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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/56913
Automatic Translation
1,2, 1,4, 1, 1, 1,2,3
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Summary

Aqui descrevemos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para descobrir destinos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos, especificamente a terapia rhabodvirus e vaccinia vírus, mas pode ser facilmente adaptado para outros Oncolíticos plataformas de vírus ou para descobrir genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus em geral.

Abstract

Tecnologia de rastreio do elevado-throughput todo o genoma RNAi (RNA de interferência) foi amplamente utilizada para descobrir os fatores do hospedeiro que afetam a replicação do vírus. Aqui apresentamos a aplicação desta tecnologia para descobrir destinos de host que modulam especificamente a replicação do vírus de Marabá, um Rhabdovírus Oncolíticos e vírus vaccinia, com o objetivo de reforçar a terapia. Enquanto o protocolo foi testado para uso com Oncolíticos Marabá vírus e vírus do vaccinia Oncolíticos, esta abordagem é aplicável a outros vírus Oncolíticos e também pode ser utilizada para identificar alvos de anfitrião que modulam a replicação do vírus em células de mamíferos em geral. Este protocolo descreve o desenvolvimento e validação de um ensaio para a seleção de RNAi da elevado-produção em células de mamíferos, as considerações-chave e as etapas de preparação importantes para a realização de uma tela de RNAi alta produtividade primária e um guia passo a passo para realização de uma tela de RNAi alta produtividade primária; Além disso, ele amplamente descreve os métodos para a realização de estudos terciários de validação e validação de ecrã secundário. O benefício do elevado-throughput RNAi triagem é que permite que um de catalogar, de forma ampla e imparcial, fatores do hospedeiro que modulam a qualquer aspecto da replicação do vírus para o qual se pode desenvolver um ensaio em vitro como infectividade, estourou o tamanho, e citotoxicidade. Tem o poder para descobrir bioterapêutico metas imprevistas, com base no conhecimento atual.

Introduction

Rastreio com throughput alto todo o genoma RNAi tem provado para ser uma ferramenta inestimável para revelando insights biológicas em diversas áreas de estudo, incluindo biologia de vírus. Ao longo da última década ou assim, numerosos grupos comprometeram-se baseada em célula em grande escala RNAi triagem para extensivamente identificar genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus (revisado em1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). Curiosamente, um grande número dessas telas foram realizado em células cancerosas e diversas com vírus que são candidatos de vírus Oncolíticos atual incluindo vaccinia vírus8,9,10 , De vírus mixoma11, herpes simplex vírus12, estomatite vesicular vírus13,14e Marabá vírus15. Embora o foco da maioria desses estudos foi na identificação de fatores do hospedeiro que influenciam a algum aspecto da replicação do vírus e não na identificação de alvos bioterapêutico para reforçar a terapia de vírus Oncolíticos, dados valiosos poderiam ser extraídos esses conjuntos de dados em Neste contexto. É claro que o potencial poderoso para identificar alvos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos não foi totalmente explorado.

Uma infinidade de plataformas de vírus Oncolíticos... estão a ser testadas em estudos pré-clínicos e clínicos incluindo herpes simplex vírus, reovírus e vaccinia vírus, que têm tido sucesso demonstrável em experimentações clínicas do tarde-estágio. Para a maioria destas plataformas, esforços tem sido direcionados para alterar a genoma do vírus para melhorar a terapia. Por exemplo, para aumentar a especificidade do tumor, genes de vírus específicos foram excluídos ou uma mutação para restringir significativamente a replicação viral em células normais, mas não em células tumorais. Em alguns casos, transgenes foram adicionados como GM-CSF (fator estimulante de colônia de macrófagos granulócitos) para potencializar a resposta imune ou NIS (iodeto de sódio symporter) para permitir que vivo em imagem e absorção celular radioiodide para terapêutica fins. No entanto, tem havido muito pouco trabalho focado em genes do hospedeiro/tumor a manipular e explorar o impacto dos genes do hospedeiro/tumor na replicação de vírus Oncolíticos. Com o advento da tecnologia de rastreio com throughput alto, agora é possível sondar interações hospedeiro-vírus à escala do genoma e a decifrar as oportunidades para manipular o genoma do hospedeiro para melhorar a terapia de vírus Oncolíticos (revisado em16, 17,,18).

Nós relatamos o primeiro estudo demonstrando prova de conceito para a utilização da elevado-produção genética de rastreio para identificar alvos de anfitrião que podem ser manipulados para melhorar a terapia de vírus Oncolíticos. Para descobrir genes de anfitrião que modulam Marabá vírus oncolysis, um Rhabdovírus Oncolíticos atualmente está sendo testado em fase I e ensaios II, realizamos telas de RNAi todo o genoma em três linhas de células de tumor diferente em duplicado com um siRNA (RNA de interferência curto) biblioteca de direcionamento de genes 18.12015. Caminho análise de acertos identificados nas telas revelou enriquecimento de membros das vias resposta stress ER (retículo endoplasmático). Nós selecionamos 10 sucessos dentro destes caminhos para validação secundário usando siRNA com sequências alvos diferentes da tela principal. Como parte da validação do terciária, foi realizado um experimento de resgate com IRE1α (inositol-requerendo alfa de enzima 1) para confirmar que o hit foi no alvo. In vitro e em vivo testando usando um inibidor de pequena molécula de IRE1α resultaram em eficácia Oncolíticos dramaticamente melhorada.

Workenhe et al . 12 também conduziu a uma tela de RNAi genoma-larga usando um pool particulas de Lentivirus shRNA (curto grampo do RNA) biblioteca visando 16.056 genes para identificar fatores do hospedeiro restringindo o vírus humano herpes simplex tipo 1 (HSV-1) mutante mediada por KM100 oncolysis da mama. células cancerosas. Na tela principal, eles identificaram 343 genes o nocaute de que levam ao aprimorado citotoxidade de células infectadas KM100 sobre células infectadas por simulação; Eles selecionaram 24 destes genes para validação secundária. Fora os 24 genes, 8 genes foram confirmados na tela secundária com um deles sendo SRSF2 (arginina e serina-rich splicing factor 2), que foi posteriormente confirmada usando um experimento genético de resgate durante a validação terciária. O grupo passou a identificar um DNA topoisomerase inibidor de quimioterápicos que reduziu a fosforilação de SRSF2 e mostrou que o tratamento de combinação de HSV-1 KM100 com essa pista de inibidor de sobrevivência prolongada dos ratos de tumor-rolamento do TUBO.

Nos estudos acima mencionados, seguiu-se um fluxo de trabalho semelhante. Cada um começou com uma tela de RNAi genoma-largo principal seguida por uma tela secundária em um seleto número de sucessos identificados na tela principal. Este foi seguido por estudos de validação terciária, que incluía confirmando que o acerto no alvo realizando genética resgatar experimentos in vitro com final validação executada manipulando o alvo gene produto em vivo. Neste artigo, nós primeiro fornecer um protocolo geral para o desenvolvimento e validação de um ensaio de siRNA-rastreio de alto rendimento, que envolve determinar as condições ideais de transfeccao, quantidade de vírus e comprimento de infecção. Oferecemos também um protocolo detalhado para a realização de uma primária, uma tela de siRNA de alto rendimento, bem como uma descrição geral do método para executar validação de tela secundária e terciária validação.

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Protocol

1. desenvolvimento e validação de um siRNA elevado-throughput do ensaio de triagem

Nota: Para todos os experimentos, use tampão Hepes crescimento mídia adequada para cada linha de celular. Veja a Figura 1 para uma visão geral do fluxo de trabalho de otimização de ensaio para validação terciária.

  1. Determinação das condições ideais do transfection
    1. Selecione uma linha de células de tumor ou idealmente tumor Múltiplo células linhas com o qual deseja otimizar as condições de transfeccao (por exemplo, 786-O, NCI-H226, SF268, U373, OVCAR-8, U20S; ver discussão para mais informações sobre a seleção de linhagens celulares).
    2. Selecione um reagente de transfeccao ou vários para testar. Pode ser necessário testar vários reagentes de transfecção, como alguns podem ser mais tóxicos ou mais eficiente do que outro em uma linha de determinada célula. Além disso, mantenha em mente que alguns podem impactar na infecção pelo vírus ou podem gerar o sinal de fundo elevado em cima da imagem.
    3. Decidir sobre positivo [e. g. siRNA direcionamento do mRNA PLK-1(Polo Like Kinase 1), que induz a morte celular] e negativo de controles de transfeccao (por exemplo, não-direcionamento siRNA).
    4. Siga o protocolo do transfection inversa para o reagente de transfeccao particular, mas variar a quantidade de reagente de transfeccao (por exemplo, 0.05, 0.1, 0,15 e 0,2 μL/poço) e celular (por exemplo, 625, 1250, 2500 células/poço) densidades de semeadura. Incluem repetições das seguintes condições: não tratada células, simulado transfectadas células (ou seja, as células mais reagente de transfeccao) e células transfectadas com positivos e negativos do transfection controle siRNA (ver Figura 2A por um prato de amostra layout).
      1. Em geral, preparar diluições de nM 80 de cada siRNA para uma concentração final no poço de 10 nM (dependendo da biblioteca, uma maior concentração de siRNA pode ser necessária). A menos que especificado de outra forma, dilua o siRNA com o reagente de Transfeccao de diluente. Prepare diluições de reagente de transfeccao.
      2. Pipetar 5 μL de siRNA por alvéolo, seguido de 5 µ l de reagente de transfeccao diluídos. Para facilitar este passo, distribua ao longo de uma coluna de uma placa de fundo U 96, as misturas de siRNA e o diluente de siRNA sozinho (para células transfectadas não tratadas e simulação). Distribua ao longo de uma segunda coluna, o reagente de transfeccao diluídos e diluente de reagente de transfeccao sozinho (para células não tratadas).
        1. Usar uma pipeta eletrônica, pipetar 5 μL/poço do conteúdo da primeira coluna contendo siRNA ou diluente de siRNA para os correspondentes poços da placa 384-bem seguido por 5 μL/poço do reagente de transfeccao diluído ou reagente de transfeccao diluente do segunda coluna.
      3. Centrifugar as placas a 1026 x g por 1 min à temperatura ambiente e incubar durante o tempo prescrito para o reagente de transfeccao (por exemplo, 5-20 min).
      4. Enquanto as placas estão incubando, prepare suspensões celulares de diferentes densidades. Pipeta 30 μL da suspensão de células por poço. Antes de colocar as placas na incubadora, deixe as placas descansar por 45-60 min à temperatura ambiente para permitir o ajuste uniforme de células19.
        Nota: Se o período de incubação prescrito para o reagente de transfeccao com siRNA for curto, prepare as suspensões celulares antes da incubação.
      5. Incube durante 48 a 72 h, dependendo do comprimento desejado do knockdown escolhido para a tela.
    5. Prepare uma fixação e coloração de solução consiste em formaldeído, Hoechst 33342 e PBS (tampão fosfato salino) para uma concentração final em cada poço de formol 4% e 5 µ g/mL de Hoechst 33342. Conforme necessário, tente um mais elevado (por exemplo, 7,5 ug/mL) ou concentração mais baixa (por exemplo, 2 ug/mL) de Hoechst se o sinal é fraco ou forte demais, respectivamente.
    6. Dispense a 30 μL da solução de fixação e coloração diretamente em todos os poços. Incubar as placas durante 30 min a 37 ° C. Armazenar as placas a 4 ° C. Se usando um microscópio confocal-não, lave as placas com PBS usando uma máquina de lavar prato; na maioria dos casos, a lavagem é desnecessária quando usando um microscópio confocal.
    7. Desenvolva um script para quantificar o número de células por poço.
      Nota: Existem vários pacotes de software disponíveis para esta finalidade e, enquanto cada um pode ter diferentes formas de geração de scripts, que todos geralmente têm um meio de identificação de núcleos, células e regiões de interesse, bem como calcular intensidades e Propriedades morfológicas. Ao desenvolver um script de triagem, é importante considerar o tempo necessário para executar o script por placa e talvez incluir medições só essenciais para minimizar o tempo de processamento. Por exemplo, para quantificar o número de telemóvel, um pode calcular a área de Hoechst por bem acima uma intensidade especificada; e para quantificar a propagação de vírus, pode-se calcular área GFP (proteína verde fluorescente), por bem acima uma intensidade especificada. O script "pared para baixo" vai precisar ser comparado com o script mais elaborado para garantir que nenhuma informação essencial é perdida.
    8. Analisar os resultados para determinar as condições de transfeccao ideal, que é a quantidade de reagente de transfeccao e a célula semeadura densidade que resulta em morte celular significativa (0-30% sobrevivência da pilha) e é minimamente tóxico para as células (por exemplo, 90-100% sobrevivência da pilha). Nota: Pode levar mais tempo para observar o fenótipo de morte celular em linhagens celulares com tempo de duplicação vezes. Ver Figura 2B e 2C para resultados representativos. Além disso, que sejam as células transfectadas com siRNA direcionamento-aproximadamente 90-100% de confluencia aquando da fixação como mais tarde um vai querer infectar células que são desta confluência.
  2. Determinação do comprimento de infecção e a quantidade ideal de vírus
    1. Siga as mesmas etapas de transfeccao inversa, conforme descrito anteriormente (ver 1.1.4.1 para 1.1.4.4); no entanto, usar somente as condições ideais de transfeccao (ver 1.1.8) (por exemplo, para as células de 786-O: 1500 células/poço e 0,05 μL/poço de RNAiMAX) e, além disso, incluem poços extras para ser infectado com vírus [por exemplo, poços com células não tratadas, simulação células transfectadas, células transfectadas com direcionamento-siRNA e células transfectadas com controles positivo vírus se aqueles são conhecidos (ou seja, alvejando genes do hospedeiro que irão inibir ou aumentar a replicação de siRNA)].
      1. Ver Figura 3A para um layout de placa de amostra. Incube durante 48-72 h.
    2. Infectar os poços adicionais de vírus com um vírus Oncolíticos expressar uma proteína fluorescente repórter (por exemplo, GFP) com uma gama de multiplicidades de infecção (MOIs) (por exemplo: 0,001 a 10; O intervalo escolhido ser dependerá do nível de resistência ou susceptibilidade da linha celular.). Incluem poços não infectados também. Pipetar 40 µ l de cada diluição de vírus por alvéolo para um volume final de 80 μL. Centrifugar cada placa a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente.
    3. Seguir de infecção, a imagem que as células vivem com um alto teor, automatizado microscópio em intervalos regulares (por exemplo, cada 4-8 h). Ver Figura 3B e 3C.
    4. Desenvolver um script para quantificar a propagação de vírus (por exemplo, área GFP por alvéolo) (ver 1.1.7). Analisar as imagens e selecione um ponto de tempo e um MOI que permitem a detecção de aumentos e diminuições em propagação. Certifique-se o ponto do tempo e a queda MOI dentro de uma escala linear para facilitar a detecção de pequenas mudanças na propagação. Estimar o fator Z (ou Z') para o ponto de tempo determinado e MOI.
      Nota: Estima-se fator de Z = 1-3 (σp + σn) / | μ - μ depn|, onde σp é o desvio padrão de amostra dos controles positivo vírus e σn é o desvio padrão de amostra do vírus negativo controles; e μp é a média de amostra dos controles positivo vírus e μn a amostra média dos controles negativos. Um Z-fator estimado de 0.5 - 1.0 é considerado para ser um excelente ensaio e apropriado para triagem de20,21.
    5. Confirme que o vírus negativo controle siRNA não tem impacto sobre a replicação do vírus, comparando-o aos poços simulados transfectados e não tratados. Muitas vezes é necessário testar vários controles negativos como alguns negativo siRNA controles podem impactar na replicação do vírus.
  3. Validação final do ensaio do elevado-throughput screening
    1. Repita as etapas 1.2.1 e 1.2.2 acima, mas só este tempo infectar as células com o MOI ideal. Em vez de imagens ao vivo, corrigir e mancha a placa (conforme descrito em 1.1.5 e 1.1.6) no ideal-ponto do tempo (ver 1.2.4).
    2. A placa de imagem. Analisar os resultados usando o mesmo script que será usado para a tela (consulte 1.1.7 e 1.2.4). Confirme as condições de transfeccao (ou seja, bom nocaute em poços transfected com controle positivo do transfection e toxicidade mínima em poços transfectadas com controle de transfeccao negativo). Estimar o Z-fator para determinar a robustez do ensaio (ver 1.2.4).
  4. Novos testes e considerações para a realização de seleção da elevado-produção
    1. Teste a durabilidade das placas de microtitulação como algumas placas podem rachar durante a centrifugação, especialmente quando as tampas são mantidas e várias placas são centrifugadas imediatamente. Para reduzir rachaduras, centrifugar sem as tampas (desde que as placas têm selos), ou diminuir o número de placas centrifugadas por balde.
    2. Teste a estabilidade da mistura de reagente de transfeccao ao longo do tempo. Uma vez que o reagente de transfeccao é adicionado às placas, pode haver um atraso significativo antes da adição de células; Portanto, é importante saber o período de tempo para que a mistura de reagente de transfeccao permanecerá eficaz. Para a tela, pode ser necessário preparar as células antes de adicionar a mistura de reagente de Transfeccao para as placas.
    3. Prepare-se para usar o líquido dispensador. Determinar os volumes necessários para dispensar o reagente de transfeccao, células, vírus e fixar tendo em conta o volume que as preensões da tubulação, o volume perderam para pré-rotulagem (se a unidade tiver esse recurso) e o volume residual exigido nas garrafas usadas para de distribuição.
      1. Definir e testar os programas que serão usados para distribuir vírus, células e reagente de transfeccao. Para minimizar a perda de reagente de transfeccao, limite, se possível, o número de pre-dispensa. Estabelece um protocolo para calibrar o dispensador de líquidos e testar sua exatidão e precisão.
    4. Prepare-se para a distribuição em massa de vírus, células e reagente de transfeccao
      1. Primeiro, determine o número de pratos para serem processados em um lote, considerando o número de placas de células que viável podem ser trypsinized ao mesmo tempo, o número de placas de microtitulação que podem ser centrifugadas ao mesmo tempo, o período de tempo necessário para processar um lote de placas com o distribuidor de líquido e também o tempo necessário para a imagem latente. Nota: Geralmente, o processamento de aproximadamente 30 placas cada vez é bastante viável e 3 lotes de placas de processamento é controlável em um dia.
      2. Empiricamente, verifique se o volume de reagente de transfeccao necessário para processar um lote de placas. Teste que este volume é adequada por aplicadora 5 μL de água destilada várias vezes através de uma placa equivalente número de vezes que será necessário para processar um lote.
      3. Para garantir a distribuição uniforme de células, estime o tempo necessário para dispensar as células através de um lote de placas. Preparar um frasco contendo o volume de células necessárias para um lote e dispense as células em várias colunas de um prato de cada vez, em intervalos regulares ao longo do tempo que levará para dispensar em um lote de placas mesmo. Teste quantas vezes será necessário misturar as células para manter uma distribuição uniforme de células.
      4. Para garantir a distribuição uniforme do vírus, repita o mesmo procedimento acima (ver 1.4.4.3), mas desta vez a distribuição de vírus para poços confluentes. Se o vírus não é distribuído uniformemente, considere preparando o vírus nos tubos cónicos e num Vortex cada tubo antes da dispensação.
    5. Acompanhar o crescimento de células para determinar a linha do tempo para o cultivo de células suficientes para a tela. Além disso, determine o número médio de células que podem ser colhidas por placa de células crescendo na fase de registro, a fim de ser capaz de estimar o número exigido para a tela.
  5. Etapas de preparação final para a seleção da elevado-produção
    1. Até um mês antes do início do rastreio, determine todos os materiais necessários para a tela. Ordem qualquer reagentes necessários (ver materiais). Garantir a quantidade necessária de vírus está na mão (de preferência, use o mesmo material que foi usado durante a otimização.).
    2. A duas semanas antes do início do rastreio, descongelar e crescer as células necessárias para a tela. Garanta a disponibilidade do centrifugador e cubetas da centrífuga quadrados.
    3. Durante a semana antes do início do rastreio, preparar garrafas de mídia a transfeccao reverso e infecção, um estoque de etanol a 70%, 2 diluente de reagente de Transfeccao de X (por exemplo, 2 X Opti-MEM), se necessário (por exemplo, se a biblioteca de siRNA é diluída em RNase-free de água, um vai querer usar 2 X ao transfect células) e alíquotas de vírus (uma por lote de placas). Verifique a condição das células.
      1. Prepare uma solução stock de Hoechst 33342 mancha (por exemplo, 5 mg/mL). Prepare um prato de equilíbrio se um será necessário para centrifugação.
      2. Certifique-se de que máquina de lavar a placa está em bom estado de funcionamento se será usado. Certifique-se do que líquido dispensador é aplicadora e devidamente calibrado com precisão e precisamente. Certifique-se também, que os programas são definidos corretamente sobre o dispensador de líquidos.

2. realização de tela principal alto throughput

Nota: Antes de iniciar a tela de RNAi, placas de microtitulação (por exemplo, placas de 384-boas) precisam ser dispostos com a biblioteca de siRNA e controles de triagem. As etapas a seguir são melhor conduzidas por duas pessoas com uma pessoa (ou seja, A pessoa), sendo principalmente responsável para o fornecimento do reagente de transfeccao e células através das placas e a segunda pessoa (ou seja, pessoa B) sendo responsável pela centrifugação as placas imediatamente antes do transfection e para preparar as células. Incluído entre parênteses são alguns detalhes para o processamento de um lote de 33 placas (ou seja, metade da biblioteca) com a linha 786-O celular.

  1. Preparação para transfeccao reversa
    1. Pessoa r: Coloque a mídia, tripsina e PBS suficiente necessário para processar um lote de chapas em banho maria a 37 ° C. Opcional: Trypsinize um prato de células e contar o número de células por placa, a fim de fornecer uma estimativa em tempo real do número de placas necessárias por lote.
    2. Obter um lote de placas (por exemplo, 33 placas) do congelador e espere 20-30 min para permitir que as placas descongelar. Enquanto as placas são de degelo, continue com as etapas a seguir.
      1. Pessoa r: tubos de pipeta no Erlenmeyer de 50 mL a quantidade de diluente de reagente de transfeccao necessário para o processamento de um lote de placas (por exemplo, 2 x 37.125 mL) e colocá-los em banho maria a 37 ° C. Encha duas garrafas com etanol a 70% (por exemplo, garrafas de 250-500 mL). Preencha dois tubos cônicos de 50 mL com PBS e outro com água destilada.
      2. Pessoa r: Mergulhe o líquido dispensador de tubulação em um frasco de etanol a 70%. Se todas as pontas não serão usadas para distribuir o reagente de transfeccao (por exemplo, se os poços exteriores da placa não estão sendo usados), desanexe a tubagem desnecessários primeiro. Coloque um pedaço de fita adesiva ao redor da tubulação para marcar o ponto abaixo do qual a tubulação pode ser considerada estéril. Primeiro com cerca de 25 mL. Despeje o frasco para substituir o volume perdido etanol adicional. Deixe o tubo de sentar-se em etanol por um período mínimo de 5 min.
      3. Pessoa b: preparar-se para trypsinize células. Pulverize o capuz de cultura de tecidos (TC) com etanol a 70%. Spray e coloque as pipetas necessárias, dicas, garrafas e tubos de microcentrífuga para a preparação de células de capuz (ver 2.2.1.1 e 2.2.1.2). Centrifugar as placas seladas em conjuntos a 1026 x g por 2 min à temperatura ambiente. Remova as tampas das placas em uma capa de TC, se previamente determinado que as placas se zangue durante a centrifugação quando as tampas são mantidas na (ver 1.4.1).
    3. Pessoa r: Retire os selos as chapas. Antes, durante ou após os selos foram removidos (dependendo da duração da incubação necessária), pipetar a quantidade necessária de reagente de transfeccao (por exemplo, 375 μL/tubo para uma concentração final de 0,05 μl de RNAiMAX/poço) para os tubos cônicos contendo o diluente de reagente de transfeccao previamente aquecido (por exemplo, 37.125/tubo mL).
    4. Misture pipetando acima e para baixo 10 vezes. Incube à temperatura ambiente durante o tempo prescrito para o reagente de transfeccao sendo usado (por exemplo, 0-10 min).
  2. Reversa do transfection
    1. Ter a pessoa B conclua as seguintes tarefas.
      1. Begin trypsinizing as células (por exemplo, 3 placas de células 786-O). Aspire os meios de comunicação de cada prato. Enxaguar com 9 mL de PBS. Pipetar 3 mL de tripsina por placa. Incube a 37 ° C por aproximadamente 5 min. Ressuspender as células com 22 mL de mídia. Pipetar acima e para baixo 10 vezes.
      2. Combine a suspensão de células de cada placa de cultura de tecido em um frasco estéril. Misture a suspensão de eritrócitos por inversão. Alíquotas de 1 mL pipeta da suspensão celular em dois tubos de microcentrífuga separado. Retire uma amostra de cada tubo de microcentrífuga e contar as células. Calcular o volume da suspensão de células necessária para a densidade necessária (por exemplo, 1500 células/poço) e preparar o suficiente suspensão diluída de células (por exemplo 500ml) para dispensar em um lote de placas.
    2. Tem pessoa conclua as seguintes tarefas em paralelo à pessoa B.
      1. Esvaziar o recipiente do líquido tubulação de etanol. Prime o tubo com aproximadamente 25 mL de PBS e em seguida, esvaziar o tubo. Tenha cuidado ao manusear o tubo para garantir que a seção do tubo abaixo da fita adesiva que vai ser imerso no reagente de transfeccao e mais tarde na suspensão de célula é mantida estéril. Separar as placas que podem ser feitas com segurança com um tubo cónico de solução reagente de transfeccao.
      2. Pipetar as soluções de reagente de transfeccao cima e para baixo 10 vezes. Encha o tubo com a solução de reagente de transfeccao. Para minimizar a perda de reagente de transfeccao, prime com suficiente solução para limpar mal as dicas. Selecione o programa correto sobre o líquido dispensador e dispensar 5 µ l de reagente de transfeccao por bem.
        Cuidado: Acompanhar de perto o nível de reagente de Transfeccao para que ele é reabastecido antes que se esgote. A conclusão das placas que são separados do conjunto deve fornecer uma indicação para adicionar mais solução de reagente de transfeccao.
      3. Centrifugar as placas a 1026 x g por 1 min à temperatura ambiente. Desta vez as tampas será, então, pode ser necessário centrifugar menos placas de cada vez para evitar rachaduras (por exemplo, 2 placas por balde). Incubar as placas à temperatura ambiente durante o tempo prescrito para o reagente de transfeccao sendo usado (por exemplo, 10-20 min).
      4. Durante a incubação, esvaziar o tubo da solução reagente de transfeccao e colocá-lo em um tubo cônico cheio de 50 mL contendo PBS. Lave o tubo com aproximadamente 25 mL de PBS por escorva e esvaziamento.
        1. Se mais das dicas vão ser utilizados para dispensar as células que foram usados para o fornecimento do reagente de transfeccao, re-anexar o tubo não utilizado e re-esterilizar todos os tubos com etanol a 70% antes de enxaguar o tubo com PBS (ver 2.1.2.2).
      5. Misture o frasco contendo a suspensão de células, uma vez que ele foi preparado. Colocar o tubo na suspensão de célula e prime o suficiente para ver que cada ponta é dispensar corretamente. Dispense a 30 μL por poço da suspensão celular através de todos os pratos. Se necessário, misture a suspensão de eritrócitos em intervalos regulares para evitar a sedimentação.
        Cuidado: Às vezes as gotas de suspensão contendo mídia podem aderir aos lados das dicas. Quando este é observado, logo que possível, Aspire ou limpe com fiapos de tecido encharcado em etanol a 70%.
      6. Esvazie o tubo da suspensão celular. Lave o tubo com aproximadamente 25 mL de PBS, seguido por cerca de 50 mL de água destilada.
    3. Permitir que as placas se sentar por 45-60 min, desde o tempo da célula semeadura à temperatura ambiente antes de retornar as placas para a incubadora. Incubar as placas na incubadora intacta para o comprimento desejado do gene silencioso (por exemplo, 48 h) (ver 1.1.4.5).
  3. Infecção
    1. Para poupar tempo, o dia antes de infectar as células, pipetar em estéril garrafas a quantidade precisa de meios de comunicação necessários para infectar cada lote de placas, incluindo meios para poços não infectados (por exemplo, 2 x 350 mL e 2 x 50 mL para 33 placas). Além disso, teste o líquido dispensador de precisão e exatidão e re-calibrar se necessário.
    2. Aquecer a mídia a 37 ° C. Encha duas garrafas com 70% de etanol, dois tubos de 50ml cónico com PBS e outro com água destilada. Verifique se a centrífuga à temperatura ambiente.
    3. Esterilizar o tubo com etanol a 70% e enxágue com PBS, como descrito anteriormente (ver 2.1.2.2 e 2.2.2.1). Enquanto a tubulação está sentado o etanol, pipetar o volume exato de vírus necessários para o frasco contendo a mídia anteriormente preparado para infecção (ver 2.3.1). Enxague o tubo com PBS pela escorva com 25 mL e em seguida esvaziar.
    4. Retire as placas da incubadora e colocá-los ao subúrbio de TC. Prime o tubo com a mídia. Dispense a 40 μL de mídia em poços de controle não infectados. Esvaziar o tubo de mídia e enxágue com 25 mL de PBS. (consulte 2.2.2.5 para precaução)
    5. Depois de misturar o vírus, coloque o tubo no frasco contendo o vírus. Dispense a 40 μl de vírus entre as placas. Centrifugar as placas por 30 min a 400 x g, à temperatura ambiente. Entregue as chapas para a incubadora. Incubar as placas para o previamente determinado período de tempo (por exemplo, 24 h) (ver 1.2.4).
  4. Fixação e coloração de células
    1. Para poupar tempo, o dia antes da fixação, prepare uma garrafa de fixação e coloração de solução contendo formaldeído e PBS (por exemplo, 179 mL de formol 37% e 270 mL de PBS para uma concentração final de 4% de formaldeído) para cada lote de placas, mas omitir o Mancha da Hoechst. Armazenar em armário longe da luz do inflamável.
    2. Lave o tubo com etanol a 70% e PBS como descrito anteriormente (ver 2.1.2.2 e 2.2.2.1). Adicionar o volume necessário de Hoechst (EG. mL 2,5 a 5 mg/ml de Hoechst para uma concentração final no poço de 7,5 μg/mL) para a fixação e coloração de solução e mix.
    3. Dispense a 30 μL de fixação e coloração de solução através de todos os pratos. Coloca as placas na incubadora durante 30 min. Após incubação, aplicam-se os selos para as placas e armazenar as placas a 4° C, protegido da luz. Lavar as placas, se necessário (ver 1.1.6).
  5. Geração de imagens e análise de imagem
    1. As placas da imagem com um microscópio automatizado de alto teor. Use as configurações previamente determinadas, mas primeiro testar as configurações para garantir que não há ajustes precisam ser feitos.
    2. Quantificar a GFP (ou outro repórter fluorescente) área e Hoechst por bem utilizando o script anteriormente desenvolvido (ver 1.3.2). Teste o script com um punhado de placas primeiro para determinar se quaisquer pequenas modificações precisam ser feitas antes de lote, analisando todas as placas.
    3. Identifica bate. Nota: O método robusto de Z-score/MAD (desvio absoluto mediano) é um método que é frequentemente usado para este fim. Normalmente, os escores de > 2 ou < -2 são definidas como cortes. Este método é melhor usado quando as amostras de siRNA são distribuídas aleatoriamente entre as placas e não, por exemplo, agrupadas por função como as amostras são usadas como controles negativos de fato . Filtre os siRNAS citotóxicos como estas seria esperadas não especìfica diminuir vírus se espalhar (veja discussão para mais detalhes sobre filtragem de sucessos citotóxicos).

3. validação de tela secundária de hits com a biblioteca de shRNA TRC (o RNAi Consortium)

Nota: Consulte a discussão para obter detalhes sobre como selecionar hits para validação secundária e possíveis tecnologias de rastreio. Se tecnologia siRNA é selecionada para validação secundária, o mesmo protocolo de desenvolvimento e validação do ensaio pode ser usado como foi usado para a tela principal (ver 1).

  1. Obter uma biblioteca de shRNA TRC personalizada visando os genes candidatos de interesse como estoques de glicerol.
  2. Prepare a transfeccao qualidade Plasmídeo das existências glicerol. Nota: Um protocolo Detalhado (ou seja, "ShRNA/sgRNA/ORF glicerol e preparação de DNA de plasmídeo") pode ser encontrado aqui: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  3. Produzir lentivírus expressam shRNA alvo os genes de interesse com o plasmídeo de DNA. Nota: Um protocolo detalhado para a produção de lentivirus em placas de 96 poços [ou seja, "shRNA/sgRNA/ORF alto Throughput produção Viral (96 bem)"] pode ser encontrada aqui: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  4. Infectar células com os lentivírus. Nota: Um protocolo detalhado para Lentivirus infecção em placas de 96 poços (ou seja, "Infecção Lentivirus") está disponível online em http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
  5. Infectar células com vírus Oncolíticos ou seguir puromicina (ver 3.4 para o protocolo de seleção) de células transduzidas com êxito ou transdução imediatamente seguinte (sem puromicina). Para determinar a quantidade ideal de vírus e o comprimento da incubação com vírus, use o mesmo método usado para a tela principal.

4. terciária validação

Nota: O propósito de validação terciária é principalmente confirmar que o acerto no alvo, tumor específico e aumenta a eficácia in vivo. Um pode também testar se modula propagação através de um espectro de linhas de células de tumor

  1. Confirmação ou knockdown do gene candidato está no alvo
    1. Primeiro, confirme que existe uma correlação entre o fenótipo e o silenciamento de genes. Use o mesmo ensaio que foi desenvolvido para a tela ou modificá-lo para um formato 6-poços avaliar o reforço ou inibição da propagação em um formato maior. Realizar um curso de tempo com células transfectadas com siRNA alvejando os genes de interesse mais e menos vírus.
    2. Imagem dos poços contendo células infectadas por vírus e coletar os lisados celulares dos poços não infectados em intervalos de tempo regulares. Determine se há uma correlação entre o silenciamento de genes e reforço ou inibição da propagação. Avalie o silenciamento de genes quantitativos Polymerase Chain Reaction (qPCR) e/ou mancha ocidental.
    3. Execute um experimento de resgate genético para confirmar o acerto no alvo. Nota: Em um experimento típico de resgate, o gene candidato é knocked-down com RNAi enquanto ao mesmo tempo as células são transfected transitoriamente com cDNA RNAi resistente (por exemplo, ortholog do gene) expressa o gene candidato para determinar se o fenótipo do gene é restaurado ou "resgatado". Linhas de célula estável superexpressão RNAi resistente do cDNA do gene candidato de interesse também podem ser empregadas.
    4. Alternativamente, em vez de um experimento genético de resgate, use vários ensaios ortogonais para confirmar que o sucesso está no alvo [por exemplo, determinar se o mesmo fenótipo é obtido após o nocaute do gene alvo com siRNAs múltiplas, após a derrubada de o gene alvo em várias linhas de célula estável que expressam shRNA contra o gene alvo e após o nocaute com CRISPR (Clustered regularmente intercalada curta palíndromo repetição)-Cas9 tecnologia em várias linhas de célula...
  2. Confirmação de que o sucesso é específico do tumor e modula espalhados em uma gama de linhas de células de tumor
    1. Realizar um ensaio similar como em 4.1.1, mas com as células normais, bem como com outras linhas de células de tumor.
  3. Confirmação de que a manipulação do gene candidato aumenta eficácia na vivo
    Nota: Descritos abaixo é três métodos possíveis para manipular o gene alvo na vivo.
    1. Encontre uma droga para manipular o gene alvo. Se houver uma droga como um inibidor de molécula pequena que tem como alvo o mesmo gene, administrá-lo com o de vírus Oncolíticos em vivo. É importante determinar o momento ideal para administrar a droga.
    2. Engenheiro do vírus para inibir ou overexpress o alvo gene dependendo se um deseja inibir ou reforçar o alvo do gene. Para inibir o gene, engenheiro o vírus Oncolíticos para expressar uma posição dominante negativa do gene ou para expressar shRNA alvo o gene. Para aumentar a expressão do alvo gene, clone o vírus Oncolíticos com um transgene superexpressão do gene.
    3. Engenheiro de linhas de células com o gene knocked-down ou usando shRNA ou CRISPR-Cas9 tecnologia, respectivamente eliminado. Implante a linha celular projetado e o selvagem-tipo célula linha na vivo e posteriormente infectar com o vírus Oncolíticos. Nota: Esse método serve como um prova de princípio e pode ajudar a determinar se a investir mais tempo e recursos para desenvolver um medicamento para manipular o gene na vivo, por exemplo, valeria a pena.

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Representative Results

Uma visão geral do fluxo de trabalho para identificar alvos de anfitrião para melhorar a terapia de vírus Oncolíticos é apresentada na Figura 1.

Conforme ilustrado na Figura 1, o primeiro passo fundamental para a condução de uma tela de RNAi elevado-throughput é desenvolvimento de ensaio. Figura 2A fornece um layout de placa de amostra para o ensaio de otimização do transfection. Figura 2B é composto por imagens representativas dos resultados esperados, e a Figura 2 é uma parcela representativa dos resultados esperados. Após o nocaute de siRNA do PLK-1, um gene que induz a morte celular e pode ser usado como um controle positivo para monitorar a eficiência knockdown siRNA, seria de esperar que a sobrevivência da pilha para ser entre 0-30%, a menos que a linha celular tem um longo tempo em caso de duplicação levará l Onger para observar o fenótipo de morte celular. A não-segmentação siRNA também deve ser minimamente tóxico para as células com uma sobrevivência relativa semelhante ao de células não tratadas.

Outro elemento-chave do desenvolvimento do ensaio é determinar a MOI no qual se infectar as células e o comprimento de tempo para a infecção. Figura 3A fornece um layout de placa de amostra para determinar a quantidade de vírus e o comprimento da incubação com vírus. Figura 3B mostra os resultados de um curso de tempo ao vivo de 786-O células infectadas com vvDD-eGFP (vírus do vaccinia Oncolíticos expressando GFP reforçada com os genes de timidina quinase e fator de crescimento de Vaccinia excluídos) em vários MOIs. Imagens representativas de células infectadas com vvDD-eGFP em um MOI de 0.05 são mostradas na Figura 3. Baseado nos resultados plotados na Figura 3B, um pode selecionar um MOI de 0,05 e um comprimento de infecção de 21 h como isto permitiria para a detecção de aumentos e diminuições em propagação, como neste ponto do tempo é dentro de uma escala linear e o Z-fator estimado a esta hora me-ponto é 0.6 para coortes que aumentam e coortes que diminuem a propagação. Como parte de validar este ensaio, um vai querer consertar as células neste MOI e ponto de tempo e calcular o fator de Z.

Seguindo o protocolo descrito, realizamos telas de RNAi todo o genoma em três linhas de células de tumor diferente (por exemplo, OVCAR-8, U373, NCI-H226) em duplicado com uma biblioteca de siRNA direcionamento 18.120 genes15. Usando o método MAD, identificamos 1008 acessos comuns a pelo menos 2 fora das linhas de célula de 3 câncer (Figura 4A). Caminho análise de acertos identificados nas telas revelou enriquecimento dos membros da UPR (resposta unfolded da proteína) e percursos ERAD (degradação de proteínas retículo endoplasmático-associada) (Figura 4A). Nós selecionamos 10 sucessos dentro destes caminhos para validação secundário usando siRNA com sequências alvos diferentes da tela principal (Figura 4B). Como parte da validação do terciária, foi realizado um experimento genético de resgate com IRE1α e ATF6α (ativação da transcrição fator 6 Alfa) para confirmar que esses sucessos foram alvo (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: esquemático do fluxo de trabalho para identificar alvos de anfitrião para melhorar a terapia de vírus Oncolíticos. O primeiro passo é desenvolver e validar um ensaio para rastreio de RNAi de alto rendimento, que inclui otimizando condições de Transfeccao para introduzir siRNA em células, determinando a quantidade ideal de vírus (ou seja, MOI) para infectar as células com e a período de incubação com vírus. O segundo passo é conduzir uma tela de todo o genoma de alta produtividade. Uma biblioteca de siRNA alvejando genes em todo o genoma inteiro é põr em placas de microtitulação. As células são então reverso transfected com a biblioteca de siRNA. Após um período de incubação de 48-72 h para permitir o silenciamento de genes, as células são infectadas com a quantidade ideal de vírus. Após o comprimento ideal de incubação com vírus, células fixas e manchadas e posteriormente fotografadas com um microscópio de alto teor. Subsequente análise de imagem e dados ajudará a identificar genes que modulam significativamente a replicação do vírus, que são referidos como "sucessos". Uma tela secundária de validação é executada em selecionados hits da tela principal, geralmente usando siRNA ou shRNA com regiões diferentes sementes. São realizados experimentos de validação terciário para confirmar que os sucessos estão no alvo, específicas do tumor e aumentar a eficácia na vivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: otimização do transfection condições para ensaio de triagem do elevado-throughput RNAi. (A) um layout de placa de amostra para otimizar as condições de transfecção com duas linhas de células diferentes. (B) imagens representativas de células 786-O (1500 células/poço) corados com Hoechst 33342 após 72 h incubação transfeccao reagente diluente sozinho (ou seja, sem tratamento), com reagente de transfeccao e diluente (ou seja, simulação transfectadas), com direcionamento-siRNA e com siRNA direcionamento PLK-1. (C) representante resulta da experiência de otimização de transfeccao mostrando 22% de sobrevivência das células transfectadas com siRNA PLK-1 (n = 24) e sobrevivência de 94% de células transfectadas com direcionamento-siRNA (n = 8). Barras de erro = ± SD, desvio-padrão; escala de barras = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: determinação da quantidade de vírus e o período de incubação com vírus para o ensaio de triagem do elevado-throughput RNAi. (A) um amostra placa layout para otimizar a quantidade de vírus e comprimento da incubação com vírus. Colunas 1 e 24 conter transfeccao controles e são à esquerda não infectados. Colunas 2 a 23 contêm células não tratadas, as células transfectadas trocistas e células transfectadas com vírus positivo e negativo de controles todos infectados com uma gama de MOIs, começando com nenhum vírus nas colunas 2 e 3. (B) células de 786-O foram reversos transfected com siRNA não-segmentação e incubadas durante 48 h. Posteriormente, eles foram infectados com vvDD-GFP nos MOIs indicado e fotografada a intervalos de 8 h infecção pós de 5 horas (hpi). A área GFP média por alvéolo (± DP) foi calculada para cada ponto do tempo (n = 12) e plotados no gráfico. O Z-fator calculado entre os pontos A e B é 0,6 e o Z-fator calculado entre os pontos B e C é 0.6. (C) representante imagens ao vivo de um poço que está infectado com um MOI de 0,05 nos pontos de tempo indicado. Ampliação, 10 x; 9 campos/bem; escala de barras = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: tela de todo o genoma identifica Stress ER resposta bloqueio como um potente sensibilizador de Rhabdovirus-mediada Oncolysis. (A) diagrama de Venn, descrevendo o número de hits sobreposta do elevado-throughput RNAi telas em 3 linhas de células de tumor e uma tabela (+, sintético letal;-, não há interação) e diagrama esquemático (atinge delineada em vermelho) ilustrando principais sucessos dentro da UPR e ERAD caminhos. (B) turnos de50 CE (barras pretas, deixada o eixo y) foram determinados para U373 células tratadas com vírus Marabá (48 h) após o tratamento com siRNA (72 h) visando uma série de sucessos UPR/ERAD da tela. Relativa expressão de RNAm para cada gene nocaute siRNA (72 h) a seguir é retratado em branco (eixo y direito). (C) os ensaios de viabilidade celular foram realizados 48 h após a infecção pelo vírus de Marabá, em U373 células expressando ectopically mouse ATF6α (ou controle GFP) ± siRNA direcionamento humano ATF6α (ou não-segmentação [NT] controle; painel esquerdo) ou XBP1(s) humano (ou controle ) ± siRNA direcionamento humano IRE1α (ou controlar; direito painel). Borrões ocidentais, demonstrando o silenciamento de genes e expressão de gene ectópica são mostrados. CE50 turnos = o turno na dose de vírus necessários para matar 50% das células; Barras de erro = ±SD; XBP1(s) = proteína X-caixa 1 (emendada); Em (B), foram realizada One-Way Anova seguido de um Bonferroni teste post hoc de comparação múltipla para derivar os valores de p; Em (C), realizaram-se testes t de student para derivar os valores de p; * p < 0,05; #p < 0,05. (Esta figura foi modificada de Mahoney et al., 201115). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui nós apresentamos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para identificar alvos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos. Isso foi testado com sucesso com Oncolíticos Marabá vírus e vírus do vaccinia Oncolíticos, mas, como foi observado, pode ser adaptado para uso com outros vírus Oncolíticos ou outros vírus geralmente para identificar genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus. O protocolo de triagem também é projetado para identificar genes que aumentam ou diminuem a propagação, mas ele pode ser facilmente modificado para outras leituras. Nossas telas com vírus de Marabá, por exemplo, foram projetadas para identificar genes modulando oncolysis utilizando um ensaio simples baseada em resazurina vital tintura para marcar a viabilidade celular (ver Figura 4)15. Essas telas, após incubação com vírus, em vez de pilhas da fixação com formol e coloração com a Hoechst, demitiremos resazurina tintura para cada poço (concentração final de 20 μg/mL) e, após uma incubação de 6 h, medimos a absorvância (573 nm) com um leitor de placas. Também poderíamos ter usado o celular baseado na coloração de Hoechst como uma leitura. Enquanto usar um repórter substituto para monitorar a replicação de vírus foi desnecessário nesta tela, um vírus com uma proteína de repórter, particular de uma proteína fluorescente facilitar a otimização de tela como um pode, por exemplo, monitorar a replicação de vírus vivo; Além disso, um vírus com uma proteína de repórter é menos complexos e onerosos do que usando anticorpos a mancha para antígenos virais, mas é possível que a tela sem um. Além disso, um poderia fazer modificações ainda mais o ensaio para investigar fatores do hospedeiro que têm impacto sobre a infecciosidade, tamanho de intermitência e fenótipos sub ainda mais detalhados, como a morte de células imunológicas. Em cada caso, um iria seguir um protocolo de desenvolvimento ensaio similar, estratégia e métodos de validação secundários e terciários de rastreio.

No protocolo, sugerimos otimizando condições de transfeccao idealmente com várias linhas de células de tumor. Há pelo menos duas razões para otimizar com várias linhas de célula. Uma razão é que nem toda linha de celular é passível de seleção da elevado-produção, como alguns podem ser difíceis de transfect ou podem não aderir bem, mas das principais razões é permitir rastreio com várias linhas de célula para evitar preconceito intrínseco de célula. A escolha das linhas celulares é largamente dependente dos objectivos. Um pode eleger para concentrar-se em um tipo específico de câncer ou selecione os tipos de câncer díspares para cobrir um espectro mais amplo. Alternativamente, um pode querer concentrar-se em linhas de células de tumor que são resistentes a identificar fatores do hospedeiro que podem ser manipulados para fazer as linhas de células de tumor menos resistentes à infecção pelo vírus Oncolíticos.

Além da selecção de linhas de células, a seleção de controles positivos e negativos do vírus é uma consideração importante para qualquer tela. Em alguns casos, genes de vírus que são necessárias para ou restringem a replicação não podem ser conhecidos ou, se estes forem conhecidos, eles podem ser específicos para celular. Consequentemente, um pode ainda determinar a robustez aproximada e faixa dinâmica do ensaio usando controles de substituto. Por exemplo, um pode usar células não infectadas ou células infectadas com um MOI baixo como um controle positivo de substituto para a identificação de genes que diminuem a propagação em nocaute. Para a identificação de genes que melhoram a propagação ao nocaute, um poderia infectar células com uma série de diluição do vírus e poços com o sinal máximo como um controle positivo de substituto.

Seleção de sucessos para validação de ecrã secundário e o tipo de tecnologia a empregar é outra questão que requer deliberação cuidadosa. Os candidatos são geralmente selecionados para validação ecrã secundário baseada a magnitude do hit, sobre se eles significativamente modulam a propagação em várias linhas de células de câncer, (se primário telas foram conduzidas em várias linhas de célula) e no interesse biológico. Ferramentas de Bioinformática como DAVID22,23, Pantera24, STRING25 e PINdb26 podem ajudar a isolar vias e hits de interesse biológico. Mercer et al 8 descrever o uso de software de análise de imagem de código-fonte aberto e também disponibilizamos um algoritmo que eles desenvolveram para a visualização e análise de hits. Um factor a ter em conta quando a interpretação de resultados é o silenciamento de genes pode ter diferentes impactos dependendo do estágio no ciclo de vida do vírus que está sendo investigado. Por exemplo, é possível que nocaute de um gene cedo no ciclo de vida pode inibir a replicação do vírus, enquanto "knockdown" numa fase posterior pode aumentar a replicação. Muitas vezes, telas secundárias são conduzidas com siRNA de um fornecedor diferente com regiões diferentes sementes com múltiplos siRNAs por gene. No entanto, tecnologias complementares alvejando genes candidatos podem ser empregadas como vetores CRISPR-Cas9 ou lentivirus expressam shRNA.

O método de análise é também uma consideração crítica. Sugerimos aqui usando o Z-escore robusto ou louco20,27 com sugeriu cortes para ocorrência chamada de > 2 ou < -2. Os cortes podem ser aumentados ou diminuídos dependendo se o foco é na eliminação mais falsos positivos ou capturar mais falsos negativos. Por exemplo, uma tela de alta produtividade recente com vaccinia vírus9, o limite inferior foi fixado em-1.5 (sem cortes superiores foram descritos como o foco era na identificação de genes que diminuíram a propagação sobre "knockdown"). Existem também outros métodos que podem ser empregados, incluindo a pontuação z SSMD (diferença média padronizada estritamente) e o B Pontuação20,28,29,30. Brasileiro et al31 comparado hit listas geradas pelo posto de soma, MAD, z-score e SSMD e descobriu que cada método de análise resultou em diferentes listas de sucesso. Em toto, não há método perfeito ou corte. Em última análise, estudos de validação de validação e terciário secundário tela confirmará verdadeiros sucessos.

O método de filtragem de sucessos citotóxicos também deve ser considerado. Uma maneira é a conduta principais telas em paralelo mais ou menos vírus. Isto permite a detecção de siRNAs que são citotóxicos por conta própria. Esta foi a nossa abordagem em nosso Marabá vírus telas15; no entanto, isto não é sempre prático. Talvez um método mais prático, além de ser robusto, é verificar sucessos que são citotóxicos, como parte do secundário tela validação, especialmente se o foco é identificar sucessos que diminuir a replicação após o nocaute. Por exemplo, em uma tela principal de genoma inteiro com vírus mixoma, Teferi et al. 11 identificado 1.588 siRNAs que diminuiu a replicação de vírus após o nocaute. Para filtrar siRNAs citotóxicos, eles conduziram uma tela secundária de citotoxicidade com estes siRNAs; Eles mediram a viabilidade 72 h pós-transfection da pilha usando um ensaio da viabilidade celular resazurina-baseado. Citotóxicos siRNAs foram identificados com base em uma pontuação Z ≤-1.96. Outra abordagem é simplesmente filtrar siRNAs citotóxicos a partir dos dados de rastreio primário baseados-se uma redução do número de células de uma determinada percentagem, por exemplo, por uma redução > 50% como em Sivan et al 9, ou com base em uma pontuação específica como Lee et al . 14. o; em seu estudo de fatores do hospedeiro necessárias para a replicação de vírus da estomatite vesicular, excluíram siRNA sucessos que reduziu a viabilidade celular por > 3.0 desvios-padrão da média. O número médio de células foi determinado com base na Hoechst coloração de núcleos de células e, embora não explicitamente declarado, a média foi aparentemente calculada sobre uma base de por placa, como é evidente que a média do sinal GFP foi calculada em uma base por placa.

Uma limitação de qualquer tela de RNAi elevado-throughput é o frequente elevado número de falsos positivos e negativos, o que podem ter como consequência o design do ensaio, a tecnologia utilizada ou por meio de erros sistemáticos. Por exemplo, uma proteína pode afetar significativamente a replicação do vírus, mas o momento escolhido para o silenciamento de genes pode ser dado Half-Life a proteína para detectar seu efeito levando a um falso negativo em virtude do projeto de ensaio muito curto. Está bem estabelecido que knockdown incompleta e os efeitos fora do alvo da tecnologia siRNA também podem introduzir negativos e falsos positivos. Erros sistemáticos, tais como o efeito de borda32, podem gerar resultados enganosos também. Aqui o sinal nos poços da placa externas pode ser sistematicamente mais elevado ou mais baixo do que o resto da placa devido a evaporação. Há estratégias para o endereço de algumas destas questões, incluindo, por exemplo: diminuindo a concentração de siRNA para reduzir efeitos fora de rota33, reconfigurando layouts de placa para encher os poços exteriores com meios para atenuar o efeito de borda ou empregando métodos computacionais foram desenvolvidos para detectar e combater erros sistemáticos tais como o efeito de borda32,34,35. Um método geral para lidar com falsos positivos é conduzir uma tela secundária após a tela principal. Como uma forma de lidar com falsos negativos, um pode relaxar o corte por sucesso ligar e incluem potenciais falsos negativos para rastreio secundário. Isto, claro, não irá capturar falsos negativos que estão bem abaixo do corte. Telas primárias também devem ser conduzidas em duplicado ou triplicado para limitar os resultados espúrios. Em última análise, não importa de que estratégias são empregadas, nenhuma tela do elevado-throughput identificará exaustivamente todos os hits de verdadeiros, mas pode fornecer um tesouro de dados da qual um é provável que alguns hits valiosos que podem ser capitalizados sobre o meu.

Neste protocolo, nós descreveu o uso de matriz siRNA e tecnologia de shRNA, embora uma outra alternativa é o uso de shRNA em pool e CRISPR-Cas9 bibliotecas. Uma biblioteca de shRNA em pool foi empregada na. Workenhe et al 12 estudo descrito na introdução. Em pool CRISPR-Cas9 tecnologia tem sido utilizada para conduzir telas de genoma-escala para identificar os fatores do hospedeiro necessárias para a replicação de vírus como o vírus36Zika, vírus37,38do oeste do Nilo, de vírus da dengue39 e hepatite C vírus39. A vantagem do uso de bibliotecas em pool é que eles são menos caros para comprar, não exigem infra-estruturas especializadas (por exemplo, manipulação de dispositivos, alto teor microscópios e equipamentos robóticos de líquido), nem têm os altos custos de funcionamento e manutenção desta infra-estrutura, e eles exigem menos consumíveis. A desvantagem é que os tipos de leituras são mais limitados. Em telas interação hospedeiro-vírus biblioteca Pool a maioria se não todos, até à data, a leitura é a viabilidade celular ou falta dela; um não pode prontamente sonda para fenótipos mais complexos. A escolha do formato depende a pergunta biológica.

Os avanços na tecnologia de rastreio genético ao longo das últimas décadas que primeiro telas habilitadas em bactérias e leveduras para telas de genoma-escala agora atual em células humanas abriu a porta para a descoberta em diversos campos de estudo. Estas telas genéticas não apenas nos permitiram responder a perguntas fundamentais da biologia, mas deram-nas chaves para desbloqueio insights sobre o desenvolvimento e a melhoria biotherapeutics. Enquanto ainda há lições a serem aprendidas e desafios a serem vencidos com esta tecnologia, os resultados até à data tem sido emocionantes. As descobertas provavelmente será ainda maiores como romance triagem tecnologia incluindo bibliotecas CRISPR-Cas9, microfluídica e na vivo triagem tecnologias continuam a amadurecer.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Instituto de Ontário para pesquisa do câncer, a Fundação do Canadá para a inovação, o Ottawa Regional Cancer Foundation e o Instituto de pesquisa do Terry Fox. K.J.A. foi apoiado por uma bolsa graduação Canadá Vanier, um Instituto canadense de saúde pesquisa-mestrado Award e uma bolsa de pós-graduação de Ontário.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
siRNA library GE Dharmacon G-005005-02
Corning 384-well plate Corning 3985
Falcon 384-well plate Becton Dickinson 353962
Water Sigma W4502
siGenome SMARTpool PLK1 GE Dharmacon M-003290-01
AllStars Negative Control siRNA Qiagen SI03650318
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 GE Dharmacon D-001206-14-20
DMEM/HIGH Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30022.01
Fetal Bovine Serum Sigma F15051-500ML
HEPES solution (1M) Sigma H3535-100ML
Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 2500056
DPBS/Modified GE Healthcare Life Sciences SH30028.02
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778100
Oligofectamine Thermo Fisher Scientific 1225011
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 22600-050
Resazurin sodium salt Sigma R7017-5G
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H21492
Formaldehyde (37% by weight) Fisher Scientific F79-4
500 ml bottles Corning 430282
Adhesive Sealing Film For Microplates Excel Scientific 361006007
Peelable Heat Sealing Foil Thermo Fisher Scientific AB-3720
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette Fisher Scientific 11-120-625
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MicroFlo Select (liquid dispenser) Fisher Scientific 11120621
BioTek Synergy HT plate reader Biotek N/A
Opera Imaging and Analysis Instrument PerkinElmer HH10000115
KiNEDx Robotic Arm Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) KX-300-660
Cytomat 24C Series Automated Incubator Thermo Fisher Scientific 50080227
JANUS Automated Workstation PerkinElmer AJI4M01
Plate Carousel Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) N/A
Alps 3000 plate sealer Thermo Fisher Scientific AB-3000

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References

  1. Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
  2. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-792 (2012).
  3. Houzet, L., Jeang, K. T. Genome-wide screening using RNA interference to study host factors in viral replication and pathogenesis. Exp. Biol. Med. 236 (8), 962-967 (2011).
  4. Friedel, C. C., Haas, J. Virus-host interactomes and global models of virus-infected cells. Trends Microbiol. 19 (10), 501-508 (2011).
  5. Gao, S., Yang, C., et al. Applications of RNA interference high-throughput screening technology in cancer biology and virology. Protein Cell. 5 (11), 805-815 (2014).
  6. Kilcher, S., Mercer, J. Next generation approaches to study virus entry and infection. Curr. Opin. Virol. 4, 8-14 (2014).
  7. Ramage, H., Cherry, S. Virus-Host Interactions: From unbiased genetic screens to function. Annu. Rev. Virol. 2 (1), 497-524 (2015).
  8. Mercer, J., Snijder, B., et al. RNAi screening reveals proteasome- and Cullin3-dependent stages in vaccinia virus infection. Cell Rep. 2 (4), 1036-1047 (2012).
  9. Sivan, G., Martin, S. E., et al. Human genome-wide RNAi screen reveals a role for nuclear pore proteins in poxvirus morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (9), 3519-3524 (2013).
  10. Beard, P. M., Griffiths, S. J., et al. A loss of function analysis of host factors Influencing vaccinia virus replication by RNA Interference. PLoS ONE. 9 (6), e98431 (2014).
  11. Teferi, W. M., Dodd, K., Maranchuk, R., Favis, N., Evans, D. H. A whole-genome RNA interference screen for human cell factors affecting myxoma virus replication. J. Virol. 87 (8), 4623-4641 (2013).
  12. Workenhe, S. T., Ketela, T., Moffat, J., Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Genome-wide lentiviral shRNA screen identifies serine/arginine-rich splicing factor 2 as a determinant of oncolytic virus activity in breast cancer cells. Oncogene. 35 (19), 2465-2477 (2015).
  13. Panda, D., Das, A., et al. RNAi screening reveals requirement for host cell secretory pathway in infection by diverse families of negative-strand RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (47), 19036-19041 (2011).
  14. Lee, A. S. -Y., Burdeinick-Kerr, R., Whelan, S. P. J. A genome-wide small interfering RNA screen identifies host factors required for vesicular stomatitis virus infection. J. Virol. 88 (15), 8355-8360 (2014).
  15. Mahoney, D. J., Lefebvre, C., et al. Virus-tumor interactome screen reveals ER stress response can reprogram resistant cancers for oncolytic virus-triggered Caspase-2 cell death. Cancer Cell. 20 (4), 443-456 (2011).
  16. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. A call to arms: Using RNAi screening to improve oncolytic viral therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 21 (2-3), 161-167 (2010).
  17. Mahoney, D. J., Stojdl, D. F. Functional genomic screening to enhance oncolytic virotherapy. Br. J. Cancer. 108 (2), 245-249 (2012).
  18. Allan, K. J., Stojdl, D. F., Swift, S. L. High-throughput screening to enhance oncolytic virus immunotherapy. Oncolytic Virother. 5, 15-25 (2016).
  19. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8 (5), 566-570 (2003).
  20. Birmingham, A., Selfors, L. M., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6 (8), 569-575 (2009).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  23. Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  24. Thomas, P. D., Campbell, M. J., et al. PANTHER: a library of protein families and subfamilies indexed by function. Genome Res. 13 (9), 2129-2141 (2003).
  25. Szklarczyk, D., Morris, J. H., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D362-D368 (2017).
  26. Luc, P. -V., Tempst, P. PINdb: a database of nuclear protein complexes from human and yeast. Bioinformatics. 20 (9), 1413-1415 (2004).
  27. Chung, N., Zhang, X. D., et al. Median absolute deviation to improve hit selection for genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 13 (2), 149-158 (2008).
  28. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z Score, SSMD*, z* Score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16 (7), 775-785 (2011).
  29. Zhang, X. D., Lacson, R., et al. The use of SSMD-based false discovery and false nondiscovery rates in genome-scale RNAi screens. J. Biomol. Screen. 15 (9), 1123-1131 (2010).
  30. Amberkar, S. High-throughput RNA interference screens integrative analysis: towards a comprehensive understanding of the virus-host interplay. World J. Virol. 2 (2), 18-31 (2013).
  31. Barrows, N. J., Le Sommer, C., Garcia-Blanco, M. A., Pearson, J. L. Factors affecting reproducibility between genome-scale siRNA-based screens. J. Biomol. Screen. 15 (7), 735-747 (2010).
  32. Carralot, J. -P., Ogier, A., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28 (2), 261-268 (2011).
  33. Caffrey, D. R., Zhao, J., et al. siRNA off-target effects can be reduced at concentrations that match their individual potency. PLoS ONE. 6 (7), e21503-e21511 (2011).
  34. Makarenkov, V., Zentilli, P., Kevorkov, D., Gagarin, A., Malo, N., Nadon, R. An efficient method for the detection and elimination of systematic error in high-throughput screening. Bioinformatics. 23 (13), 1648-1657 (2007).
  35. Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Brief. Bioinform. 16 (6), 974-986 (2015).
  36. Savidis, G., McDougall, W. M., et al. Identification of Zika virus and dengue virus dependency factors using functional genomics. Cell Rep. 16 (1), 232-246 (2016).
  37. Ma, H., Dang, Y., et al. A CRISPR-Based screen identifies genes essential for West-Nile-virus-induced cell death. Cell Rep. 12 (4), 673-683 (2015).
  38. Zhang, R., Miner, J. J., et al. A CRISPR screen defines a signal peptide processing pathway required by flaviviruses. Nature. 535 (7610), 164-168 (2016).
  39. Marceau, C. D., Puschnik, A. S., et al. Genetic dissection of Flaviviridae host factors through genome-scale CRISPR screens. Nature. 535 (7610), 159-163 (2016).

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Pesquisa sobre o câncer edição 134 Oncolíticos vírus RNAi tela alta produtividade câncer vaccinia Rhabdovírus célula anfitrião genómica funcional
Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia
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Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, S. D., Lefebvre, C. A., Stojdl, D. F. Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy. J. Vis. Exp. (134), e56913, doi:10.3791/56913 (2018).

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