlalıklı 1 mL aliquots. Bir örnek her microfuge tüpü çıkarması ve hücreleri saymak. Yoğunluk (örneğin 1500 hücreler/de) gerekli için gerekli hücre süspansiyon hacmi hesaplamak ve yeterli seyreltilmiş hücre süspansiyon hazırlamak (örneğin 500 mL) plakaları bir dizi dağıtmak için.
- Kişi A paralel kişi B. için aşağıdaki görevleri tamamlamanız gerekir
- Sıvı Sabunluk boş etanol boru. Boru PBS yaklaşık 25 mL ile Başbakan ve tüp boş. Boru transfection reaktif dalmış ve daha sonra hücre süspansiyon steril tutulur maskeleme bandı aşağıda bölümünü sağlamak için tüp ele alırken dikkatli olun. Transfection reaktif çözüm bir konik tüp ile güvenle yapılabilir plakaları ayırmalıdır.
- Damlalıklı transfection reaktif çözümler yukarı ve aşağı 10 kat. Boru transfection reaktif çözüm ile Başbakan. Transfection reaktif kaybını en aza indirmek için yeterli çözüm ile çok az temizleyin ipuçları için hazırla. Sıvı Sabunluk doğru programı seçin ve transfection reaktif iyi başına 5 μl dağıtmak.
Dikkat: böylece biterse önce doldurulan yakından transfection reaktif düzeyini izlemeniz. Tamamlanması olan tabak daha fazla transfection reaktif çözüm eklemek için bir işaret kümesi ayrı sağlamalıdır. - Plakayı vasıl 1026 x g için oda sıcaklığında 1 dk santrifüj kapasitesi. (Örneğin 2 tabak kova başına) çatlama önlemek için bir seferde daha az plakaları santrifüj kapasitesi için gerekli olabilir bu yüzden bu sefer, kapakları olacak. Oda sıcaklığında plakalar kullanılan transfection reaktif için reçete kez kuluçkaya (örneğin 10-20 dk).
- Kuluçka sırasında transfection reaktif çözüm tüp boş ve PBS içeren tam 50 mL konik tüp yerleştirin. PBS astar tarafından yaklaşık 25 mL ile boru ve boşaltma durulayın.
- İpuçları daha fazla transfection reaktif dağıtımı için kullanıldı daha hücreleri dağıtımı için kullanılmak üzere kullanacaksanız, kullanılmayan boru re-attach ve PBS ile tüp durulama önce tüm boru % 70 etanol ile yeniden sterilize (2.1.2.2 bakın).
- Hazırlanmış olup bir kez hücre süspansiyon içeren şişe karıştırın. Tüp hücre süspansiyon yerleştirin ve her ucu düzgün dağıtımı görecek kadar Başbakan. Hücre süspansiyon kuyu başına 30 μL tüm plakaları dağıtmak. Gerekirse, hücre süspansiyon yerleşme önlemek için düzenli aralıklarla karıştırın.
Dikkat: Bazen ipuçları taraf için ortamı içeren süspansiyon damlacıkları yapışabilir. Bu görülmektedir, en kısa zamanda Aspire edin veya % 70 etanol ıslatılmış hav bırakmayan dokusu silin. - Hücre süspansiyon boru boş. Boru yaklaşık 25 mL distile su yaklaşık 50 mL tarafından izlenen PBS ile yıkayın.
- Tabakları da kuluçka için dönmeden önce oda sıcaklığında tohum hücrenin andan itibaren 45-60 dakika için oturup plakaları izin. Plakayı gen susturmak (örneğin 48 h) istenen uzunluğu için kesintisiz bir kuluçka kuluçkaya (bkz. 1.1.4.5).
- Kişi aşağıdaki görevleri tamamlamanız B var.
- Enfeksiyon
- Zaman, hücreleri bulaşmasını önce gün kazanmak için plakaların bulaşmamış kuyuları için medya da dahil olmak üzere her toplu iş iş bulaştırmak için gerekli ortam kesin miktarı damlalıklı içine steril şişe (örneğin 2 x 350 mL ve 33 plakaları için 2 x 50 mL). Ayrıca, Sıvı Sabunluk hassasiyet ve doğruluk için test ve gerekirse yeniden kalibre.
- Medya 37 ° C'de sıcak İki şişe ile % 70 etanol, PBS ile iki 50 mL konik tüp ve distile su ile doldurun. Santrifüj oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
- Boru % 70 etanol ile sterilize ve yukarıda açıklanan (bkz: 2.1.2.2 ve 2.2.2.1) PBS ile durulayın. Tüp etanol içinde oturuyor iken, damlalıklı virüs daha önce ortamı içeren şişe içine gerekli hassas cilt enfeksiyonu için hazırlanan (2.3.1 bakın). PBS ile boru 25 mL ile macun ve sonra boşalma durulayın.
- Tabakları da kuluçka kaldır ve TC kapağın koyun. Boru ile kitle iletişim araçları Başbakan. Medya 40 μL bulaşmamış denetim kuyu dağıtmak. Medya boru boş ve 25 mL PBS ile durulayın. (2.2.2.5 için dikkatli bakın)
- Virüs karıştırma sonra tüp virüs içeren şişe içine yerleştirin. Şunun 40 μl plakalar arasında dağıtmak. Plakalar için 400 x g oda sıcaklığında de 30 dk santrifüj kapasitesi. Tabakları da kuluçka için dönmek. Daha önce belirlenen süre boyunca (örneğin 24 h) plakalar kuluçkaya (1.2.4 bakın).
- Sabitleme ve hücreleri boyama
- Zaman, tamir, önceki gün kazanmak için bir şişe sabitleme ve formaldehit ve PBS (örneğin 179 mL % 37 formaldehit ve PBS 270 mL % 4 formaldehit son konsantrasyonu için) levhalar her toplu işlem için içeren çözüm boyama hazırlamak, ancak kullanmazsanız Höchst leke. Işıktan uzak kabine yanıcı saklayın.
- % 70 etanol ve PBS ile boru yukarıda açıklanan (2.1.2.2 ve 2.2.2.1 bakınız) olarak yıkayın. Höchst gerekli birim ekleme (e.g. bir 5 mg/mL Höchst 7.5 μg/mL iyi son bir konsantrasyon için 2.5 mL) tespit ve çözüm ve mix boyama için.
- Tespit ve çözüm tüm plakaları boyama 30 μL dağıtmak. 30 dk için kuluçka tabak koyun. Aşağıdaki kuluçka, plakalar için mühürler uygulamak ve plakaları ışıktan korunan 4 ° C'de depolayın. Gerekirse tabakları yıkamak (1.1.6 bakın).
- Görüntüleme ve görüntü analizi
- Tabakları bir otomatik, yüksek-içerik mikroskopla görüntü. Önceden belirlenmiş ayarları kullanmak, ama ilk test ayarları herhangi bir ayar yapılması gerekir emin olmak için.
- GFP (veya floresan diğer muhabir) ölçmek ve de daha önce gelişmiş komut dosyası kullanarak başına Höchst alan (1.3.2 bakın). Bir avuç plakaları ilk hafif değişiklikler tüm tabakları analiz toplu önce yapılması gerekip gerekmediğini belirlemek için komut dosyasını çalıştırmayı sınayabilirsiniz.
- Sayısı tanımlayın. Not: Sağlam Z-skor/MAD (ortalama mutlak sapma) yöntemi bu son zamanlarında sık sık kullanılan bir yöntemdir. Genellikle, puanları > 2 veya < -2 kesintileri ayarlanır. SiRNA örnekleri rasgele dağıtılan plakalar arasında ve örnekleri fiili olumsuz denetimleri kullanılan olarak örneğin, işlev tarafından gruplandırılmış değil, bu yöntem en iyi şekilde kullanılır. Bunlar özel olarak sigara (daha fazla bilgi sitotoksik sayısı filtre uygulama için konuya bakın) yayılan virüs azaltmak için beklenir gibi sitotoksik çift filtre.
3. ikincil ekran doğrulama itibaren bulunmuş TRC (RNAi konsorsiyum) shRNA kütüphane ile
Not: Tartışma ikincil doğrulama ve olası teknolojileri eleme için hits seçme hakkında bilgi için bkz:. SiRNA teknoloji için ikincil doğrulaması seçilirse, aynı tahlil geliştirme ve doğrulama protokolü birincil ekran için kullanılan gibi kullanılabilir (bkz: 1).
- Faiz aday genler gliserol hisse senetleri olarak hedefleyen özel bir TRC shRNA Kütüphane elde edilir.
- Transfection kalite plazmid DNA gliserol stokları hazırlayın. Not: Ayrıntılı bir protokol (örneğin "ShRNA/sgRNA/ORF gliserol ve plazmid DNA hazırlama") burada bulunabilir: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
- Genler DNA Plasmid'ler ile ilgi hedefleme shRNA ifade lentiviruses üretmek. Not: 96-şey plakaları lentivirus üretimi için detaylı bir protokol [Yani "shRNA/sgRNA/ORF yüksek üretilen iş Viral üretim (96 iyi)"] burada bulunabilir: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
- Lentiviruses hücrelerle bulaştırmak. Not: 96-şey tabak (Yani "Lentiviral enfeksiyon") lentiviral enfeksiyonu için detaylı bir protokol online http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral kullanılabilir % 20infection%20200909.pdf.
- Aşağıdaki her iki puromisindir seçim hücreleri oncolytic virüs ile enfekte (3,4 seçimi iletişim kuralı bkz:) başarıyla transduced hücreleri veya hemen aşağıdaki iletim (olmadan puromisindir seçimi). En uygun miktarda virüs ve virüs ile kuluçka uzunluğunu belirlemek için birincil ekran için kullanılan aynı yöntemi kullanın.
4. Tersiyer doğrulama
Not: Üçüncül doğrulama amacı öncelikle hit hedefte, belirli, tümör olduğunu ve etkinliğini artırır emin olmaktır içinde vivo. Tümör hücre hatları bir spektrum üzerinde yayılan gelen bir de test edebilirsiniz
-
Bu devirme aday gen üzerinde hedef onayıdır
- İlk fenotip ve gen susturmak arasında bir ilişki olduğunu doğrulayın. Belgili tanımlık perde için geliştirilen aynı tahlil kullanın veya geliştirme veya daha büyük bir biçimde yayılmış inhibisyonu değerlendirmek bir 6-şey biçimi için değiştirebilirsiniz. Gene(s) ilgi artı ve eksi virüs hedefleme siRNA ile transfected hücreleri ile zaman ders kuralları.
- Virüs bulaşan hücreleri içeren wells görüntü ve düzenli zaman aralıklarında bulaşmamış kuyulardan hücre lysates toplamak. Gen susturmak ve geliştirme veya inhibisyon yayılan arasında bir ilişki olup olmadığını belirleyebilirsiniz. Nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve/veya Western Blot tarafından gen susturmak değerlendirmek.
- Hit hedef olarak onaylamak için bir genetik kurtarma deneme gerçekleştirin. Not: tipik kurtarma deneyde, aday gen çaldı RNAi ile aynı zamanda hücreleri geçici RNAi dayanıklı cDNA (örneğin genin ortholog) ile transfected iken aşağı belirlemek için aday gen ifade olup olmadığını fenotip genin geri veya "kurtardı." RNAi dayanıklı cDNA aday gen ilgi overexpressing istikrarlı hücre hatları da istihdam edilebilir.
- Alternatif olarak, birden çok dik deneyleri hit hedef üzerinde olduğunu doğrulamak için bir genetik kurtarma deney yerine kullanın [örneğin belirlemek aynı fenotip nakavt nakavt üzerine birden fazla çift ile hedef gen üzerine elde shRNA karşı hedef gen ve CRISPR (Clustered düzenli olarak interspaced kısa palindromik tekrar) ile nakavt üzerine ifade birden çok istikrarlı hücre hatlarında hedef gen-Cas9 teknoloji birden çok hücre hatlarında.].
-
Hit tümör özeldir ve gelen onay tümör hücre hatları aralığında yayılır
- 4.1.1, olduğu gibi ama normal hücrelerin yanı sıra diğer tümör hücre hatları ile benzer bir tahlil yapmak.
-
Manipülasyon aday gen etkinliğini vivo içinde geliştirir onay
Not: aşağıda açıklanan gen değiştirmek için üç yöntemden vivo içindehedef vardır.- Gen hedef işlemek için bir ilaç bulmak. Bir ilaç gibi aynı gen hedefleyen bir küçük molekül inhibitörü verirseniz ile oncolytic virüs içinde vivoyönetmek. İlaç yönetmek için en uygun zamanlama belirlemek önemlidir.
- Mühendis inhibe veya olup olmadığını bir gen hedef bağlı olarak overexpress için virüs inhibe veya gen hedef geliştirmek istemektedir. Gen etkisizleştirmek için bir baskın negatif gen veya gen hedefleme hızlı shRNA için ifade etmek için oncolytic virüs mühendislik. Gen hedef ifade geliştirmek için gen overexpressing bir transgene ile oncolytic virüs klon.
- Mühendis hücre hatları ile gen çaldı aşağı ya da çaldı-out shRNA veya CRISPR-Cas9 teknoloji, sırasıyla kullanarak. Mühendislik hücre ve vahşi-türü hücre satır içinde vivo implant ve daha sonra oncolytic virüs ile enfekte. Not: Bu yöntem bir kanıtı-of-ilke olarak hizmet vermektedir ve ek zaman ve kaynak gen vivo içindeÖrneğin, işlemek için bir ilaç geliştirmek için yatırım faydalı olacaktır olup olmadığını belirlemenize yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için ana hedefleri tanımlamak için iş akışı genel bakış şekil 1' de sunulmuştur.
Şekil 1' de gösterildiği gibi bir yüksek-den geçerek RNAi ekran yürütülmesi için kritik ilk adım tahlil gelişmedir. Şekil 2A transfection en iyi duruma getirme tahlil için bir örnek plaka düzeni sağlar. Şekil 2B beklenen sonuçları temsilcisi görüntülerini oluşur ve şekil 2C beklenen sonuçlar temsilcisi bir komplodur. SiRNA nakavt PLK-1, hücre ölümüne neden olmaktadır ve siRNA devirme verimlilik, izlemeye pozitif kontrol kullanılan bir gen bir 0-30 arasında olmak hücre survival beklenebilir %, sürece hücre uzun bir zaman bu durumda iki katına o l-ecek almak onger hücre ölüm fenotip gözlemlemek için. Hedefleme-siRNA Ayrıca en az hücrelere benzer bir göreli hayatta kalması için bu tedavi edilmezse hücre ile toksik olmalıdır.
Başka bir temel unsur tahlil geliştirme, hangi hücreleri ve enfeksiyon süreyi bulaştırmak MOI belirlemektir. Şekil 3A virüs miktarı ve virüs ile kuluçka uzunluğunu belirlemek için bir örnek plaka düzeni sağlar. Şekil 3B canlı zaman ders vvDD-eGFP (Gelişmiş GFP silinmiş timidin kinaz ile vaksinia büyüme faktörü gen ile ifade oncolytic vaksinia virüs) ile enfekte 786-O hücre sonuçlarını çeşitli MOIs gösteriyor. VvDD-eGFP adlı bir MOI 0,05 ile enfekte hücreleri temsilcisi görüntülerini şekil 3 ciçinde gösterilir. Bu zaman noktası doğrusal bir aralığı ve tahmini Z-faktör bu ti, içinde olarak bu artar ve azalır formada tespiti için sağlayacak şekil 3B' çizilen sonuçlara dayanarak, bir bir MOI 0,05 ve enfeksiyon 21 h uzunluğu seçebilirsiniz Bana-0,6 artırmak tabur ve yayılmasını azaltmak tabur noktasıdır. Bu tahlil doğrulanıyor bir parçası olarak, bu MOI ve süresi-noktası hücreleri tamir ve Z-faktör hesaplamak ister.
Açıklanan Protokolü biz genom çapında RNAi ekranlar üç farklı tümör hücre hatları üzerinden (örneğin OVCAR-8, U373, ncı-H226) içinde yinelenen 18,120 genler15hedefleme bir siRNA kütüphane ile yapılan. DELİ yöntemini kullanarak, 1008 sayısı en az 2 3 kanser hücre hatları (şekil 4A) dışında ortak teşhis etti. Ekranları tespit sayısı yolu analizini zenginleştirme ERAD (endoplazmik retikulum ilişkili protein yıkımı) yolları (şekil 4A) ve UPR (gelişeceğini protein yanıt) üyelerinin saptandı. Biz 10 hits içinde bu yollar bu birincil ekranın (şekil 4B) farklı hedefleme serileri ile siRNA kullanarak ikincil doğrulama için seçildi. Tersiyer doğrulama bir parçası olarak, biz bir genetik kurtarma IRE1α ve ATF6α ile deney (bu hits hedef (şekil 4 c) olduğunu onaylamak için aktive transkripsiyon faktörü 6 alfa).
Şekil 1: oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için ana hedefleri tanımlamak için iş akışının şematik. Geliştirmek ve bir tahlil transfection koşulları ile virüs (Yani bana) hücreleri bulaştırmak için en uygun miktarını belirleme hücrelere, siRNA tanıtmak için en iyi duruma getirme içerir yüksek üretilen iş RNAi tarama için doğrulamak için ilk adımdır ve Kuluçka ile virüs uzunluğu. İkinci adım yüksek üretilen iş genom geniş perde yapmaktır. Genler arasında tüm genom hedefleme bir siRNA Kütüphane microtiter Tabaklarda serilir. O zaman ters siRNA kütüphane ile transfected hücrelerdir. Gen susturmak için izin vermek için bir 48-72 h kuluçka dönemi, hücreleri ile en iyi miktar-in virüs bulaştı. Kuluçka virüs ile optimum uzunluğu sonra hücreleri sabit lekeli ve daha sonra yüksek içerikli mikroskopla görüntüsü. Sonraki görüntü ve veri analizi "sayısı" adlandırılan virüs çoğaltma, önemli ölçüde modüle genlerin tanımlamak için yardımcı olacaktır İkincil validation perde seçme sayısı genellikle farklı tohum bölgeleriyle siRNA veya shRNA kullanarak birincil ekrandan gerçekleştirilir. Tersiyer doğrulama denemeleri sayısı üzerinde-hedef, tümör belirli ve etkinliği vivo içindegeliştirmek olduğunu onaylamak için gerçekleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: transfection duruma getirilmesi yüksek üretilen iş RNAi tarama tahlil için koşullar. (A) iki farklı hücre hatları ile transfection koşulları optimize etmek için bir örnek plaka düzen. Höchst 72 s kuluçka transfection reaktif seyreltici yalnız (tedavi edilmezseYani ), transfection reaktif ve seyreltici (Yani sahte ile takip 33342 ile temsilcisi görüntüleri 786-O hücre (1500 hücreler/de) (B) lekeli , hedefleme-siRNA ve siRNA PLK-1 hedefleme ile transfected). (C) temsilcisi transfection en iyi duruma getirme deney PLK-1 siRNA ile transfected hücre sağkalım % 22 gösterilen sonuçları (n = 24) ve hücre sağkalım % 94'ü hedefleme-siRNA ile transfected (n = 8). Hata çubukları ± SD, standart sapma; = ölçek Bar = 200 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: uzunluk, kuluçka ile yüksek-den geçerek RNAi tarama tahlil için virüs ve virüs miktarı tayini. (A) uzunluğu, kuluçka ile virüs ve virüs miktarı optimize etmek için bir örnek plaka düzeni. Sütun 1 ve transfection içeren 24 denetimleri ve are sol bulaşmamış. Sütun 2-23 tedavi edilmezse hücreleri, sahte transfected hücreleri ve pozitif ve negatif virüs denetimleri tüm Hayır virüs içinde sütunlar 2 ve 3 ile başlayan MOIs bir aralığı ile enfekte olan transfected hücreler içerir. (B) 786-O hücreleri hedefleme-siRNA ile transfected ve için 48 saat inkübe ters. Onlar daha sonra vvDD-GFP belirtilen ve 5 saat sonrası enfeksiyon (HPI) başlayarak 8 h aralıklarla görüntüsü MOIs, ile bulaşmış. İyi (± SD) başına ortalama GFP alan her zaman noktası hesaplanmıştır (n = 12) ve grafiğin üzerine çizilmiş. Z-A ve B noktaları hesaplanan 0,6 etkendir ve Z-B ve C noktaları arasında hesaplanan 0,6 faktördür. (C) 0,05 bir MOI ile zaman noktalarda enfekte bir kuyu temsilcisi canlı görüntüleri belirtti. Büyütme, 10 x; 9 alanları/iyi; ölçek Bar = 200 mikron. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: genom geniş perde Rhabdovirus-aracılı Oncolysis güçlü bir derhal ER stres yanıt abluka tanımlar. (A) Venn Şeması yüksek üretilen iş RNAi örtüşen isabet sayısını özetleyen ekranlar 3 tümör hücre satırları ve bir tablo (+ sentetik öldürücü;-, etkileşimi) ve şematik diyagramı (hits içinde Seviyelendirilmiş kırmızı) gösteren UPR ve ERAD içinde anahtar sayısı yollar. (B) EC50 vardiya (siyah çubuklar, y ekseni yaptı) UPR/ERAD sayısı ekrandan bir dizi hedefleme siRNA (72 h) ile tedavi aşağıdaki Maraba virüs (48 saat) ile tedavi U373 hücreler için belirlenmiştir. Her gen siRNA nakavt (72 h) takip için göreli mRNA ifade beyaz (doğru y ekseni) tasvir edilmiştir. (C) 48 h Maraba virüs enfeksiyonu sonra hücre canlılığı deneyleri yapılmıştır, U373 içinde ectopically ifade hücreleri ATF6α (veya denetimi GFP) fare insan ATF6α hedefleme ± siRNA (veya [NT] hedefleme denetim; sol panelde) veya insan XBP1(s) (veya denetimi ) insan IRE1α hedefleme ± siRNA (veya kontrol; sağ paneli). Batı lekesi gen susturmak ve Ektopik gen ekspresyonu gösteren gösterilir. EC50 vardiya virüs hücreleri; % 50'si öldürmek için gerekli doz vardiyada = Hata çubukları ±SD; = XBP1(s) X-box bağlayıcı protein (spliced); 1 = (B), tek yönlü ANOVAs gerçekleştirilen çoklu karşılaştırma'nın öğleden hoc testi p değerleri; türetmek için Bonferroni tarafından takip (C), p değerlerini türetmek için öğrencinin t-testleri yapıldı; * p < 0,05; #p < 0.05. (Bu rakam Mahoney ve arkdeğiştirildi., 201115). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada yüksek üretilen iş RNAi tarama oncolytic virüs tedavisi geliştirmek için manipüle edilebilir ana hedefleri tanımlamak için istihdam için bir iletişim kuralı mevcut. Bu başarıyla oncolytic Maraba virüs ve oncolytic vaksinia virüs ile test edilmiştir ama belirtildiği gibi bu diğer oncolytic virüsler veya diğer virüsler ile kullanmak için genellikle virüs çoğaltma modüle ana bilgisayar genlerin tanımlamak için adapte edilebilir. Tarama protokolü de yayılmasını azaltabilir veya artırabilirsiniz genlerin tanımlamak için tasarlanmıştır, ancak diğer veriler için kolayca değiştirilebilir. Maraba virüs, örneğin, bizim ekranlarla hücre canlılığı puanı için bir resazurin tabanlı basit hayati boya tahlil kullanan oncolysis oransal genlerin tanımlamak için tasarlanmıştır (bkz. şekil 4)15. Bu ekranlar ile virüs, kuluçka takip, hücreleri formaldehit ve Höchst ile boyama sabitleme yerine, biz resazurin boya her kuyuya (son 20 μg/mL konsantrasyonu) reçete ve 6 h kuluçka sonra biz ölçülen Absorbans (573 nm) ile bir plaka okuyucu. Biz de bir okuma Höchst boyama dayanan cep numarası kullanılmış olabilir. Virüs çoğaltma izlemek için bir vekil muhabir kullanarak bu ekranda gereksiz iken, bir virüs gibi bir örneğin, virüs çoğaltma izleyebilirsiniz floresan bir protein ekran optimizasyonu kolaylaştırmak belirli bir muhabir protein ile canlı; Ayrıca, daha az için viral antijenler leke antikorları kullanarak daha pahalı ve hantal bir muhabir protein ile bir virüs olduğunu ancak ekran olmadan mümkün. Buna ek olarak, bir daha da değişiklikler infektivite, veri bloğu boyutu ve immünolojik hücre ölümü gibi daha ayrıntılı alt fenotipleri etkileyen ana faktörler araştırmak için tahlil yapabiliriz. Her durumda, bir strateji ve ikincil ve üçüncül doğrulama yöntemleri eleme benzer bir tahlil geliştirme protokolü takip ederim.
İletişim kuralında, biz transfection koşullar ideal olarak birden fazla tümör hücre hatları ile en iyi duruma getirme öneririz. Birden çok hücre hatları ile en iyi duruma getirme için en az iki nedeni vardır. Her hücre kültürünü gibi bazı transfect zor olabilir veya de uygun değil, ama bir anahtar neden hücre içsel önyargı önlemek için birden çok hücre hatları ile tarama sağlamaktır yüksek üretilen iş tarama için mükellef bir nedenidir. Seçtiğiniz hücre hatları bir kişinin hedefler üzerinde büyük ölçüde bağlıdır. Bir belirli kanser türüne odaklanmak veya daha geniş bir spektrum karşılamak için farklı kanser türleri seçmek tercih edebilir. Alternatif olarak, bir tümör hücre hatları oncolytic virüs enfeksiyonu için daha az dayanıklı hale getirmek için manipüle edilebilir ana faktörleri tanımlamak için dayanıklı tümör hücre satırlarını odaklanmak isteyebilirsiniz.
Hücre hatları seçimi ek olarak, pozitif ve negatif virüs denetimleri seçim her ekran için önemli bir noktadır. Bazı durumlarda, için gerekli olan veya çoğaltma engelleyen virüs genleri bilinmiyor veya onlar biliniyorsa, hücre özgü olabilir. Sonuç olarak, kimse hala yaklaşık sağlamlık ve testin dinamik alan vekil denetimlerini kullanarak belirleyebilirsiniz. Örneğin, bir virüs bulaşmamış hücreleri veya nakavt üzerine yayılmış azaltmak genlerin tanımlamak için bir vekil pozitif kontrol olarak düşük MOI ile enfekte hücreleri kullanabilirsiniz. Nakavt üzerine yayılmış artıran genlerin tanımlamak için bir virüs seyreltme dizi içeren hücreleri enfekte ve kuyu ile yüksek sinyal bir vekil olumlu denetim olarak kullanın.
İkinci ekran doğrulama için hits yelpazesi ve teknoloji istihdam türü gerektirir dikkatli müzakere başka bir konu var. Adaylar genellikle üzerinde olup olmadığı önemli ölçüde yayılmış birden fazla kanser hücre hatlarında modüle (birincil ekranlar birden çok hücre hatlarında yapılmıştır varsa) vurmak, büyüklüğü dayalı ikincil ekran doğrulama için seçilen ve biyolojik faiz. DAVID22,23, panter24, dize25 ve PINdb26 gibi Biyoinformatik araçlarını yolları ve sayısı biyolojik ilgi izole etmek için yardımcı olabilir. Mercer vd. 8 açık kaynak görüntü analiz yazılımı kullanımını açıklar ve ayrıca onlar görselleştirme ve sayısı analizi için gelişmiş bir algoritma mevcut yaptık. Sonuçları yorumlama gen susturmak olduğunda dikkate almak için bir faktör sahne bağlı olarak farklı etkileri araştırılmaktadır virüs yaşam döngüsü içinde olabilir. Örneğin, olası nakavt daha sonraki bir aşamada çoğaltması artabilir iken bu nakavt yaşam döngüsü içinde erken bir genin virüs çoğaltma, inhibe. Çoğu zaman, ikincil ekranları siRNA gen başına birden fazla çift ile farklı tohum bölgeleriyle farklı bir satıcıdan gelen ile yapılmaktadır. Ancak, birbirlerini tamamlayıcı teknolojiler aday genler hedefleme shRNA ifade CRISPR Cas9 veya lentivirus vektörler gibi istihdam edilebilir.
Analiz yöntemi de kritik bir noktadır. Biz burada sağlam Z-score kullanmanızı öneririz veya kızgın20,27 ile önerilen kesintileri için isabet çağrı > 2 veya < -2. Kesintileri artırılması veya azaltılması odak daha yanlış pozitif ortadan kaldırarak veya daha yanlış negatifleri yakalama olmasına bağlı olarak. Örneğin, vaksinia virüs9ile son bir yüksek üretilen iş ekran içinde-1.5 (nakavt üzerine yayılmış azalmıştır genlerin belirlenmesi üzerinde odak olduğu gibi üst Hayır kesintileri tarif edildi), daha düşük kesme ayarlandı. Ayrıca z-score, SSMD (kesinlikle standart ortalama fark) ve B skor20,28,29,30da dahil olmak üzere istihdam edilecek diğer yöntemleri vardır. Barrows vd.31 vurmak toplamı sırası, MAD, z-score ve SSMD tarafından oluşturulan liste karşılaştırıldığında ve her yöntemi analiz farklı hit listelerinde sonuçlandı bulundu. Toto, hiçbir mükemmel yöntem veya kesme olduğunu. Sonuçta, ikinci ekran doğrulama ve Tersiyer doğrulama çalışmaları gerçek sayısı onaylayacaktır.
Sitotoksik sayısı filtreleme yöntemi de dikkate alınmalıdır. Birincil ekranlar paralel artı veya eksi virüs yapmak için bir yoludur. Bu onların kendi sitotoksik çift tespiti izin verir. Bu yaklaşımımız bizim Maraba virüs ekranlar15vardı; Ancak, bu kez pratik değildir. Belki de daha pratik bir yöntem sağlam, olmanın yanı sıra, ikincil bir parçası ekran doğrulama, özellikle kişinin odak sayısı tanımlamak için ise düşüş çoğaltmanın nakavt üzerine bu sitotoksik sayısı tespit etmektir. Örneğin, içinde tüm genom birincil perde ile Miksoma virüs, Teferi ve ark. 11 virüs çoğaltma nakavt üzerine azalmıştır 1,588 çift teşhis etti. Sitotoksik çift filtre uygulamak için onlar bir ikincil sitotoksisite ekran bu çift ile yapılan; Onlar hücre canlılığı 72 h sonrası transfection resazurin tabanlı hücre canlılığı tahlil kullanılarak ölçüldü. Sitotoksik çift ≤-1.96, Z-score üzerinde dayalı tespit edilmiştir. Sadece sitotoksik çift Sivan vd gibi bir azaltma > 50 oranında belirli bir yüzdesini tarafından Örneğin, cep numarası bir azaltılmasına dayanan birincil tarama verileri filtrelemek için başka bir yaklaşımdır 9, veya belirli bir puan Lee ve ark. olduğu gibi temel 14; vesicular Stomatit virüs çoğaltma için gerekli ana faktörler onların çalışmada, onlar hücre canlılığı > 3.0 standart sapmalar tarafından ortalamasından düşük siRNA sayısı hariç. Hücrelerin ortalama sayısı Höchst hücre çekirdekleri boyama üzerinde dayalı tespit edildi ve ortalama GFP sinyal bir plaka başına temelinde hesaplanmıştır açık olduğu gibi açıkça belirtti rağmen ortalama görünüşte bir tabak başı olarak hesaplanır.
Yanlış pozitif ve negatif sonucu olarak tahlil tasarım, kullanılan teknoloji veya sistematik hatalar ile gelebilir, sık sık yüksek sayıda herhangi bir yüksek-den geçerek RNAi ekran bir kısıtlamasıdır. Örneğin, bir protein virüsü çoğaltma önemli ölçüde etkileyebilir, ancak gen susturmak için seçilen zaman protein's half-life etkisi tahlil tasarım sayesinde yanlış negatif önde gelen algılamak için verilen çok kısa olabilir. De eksik nakavt ve siRNA teknoloji hedef kapalı etkileri de yanlış pozitif ve negatif tanıtabilirsiniz bu kuruldu. Kenar efekti32gibi sistematik hatalara yanıltıcı sonuçlar neden olabilir. Burada sinyal plaka dış Wells sistematik olarak daha yüksek veya düşük buharlaşma nedeniyle plaka kalanından daha olabilir. Biraz-in bunlar sorunları dahil olmak üzere, örneğin adres için strateji vardır: siRNA hedef kapalı etkileri33azaltmak konsantrasyonu azaltarak, dış kuyu kenar efekti azaltmak için medya ile doldurmak için plaka düzenleri yeniden yapılandırma veya istihdam algılamak ve kenar efekti32,34,35gibi sistematik hatalar counter için geliştirdiği hesaplama yöntemleri. Yanlış pozitif ile başa çıkmak için genel bir yöntem ikinci bir ekran birincil ekran aşağıdaki yapmaktır. Yanlış negatifleri ile ilgili bir yolu, bir kesme isabet Aradığınız için dinlenmek ve ikincil tarama için potansiyel yanlış negatif içerir. Bu, tabii ki, de kesme çoğu yanlış negatifleri yakalayacaktır değil. Birincil ekranlar da yinelenen ya da sahte sonuçlarını sınırlandırmak için nüsha yapılmalıdır. Sonuçta, hangi stratejileri istihdam edilmektedir, olursa olsun hiçbir yüksek üretilen iş ekran etraflıca tüm gerçek sayısı tespit edecek ancak bir hazine hangi üzerine büyük harfle bazı değerli sayısı benim büyük olasılıkla biri veri sağlayabilir.
Havuza alınan shRNA ve CRISPR-Cas9 kütüphaneleri kullanımı başka bir alternatif olmasına rağmen bu protokol için biz dizilmiş siRNA ve shRNA teknoloji, kullanımı açıklanmıştır. Havuza alınan shRNA Kütüphane içinde Workenhe ve ark. istihdam edildi giriş bölümünde özetlenen 12 çalışma. Havuza alınan CRISPR-Cas9 teknoloji Zika virüs36, Batı Nil virüsü37,38, dang virüs39 ve hepatit gibi virüslerin çoğaltma için gerekli ana faktörleri tanımlamak için genom ölçekli ekranlar yapmak için kullanılan C virüs39. Havuza alınan kitaplıkları kullanmanın avantajı onlar daha ucuz olmasıdır satın almak için özel altyapısı (örneğin sıvı işleme cihazları, yüksek-içerik mikroskoplar ve robotik ekipman) gerektirmez, ne işletim yüksek maliyetler var mı ve bu altyapının bakımını yapma ve daha az sarf malzemeleri ihtiyaç duydukları. Dezavantajı dökümanları türleri daha sınırlı olmasıdır. Havuza alınan en yokluksa tüm Kütüphane ana bilgisayar virüs etkileşim ekranları bugüne, okuma hücre canlılığı ya da yokluğundan olduğunu; bir kolayca için daha karmaşık fenotipleri sonda olamaz. Seçtiğiniz biçimde biyolojik soru soruluyor bağlıdır.
Genetik tarama teknolojisindeki gelişmeler bakteri ve mantar Şimdi bugünkü genom ölçekli filtrelerine insan hücrelerinde ilk etkin ekranları çeşitli çalışma alanlarında bulma için geniş kapı açmış son birkaç on yıl boyunca. Bu genetik ekranlar sadece bize temel Biyoloji soruları cevaplamak, ama bize anahtarları geliştirme ve geliştirmeye biotherapeutics kilidini anlayışlar için verilen izin yok. Olmakla birlikte hala öğrenilmesi gereken dersler ve bu teknoloji ile aşılması için zorluklar, sonuçlar bugüne heyecan verici olmuştur. Keşifler-ecek beğenmek var olmak kadar roman CRISPR-Cas9 kütüphaneler de dahil olmak üzere teknoloji eleme, havacilik ve teknolojileri eleme vivo içinde olgun devam daha büyük.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser tarafından hibe Ontario Enstitüsü'nden kanser araştırmaları, Kanada Vakfı için yenilik, Ottawa bölgesel kanser Vakfı ve Terry Fox Araştırma Enstitüsü için desteklenmiştir. K.J.A. Vanier Kanada yüksek lisans burs, Sağlık Araştırma-Master's Ödülü, Kanada Enstitüsü tarafından desteklenen ve bir Ontario yüksek lisans burs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
| Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
| Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
| Water | Sigma | W4502 | |
| siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
| AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
| siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
| HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
| Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
| DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
| Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
| 500 ml bottles | Corning | 430282 | |
| Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
| Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
| BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
| BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
| Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
| KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
| Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
| JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
| Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
| Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |
References
- Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
- Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
- Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
- Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
- Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
- Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
- Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
- Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
- Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
- Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).
- Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
- Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
- Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
- Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
- Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
- Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
- Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
- Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
- Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
- Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
- Luc, P. -V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
- Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
- Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
- Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
- Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
- Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
- Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
- Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
- Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
- Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
- Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
- Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).
