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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic

Published: April 3, 2018 doi: 10.3791/56913
Automatic Translation
1,2, 1,4, 1, 1, 1,2,3
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Summary

Qui descriviamo un protocollo per impiegando HTS RNAi per scoprire destinazioni di host che possono essere manipolate per migliorare la terapia virus oncolytic, specificamente terapia del rhabodvirus e del vaccinia virus, ma può essere facilmente adattata ad altri oncolytic piattaforme di virus o di scoperta di geni ospitanti che modulano la replicazione del virus in generale.

Abstract

Tecnologia di retinatura di alto-rendimento genoma RNAi (RNA interference) è stato ampiamente utilizzata per scoprire i fattori che influenzano la replicazione del virus. Qui presentiamo l'applicazione di questa tecnologia per scoprire obiettivi di host che specificamente modulano la replica di Maraba virus oncolytic rhabdovirus e un papilloma virus con l'obiettivo di migliorare la terapia. Mentre il protocollo è stato testato per l'utilizzo con virus oncolytic Maraba e virus vaccinia virus oncolytic, questo approccio è applicabile ad altri virus oncolytic e può essere utilizzato anche per identificare gli obiettivi di host che modulano la replicazione del virus nelle cellule di mammifero in generale. Questo protocollo descrive lo sviluppo e la validazione di un test per HTS RNAi in cellule di mammifero, le considerazioni chiave e importante per lo svolgimento di uno schermo di RNAi ad alta produttività primario e una guida dettagliata per la procedura di preparazione lo svolgimento di uno schermo di RNAi di alto-rendimento primario; Inoltre, largamente descrive i metodi per lo svolgimento di convalida lo schermo secondario e terziario convalida gli studi. Il beneficio del RNAi high throughput screening è che permette di catalogare, in modo ampio e imparziali, fattori dell'ospite che modulano qualsiasi aspetto della replicazione del virus per il quale si può sviluppare un test in vitro quali infettività, dimensione, burst e citotossicità. Ha il potere di scoprire bioterapeutici obiettivi imprevisti sulla base delle attuali conoscenze.

Introduction

HTS RNAi genoma ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per rivelare intuizioni biologiche in diverse aree di studio tra cui biologia del virus. Nel corso degli ultimi dieci anni o così, numerosi gruppi hanno intrapreso basati su cellule su larga scala lo screening RNAi per estesamente identificare geni ospitanti che modulano la replicazione del virus (rivisto1,2,3,,4 , 5 , 6 , 7). interessante, un gran numero di questi schermi è stati condotti in cellule di cancro e diverse con virus che sono attuali candidati dei virus oncolytic compreso vaccinia virus8,9,10 , Myxoma virus11, herpes simplex virus12, stomatite vescicolare virus13,14e Maraba virus15. Mentre l'attenzione della maggior parte di questi studi era sull'individuazione di fattori dell'ospite che influenzano alcuni aspetti della replicazione del virus e non sull'identificazione di bersagli bioterapeutici per migliorare la terapia del virus oncolytic, preziosi dati potrebbero essere Estratto da questi insiemi di dati in questo proposito. È chiaro che il potenziale potente per identificare gli obiettivi di host che possono essere manipolati per migliorare la terapia virus oncolytic non è stato pienamente sfruttato.

Una pletora di piattaforme virus oncolytic sono attualmente in fase di test in studi preclinici e clinici tra cui herpes simplex virus, reovirus e vaccinia virus, che hanno avuto successo dimostrabile in ritardo-fase di test clinici. Per la maggior parte di queste piattaforme, gli sforzi sono stati diretti verso alterando i genomi di virus per migliorare la terapia. Per esempio, per aumentare la specificità del tumore, geni specifici virus sono stati eliminati o mutati per limitare significativamente la replicazione virale in cellule normali, ma non in cellule del tumore. In alcuni casi, i transgeni sono stati aggiunti come GM-CSF (fattore distimolazione del macrofago del granulocyte) per potenziare la risposta immunitaria o NIS (symporter ioduro di sodio) per attivare in vivo imaging e l'assorbimento cellulare di radioiodide per terapeutico fini. Tuttavia, ci è stato molto poco lavoro incentrata sulla manipolazione dei geni host/tumore ed esplorare l'impatto dei geni ospite/tumore sulla replicazione del virus oncolytic. Con l'avvento della tecnologia high throughput screening, è ora possibile per sondare le interazioni ospite-virus su una scala di genoma e decifrare le opportunità di manipolare il genoma ospite per migliorare la terapia virus oncolytic (recensione a16, 17,18).

Abbiamo segnalato il primo studio che dimostra di prova per l'utilizzo di high throughput screening per identificare bersagli di host che potrebbero essere modificati per migliorare la terapia virus oncolytic genetico. Per scoprire i geni ospitanti che modulano Maraba virus oncolitici, un rhabdovirus oncolytic attualmente in fase di sperimentazione in fase I e studi II, abbiamo condotto schermi RNAi genoma attraverso tre linee cellulari differenti del tumore in duplice copia con un siRNA (breve interferenza RNA) Biblioteca 18.120 geni15di targeting. Analisi dei percorsi dei successi identificato nelle schermate ha rivelato arricchimento dei membri della vie di risposta di sforzo ER (reticolo endoplasmatico). Abbiamo selezionato 10 colpi all'interno di queste vie per la convalida secondario utilizzando siRNA con sequenze di destinazione diversi da quelli della schermata principale. Come parte della convalida terziario, abbiamo condotto un esperimento di salvataggio con IRE1α (inositolo-richiedere alfa enzima 1) per confermare che il colpo era il bersaglio. In vitro e in vivo test utilizzando un inibitore di piccola molecola di IRE1α ha provocato oncolytic drammaticamente maggiore efficacia.

Workenhe et al. 12 ha anche condotto una schermata di RNAi genoma utilizzando un pool lentivirale shRNA (short hairpin RNA) libreria targeting 16.056 geni per identificare fattori ospite limitando il virus di simplex di erpete umano tipo 1 (HSV-1) oncolitici mutante KM100-mediata del seno cellule tumorali. Nella schermata principale, hanno identificato i 343 geni l'atterramento di che conducono alla citotossicità migliorata delle cellule infettate KM100 sopra cellule mock-infettate; hanno selezionato 24 di questi geni per convalida secondario. Fuori i 24 geni, 8 geni sono stati confermati nella schermata secondaria con uno di loro essendo SRSF2 (serina/arginina-ricco splicing factor 2), che successivamente è stata confermata usando un esperimento genetico salvataggio durante la convalida del terziario. Il gruppo proseguì per identificare un inibitore della topoisomerasi del DNA chemioterapico che ridotto la fosforilazione di SRSF2 e ha dimostrato che il trattamento di combinazione di HSV-1 KM100 con questo inibitore ha portato alla sopravvivenza estesa dei topi del tumore-cuscinetto TUBO.

Negli studi di cui sopra, è stato seguito un simile flusso di lavoro. Ciascuno ha cominciato con uno schermo di RNAi genoma primario seguito da una schermata secondaria su un numero selezionato di colpi identificati nella schermata principale. Ciò è stata seguita da studi di validazione terziaria, che comprendeva confermando che il colpo era il bersaglio eseguendo genetica rescue esperimenti in vitro con ultima convalida eseguita manipolando la destinazione gene prodotto in vivo. In questo articolo, forniamo prima un protocollo generale per lo sviluppo e la validazione di un test di siRNA-screening ad alta velocità, che consiste nel determinare le condizioni ottimali di transfezione, quantità di virus e la lunghezza dell'infezione. Offriamo anche un protocollo dettagliato per lo svolgimento di un primario, uno schermo di alto-rendimento siRNA, nonché una descrizione generale del metodo per l'esecuzione di convalida lo schermo secondario e terziario convalida.

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Protocol

1. sviluppo e validazione di un siRNA di high throughput screening test

Nota: Per tutti gli esperimenti, utilizzare tamponata Hepes crescita mezzi appropriati per ogni linea cellulare. Vedere la Figura 1 per una panoramica del flusso di lavoro da ottimizzazione analisi convalida terziario.

  1. Determinazione delle condizioni ottimali di transfezione
    1. Selezionare una linea cellulare del tumore o idealmente tumore multiplo cellule linee con cui ottimizzare le condizioni di transfezione (ad es. 786-O, SF268, NCI-H226, U20S, U373, OVCAR-8; si veda discussione per ulteriori informazioni sulla selezione delle varietà di cellula).
    2. Selezionare un reagente di transfezione o più per testare. Può essere necessario testare diversi reagenti di transfezione, come alcuni possono essere più tossici o efficiente rispetto ad altri in una linea cellulare specificato. Inoltre, tenete a mente che alcuni possono incidere sull'infezione da virus o può generare il segnale di alta priorità bassa su formazione immagine.
    3. Decidere il positivo [e. g. siRNA PLK-1(Polo Like Kinase 1) mRNA, che induce la morte delle cellule di targeting] e transfezione controlli (ad es. non-targeting siRNA) negativi.
    4. Seguire il protocollo di transfezione inversa per il reagente di transfezione di particolare, ma variare la quantità di reagente di transfezione (es. 0.05, 0.1, 0.15 e 0,2 μL/pozzetto) e semina (ad es. 625, 1250, 2500 cellule/pozzetto) densità cellulare. Sono repliche delle seguenti condizioni: non trattata di cellule, finto trasfettate (cioè le cellule più reagente di transfezione) e cellule trasfettate con siRNA di controllo positivi e negativi di transfezione (Vedi Figura 2A per un piatto di campione layout).
      1. In generale, preparare 80 nM diluizioni di ogni siRNA per una concentrazione finale nel pozzo di 10 nM (a seconda della libreria, una maggiore concentrazione di siRNA può essere richiesta). Se non diversamente specificato, diluire il siRNA con il reagente di transfezione di diluente. Preparare le diluizioni del reagente di transfezione.
      2. Pipettare 5 μL di siRNA per pozzetto seguita da 5 μL di reagente di transfezione diluito. Per facilitare questo passaggio, distribuire lungo una colonna di una piastra di fondo U 96 pozzetti, le miscele di siRNA e il diluente di siRNA da solo (per non trattate e finte cellule trasfettate). Distribuire lungo una seconda colonna, il reagente di transfezione diluito e transfezione reagente diluente da solo (per le cellule non trattate).
        1. Utilizzando una pipetta elettronica, pipettare 5 μL/pozzetto del contenuto della prima colonna contenente siRNA o siRNA diluente nei rispettivi pozzetti della piastra 384 pozzetti seguita da 5 μL/pozzetto del reagente di transfezione diluito o reagente di transfezione di diluente dalla seconda colonna.
      3. Centrifugare le piastre a 1026 x g per 1 min a temperatura ambiente e incubare per il tempo prescritto per il reagente di transfezione (ad es. 5-20 min).
      4. Mentre le piastre sono incubando, preparare sospensioni di cellule differenziate. Dispensare 30 μL della sospensione di cellule per pozzetto. Prima di mettere le piastre nell'incubatore, lasciate riposare per 45-60 min a temperatura ambiente per consentire l'assestamento uniforme di cellule19delle piastre.
        Nota: Se il periodo di incubazione prescritto per il reagente di transfezione con siRNA è breve, preparare le sospensioni cellulari prima di incubazione.
      5. Incubare per 48-72 h a seconda della lunghezza desiderata di atterramento scelto per lo schermo.
    5. Preparare un fissaggio e macchiatura soluzione composta da formaldeide, Hoechst 33342 e PBS (phosphate-buffered saline) per una concentrazione finale in ciascun pozzetto di formaldeide al 4% e 5 ug/mL di Hoechst 33342. Se necessario, provare un più elevato (ad es. 7.5 ug/mL) o la concentrazione più bassa (ad es. 2 ug/mL) di Hoechst se il segnale è troppo debole o troppo forte, rispettivamente.
    6. Pipettare 30 μL della soluzione di fissaggio e colorazione direttamente in tutti i pozzetti. Incubare le piastre per 30 min a 37 ° C. Conservare le piastre a 4 ° C. Se si usa un microscopio non confocale, lavare le piastre con PBS utilizzando una rondella di piatto; nella maggior parte dei casi, il lavaggio è inutile quando si utilizza un microscopio confocale.
    7. Sviluppare uno script per quantificare il numero di cellule per pozzetto.
      Nota: Ci sono diversi software suite disponibili per questo scopo e, mentre ciascuno può avere diversi modi di generare script, tutti generalmente hanno un mezzo per identificare i nuclei, celle e aree di interesse, nonché calcolo intensità e proprietà morfologiche. Durante lo sviluppo di uno script di screening, è importante considerare il tempo necessario per eseguire lo script per piastra e forse includere solo essenziali misure per ridurre al minimo il tempo di elaborazione. Ad esempio, per quantificare il numero delle cellule, uno potrebbe calcolare l'area di Hoechst per pozzetto sopra un'intensità specificata; e per quantificare la diffusione di virus, uno potrebbe calcolare l'area di (proteina fluorescente verde) GFP per pozzetto sopra un'intensità specificata. Lo script "avremmo avuto" dovrà essere paragonato allo script più elaborate per garantire che nessuna informazione essenziale è persa.
    8. Analizzare i risultati per determinare le condizioni ottimali di transfezione, che è la quantità di reagente di transfezione e la cella semina densità che provoca la morte cellulare significativo (0-30% sopravvivenza delle cellule) ed è minimamente tossico per le cellule (per esempio 90-100% sopravvivenza delle cellule). Nota: Potrebbe richiedere più tempo per osservare il fenotipo di morte delle cellule nelle linee cellulari con tempi di raddoppiamento lungo. Vedere Figura 2B e 2C per risultati rappresentativi. Inoltre, assicurarsi che le cellule trasfettate con siRNA di targeting sono circa 90-100% confluenti al momento della fissazione, come più tardi uno vuole infettare le cellule che sono di questa confluenza.
  2. Determinazione della lunghezza dell'infezione e la quantità ottimale di virus
    1. Eseguire la stessa procedura di trasfezione inverso, come descritto in precedenza (Vedi 1.1.4.1 a 1.1.4.4); Tuttavia, utilizzare solo le condizioni ottimali di transfezione (Vedi 1.1.8) (ad es. per 786-O cellule: 1500 cellule/pozzetto e 0,05 µ l/pozzetto di RNAiMAX) e, inoltre, includono pozzi supplementare per essere infettati con virus [es. pozzetti con cellule non trattate, finte transfected le cellule, le cellule trasfettate con siRNA non targeting e cellule trasfettate con i controlli positivo del virus, se quelli sono noti (cioè siRNA geni ospitanti che saranno inibire o migliorare replica di targeting)].
      1. Per un esempio di layout di piastra, vedere Figura 3A . Incubare per 48-72 h.
    2. I pozzi di virus aggiuntivi di infettare con un virus oncolytic che esprime una proteina fluorescente reporter (ad es. GFP) con una gamma di molteplicità di infezione (MOIs) (ad es. 0,001 a 10; L'intervallo scelto essere dipenderà il livello di resistenza o suscettibilità della linea cellulare.). Comprendono non infetti pozzi pure. Dispensare 40 µ l di ciascuna diluizione di virus per pozzetto per un volume finale di 80 µ l. Centrifugare ogni piatto a 400 x g per 30 min a temperatura ambiente.
    3. Dopo l'infezione, le cellule vivono con un alto contenuto, immagine automatizzato microscopio a intervalli regolari (ad esempio ogni 4-8 h). Vedere Figura 3B e 3C.
    4. Sviluppare uno script per quantificare la diffusione di virus (ad es. area di GFP per pozzetto) (Vedi 1.1.7). Analizzare le immagini e selezionare un punto di tempo e un MOI che consentono il rilevamento di aumenti e le diminuzioni in diffusione. Garantire il tempo-punto e MOI caduta all'interno di un intervallo lineare per facilitare l'individuazione di piccoli cambiamenti nella diffusione. Stimare il fattore Z (o Z') per il punto di tempo determinato e MOI.
      Nota: Stima Z-factor = 1-3 (σp + σn) / | μp- μn|, dove σp è la deviazione standard del campione dei controlli positivi virus e σn è la deviazione standard del campione del virus negativo controlli; e μp è la media del campione dei controlli positivi virus e μn la media del campione dei controlli negativi. Un fattore Z stimato pari a 0.5 - 1.0 è considerata un eccellente saggio e adatto per lo screening di20,21.
    5. Confermare che il siRNA di controllo negativo virus non ha alcun impatto sulla replicazione del virus confrontandolo con i finti pozzetti trasfettati e non trattati. Spesso è necessario testare più controlli negativi come alcuni negativo siRNA controlli possono avere un impatto sulla replicazione del virus.
  3. Validazione finale del test di screening ad alta resa
    1. Ripetere i punti 1.2.1 e 1.2.2 sopra, ma solo questo tempo infettare le cellule con il MOI ottima. Invece di immagini dal vivo, difficoltà e macchia la piastra (come descritto in 1.1.5 e 1.1.6) presso l'ottimale punto di tempo (cfr. 1.2.4).
    2. Immagine della piastra. Analizzare i risultati utilizzando lo stesso script che verrà utilizzato per lo schermo (Vedi 1.1.7 e 1.2.4). Confermare le condizioni di transfezione (cioè buona atterramento in pozzi transfected con controllo positivo transfezione e tossicità minima in pozzi transfettate con controllo negativo transfezione). Stimare il fattore Z per determinare l'affidabilità del test (cfr. 1.2.4).
  4. Ulteriori test e considerazioni per lo svolgimento di screening ad alta resa
    1. Testare la resistenza delle piastre microtiter come alcuni piatti possono spaccarsi durante la centrifugazione, soprattutto quando le palpebre sono tenute e piastre multiple sono centrifugati in una sola volta. Per ridurre il cracking, centrifugare senza i coperchi (fornito le piastre hanno guarnizioni), o diminuire il numero di Lastre centrifugate per secchio.
    2. Testare la stabilità della miscela reagente di transfezione nel corso del tempo. Una volta che il reagente di transfezione è aggiunto ai piatti, ci può essere un ritardo significativo prima dell'aggiunta delle cellule; Pertanto, è importante conoscere il periodo di tempo per cui il mix di reagente di transfezione rimarrà efficace. Per lo schermo, può essere necessario per preparare le celle prima di aggiungere la miscela di reagente di transfezione alle piastre.
    3. Preparare per l'utilizzo del dispenser liquido. Determinare i volumi richiesti per erogare reagente di transfezione, cellule, virus e difficoltà tenendo conto del volume che le stive della tubazione, il volume perso a pre-erogazione (se l'unità ha questa caratteristica) e il volume residuo richiesto nelle bottiglie utilizzate per di erogazione.
      1. Impostare e testare i programmi che verranno utilizzati per l'erogazione del virus, cellule e reagente di transfezione. Per ridurre al minimo la perdita di reagente di transfezione, limite, se possibile, il numero di pre-dispensa. Stabilire un protocollo per calibrare il dispenser liquido e prova la sua accuratezza e precisione.
    4. Predisporre per l'erogazione di massa di virus, cellule e reagente di transfezione
      1. Determinare innanzitutto il numero di piastre da elaborare in un unico lotto considerando il numero di piastre di cellule che possono concretamente essere tripsinizzate in una sola volta, il numero di piastre di microtitolazione che può essere centrifugato in una volta, la lunghezza del tempo necessario per elaborare un batch di piastre con il dispenser liquido e anche il tempo necessario per l'imaging. Nota: Generalmente, circa 30 piastre di elaborazione in un momento sono abbastanza fattibile e l'elaborazione 3 batch delle piastre è gestibile in un giorno.
      2. Empiricamente verificare il volume di reagente di transfezione necessaria per elaborare un batch di piastre. Prova che questo volume è adeguato di erogazione 5 μL di acqua distillata più volte attraverso una piastra nell'equivalente numero di volte che è necessario per elaborare un batch.
      3. Per garantire la distribuzione uniforme delle cellule, stimare il tempo necessario per erogare le cellule attraverso una serie di piastre. Preparare una bottiglia contenente il volume di cellule necessarie per un batch e dispensare le celle in più colonne di una piastra alla volta, a intervalli regolari nel corso stesso del tempo che ci vorrà per erogare tutta una serie di piastre. Verificare quante volte sarà necessario miscelare le cellule per mantenere una distribuzione uniforme delle cellule.
      4. Per garantire la distribuzione uniforme dei virus, ripetere la stessa procedura come sopra (Vedi 1.4.4.3), ma questa volta virus sul confluente pozzi di erogazione. Se il virus non è uniformemente distribuito, considera preparando il virus in tubi conici e Vortex ogni provetta prima dell'erogazione.
    5. Monitorare la crescita delle cellule per determinare la sequenza temporale per crescere abbastanza cellule per lo schermo. Inoltre, determinare il numero medio di cellule che può essere raccolto per piastra di cellule che crescono in fase di log al fine di essere in grado di stimare il numero richiesto per lo schermo.
  5. Procedura di preparazione finale per high throughput screening
    1. Fino a un mese prima di iniziare lo screening, determinare tutti i materiali necessari per lo schermo. Ordinare eventuali reagenti richiesti (Vedi materiali). Garantire la quantità di virus è a disposizione (preferibilmente, utilizzare la stessa riserva che è stata utilizzata durante l'ottimizzazione.).
    2. Fino a due settimane prima di iniziare lo screening, scongelare e crescere le cellule necessarie per lo schermo. Garantire la disponibilità della centrifuga e centrifuga quadrati secchi.
    3. Durante la settimana prima di iniziare lo screening, preparare supporti bottiglie per la transfezione inversa e infezione, uno stock di etanolo al 70%, 2 diluente di reagente di transfezione X (es. 2 X Opti-MEM), se necessario (ad es. se la libreria di siRNA è diluita in RNase-free acqua, uno desidera utilizzare 2 X a transfect cellule) e le aliquote di virus (uno per ogni batch di piastre). Verificare la condizione delle cellule.
      1. Preparare una soluzione stock di macchia di Hoechst 33342 (ad es. 5 mg/mL). Preparare un piatto di equilibrio se uno sarà richiesto per centrifugazione.
      2. Garantire che la rondella di piatto è in buone condizioni se verrà utilizzato. Garantire che il dispenser liquido è erogazione e correttamente calibrato con esattezza e precisione. Inoltre, assicurarsi che i programmi siano impostati correttamente sul dispenser liquido.

2. condurre lo schermo primario a resa elevata

Nota: Prima di iniziare lo schermo di RNAi, piastre di microtitolazione (ad es. piastre da 384 pozzetti) ha bisogno di essere schierati con la libreria di siRNA e controlli di screening. I passaggi seguenti sono meglio condotte da due persone con una sola persona (ad es . A persona) essere principalmente responsabile per l'erogazione il reagente di transfezione e celle tra le piastre e la seconda persona (cioè persona B) è responsabile per centrifugazione le piastre immediatamente prima di transfezione e per preparare le celle. Sono inclusi tra parentesi alcune specifiche per l'elaborazione di un batch di 33 piastre (cioè metà della libreria) con la linea 786-O cellulare.

  1. Preparazione per la transfezione inversa
    1. R: persona Posto abbastanza media, tripsina e PBS necessarie per elaborare un batch di piastre in bagnomaria a 37 ° C. Opzionale: Tripsinizzano un piatto di cellule e contare il numero di cellule per piastra al fine di fornire una stima in tempo reale del numero di piastre necessarie per ogni batch.
    2. Ottenere un lotto di (ad es. 33 piastre) dal freezer e aspettare 20-30 min per consentire le piastre scongelare. Mentre le piastre sono lo sbrinamento, continuare con i passaggi seguenti.
      1. Persona r: dispensare in 50 mL conica tubi la quantità di diluente di reagente di transfezione necessarie per l'elaborazione di un batch di piastre (ad es. 2 x 37.125 mL) e metterli in una vasca di acqua di 37 ° C. Riempire due bottiglie con etanolo al 70% (es. bottiglie di 250-500 mL). Riempire due provette coniche da 50 mL con PBS e uno con acqua distillata.
      2. Persona r: immergere il dispenser liquido tubo in una bottiglia di etanolo al 70%. Se tutti i suggerimenti non si utilizzerà per il dosaggio del reagente di transfezione (ad es. se non vengono utilizzati i pozzetti della piastra esterni), scollegare la tubazione inutili prima. Posizionare un pezzo di nastro adesivo attorno al tubo per segnare il punto sotto la quale il tubo può essere considerato sterile. Prime con circa 25 mL. Versare ulteriore etanolo nella bottiglia per sostituire il volume perso. Lasciate che la tubazione di sedersi in etanolo per un minimo di 5 min.
      3. Persona b: preparare il tripsinizzano cellule. Spruzzare la cappa di coltura tissutale (TC) con etanolo al 70%. Spray e posizionare le pipette necessarie, suggerimenti, bottiglie e tubi del microfuge per preparare le celle nella cappa (Vedi 2.2.1.1 e 2.2.1.2). Centrifugare le piastre sigillate in set a 1026 x g per 2 min a temperatura ambiente. Rimuovere i coperchi delle placche in un cappuccio di TC, se stabilito in precedenza che le piastre potrebbero rompere durante la centrifugazione, quando le palpebre sono mantenute su (Vedi 1.4.1).
    3. Persona r: rimuovere i sigilli delle placche. Prima, durante o dopo i sigilli sono stati rimossi (a seconda della durata dell'incubazione richiesto), dispensare la quantità necessaria di reagente di transfezione (ad es. 375 μL/tubo per una concentrazione finale di 0,05 µ l di RNAiMAX/pozzetto) nelle provette coniche contenente il diluente del reagente di transfezione pre-riscaldato (ad es. 37.125 mL/tubo).
    4. Mescolare pipettando su e giù per 10 volte. Incubare a temperatura ambiente per il tempo prescritto per il reagente di transfezione utilizzato (ad es. 0-10 min).
  2. Invertire la transfezione
    1. Sono persona B completare le seguenti attività.
      1. Iniziano a trypsinizing le cellule (per esempio 3 piastre di 786-O cellule). Aspirare i media da ogni piatto. Sciacquare con 9 mL di PBS. Dispensare 3 mL di tripsina per piastra. Incubare a 37 ° C per circa 5 min. Risospendere le cellule con 22 mL di media. Dispensare su e giù per 10 volte.
      2. Combinare la sospensione cellulare da ciascuna piastra di coltura del tessuto in una bottiglia sterile. Mescolare la sospensione cellulare capovolgendo. Aliquote di 1ml pipetta della sospensione delle cellule in due tubi separati microfuge. Rimuovere un campione da ciascuna provetta microfuge e contare le celle. Calcolare il volume della sospensione di cellule necessarie per la densità necessaria (ad es. 1500 cellule/pozzetto) e preparare abbastanza sospensione cellulare diluito (es. 500 mL) per erogare tutta una serie di piastre.
    2. Sono persona A completare le seguenti attività in parallelo alla persona B.
      1. Svuotare il liquido dispenser tubo di etanolo. Adescare la tubazione con circa 25 mL di PBS e quindi svuotare il tubo. Prestare attenzione nel maneggiare il tubo per garantire che la sezione del tubo sotto il nastro adesivo che sarete immersi nel reagente di transfezione e più tardi in una sospensione cellulare è mantenuto sterile. Contraddistingue le piastre che possono essere fatto in modo sicuro con un tubo conico di soluzione di reagente di transfezione.
      2. Dispensare le soluzioni di reagente di transfezione su e giù 10 volte. Adescare il tubo con la soluzione di reagente di transfezione. Per ridurre al minimo la perdita di reagente di transfezione, prime con appena sufficiente soluzione per cancellare appena le punte. Selezionare il programma corretto sul dispenser liquido e dispensare 5 μl di reagente di transfezione per pozzetto.
        Attenzione: Monitorare attentamente il livello del reagente di transfezione di modo che è rifornito prima che si esaurisca. Il completamento delle piastre che sono distanziati dovrebbero fornire uno spunto per aggiungere più soluzione di reagente di transfezione.
      3. Centrifugare le piastre a 1026 x g per 1 min a temperatura ambiente. Questa volta i coperchi sarà, quindi potrebbe essere necessario centrifugare meno piastre alla volta per evitare di cracking (ad es. 2 piastre per secchio). Incubare le piastre a temperatura ambiente per il tempo prescritto per il reagente di transfezione utilizzato (ad esempio 10-20 min).
      4. Durante l'incubazione, svuotare il tubo della soluzione di reagente di transfezione e metterlo in una provetta conica completo 50 mL contenente PBS. Sciacquare il tubo con circa 25 mL di PBS di riempimento e svuotamento.
        1. Se più delle punte stanno per essere utilizzati per erogazione cellule rispetto a quelli utilizzati per l'erogazione del reagente di transfezione, ricollegare il tubo inutilizzato e risterilizzare tutti i tubi con etanolo al 70% prima di sciacquare il tubo con PBS (Vedi 2.1.2.2).
      5. Mescolare il flacone contenente la sospensione cellulare una volta che è stato preparato. Inserire il tubo nella sospensione delle cellule e basta vedere che ogni suggerimento è erogazione correttamente di prima. Erogare 30 μL per pozzetto della sospensione delle cellule attraverso tutte le piastre. Se necessario, è possibile mescolare la sospensione cellulare a intervalli regolari per evitare la sedimentazione.
        Attenzione: A volte le gocce di sospensione contenente media possono attaccare ai lati delle punte. Quando questo è osservato, aspirare il più presto possibile o pulire con panno tessuto cosparso di etanolo al 70%.
      6. Svuotare il tubo della sospensione delle cellule. Sciacquare il tubo con circa 25 mL di PBS, seguita da circa 50 mL di acqua distillata.
    3. Lasciate riposare per 45-60 min dal momento della semina a temperatura ambiente prima di restituire le piastre nell'incubatore cellulare le piastre. Incubare le piastre in un'incubatrice indisturbata per la lunghezza desiderata del gene silencing (ad es. 48h) (Vedi 1.1.4.5).
  3. Infezione
    1. Per risparmiare tempo, il giorno prima di infettare le cellule, dispensare in sterile bottiglie la quantità precisa di supporto richiesto per infettare ogni lotto di piastre compresi i supporti per i pozzi non infette (es. 2 x 350 mL e 2 x 50 mL per 33 piastre). Inoltre, testare il liquido dispenser per precisione e accuratezza e ri-calibrare se necessario.
    2. Scaldare i media a 37 ° C. Riempire due bottiglie con etanolo al 70%, due provette coniche da 50 mL con PBS e uno con acqua distillata. Verificare che la centrifuga sia a temperatura ambiente.
    3. Sterilizzare il tubo con etanolo al 70% e risciacquare con PBS come precedentemente descritto (Vedi 2.1.2.2 e 2.2.2.1). Mentre il tubo è seduto in etanolo, dispensare il volume preciso di virus necessaria al flacone contenente il supporto precedentemente preparato per l'infezione (cfr. 2.3.1). Sciacquare il tubo con PBS con 25 mL di adescamento e quindi svuotare.
    4. Rimuovere le piastre dall'incubatrice e metterli nel cofano TC. Adescare il tubo con i media. Versare 40 μL di media nei pozzetti di controllo non infetto. Il tubo di supporto di svuotare e sciacquare con 25 mL di PBS. (Vedi 2.2.2.5 per cautela)
    5. Dopo la miscelazione il virus, è necessario posizionare la tubazione al flacone contenente il virus. Dispensare 40 μl di virus attraverso le piastre. Centrifugare le piastre a 400 x g e a temperatura ambiente per 30 minuti. Riporre le piastre nell'incubatore. Incubare le piastre per il precedentemente determinato periodo di tempo (ad es. 24 ore) (cfr. 1.2.4).
  4. Fissaggio e macchiatura delle celle
    1. Per risparmiare tempo, il giorno prima della posa, preparare una bottiglia di fissaggio e la macchiatura soluzione contenente formaldeide e PBS (ad es. 179 mL di formaldeide al 37% e 270 mL di PBS per una concentrazione finale di 4% formaldeide) per ogni lotto di piastre, ma si omette il Macchia di Hoechst. Conservare nell'infiammabile armadietto lontano dalla luce.
    2. Sciacquare il tubo con etanolo al 70% e PBS come precedentemente descritto (Vedi 2.1.2.2 e 2.2.2.1). Aggiungere il volume richiesto di Hoechst (ad es. 2,5 mL di 5 mg/mL di Hoechst per una concentrazione finale nel pozzo di 7,5 μg/mL) per il fissaggio e la macchiatura soluzione e mix.
    3. Dispensare 30 μL di fissaggio e la macchiatura soluzione attraverso tutte le piastre. Posizionare le piastre nell'incubatore per 30 min. A seguito di incubazione, applicare i sigilli alle piastre e memorizzare le piastre a 4° C al riparo dalla luce. Lavare i piatti, se necessario (Vedi 1.1.6).
  5. Imaging e l'analisi di immagine
    1. Con un microscopio automatizzato, ad alto contenuto di immagine le piastre. Utilizzare le impostazioni precedentemente determinate, ma prima testare le impostazioni per garantire che adeguamenti non devono essere fatte.
    2. Quantificare la GFP (o altri reporter fluorescente) zona e zona di Hoechst per bene usando lo script sviluppato in precedenza (cfr. 1.3.2). Testare lo script con una manciata di piastre per determinare se eventuali lievi modifiche devono essere effettuate prima di analizzare tutte le piastre di batch.
    3. Identificare i colpi. Nota: Il robusto metodo Z-punteggio/MAD (deviazione mediana assoluta) è un metodo spesso utilizzato verso questo fine. In genere, punteggi di > 2 o < -2 vengono impostati come cut-off. Questo metodo è consigliabile quando i campioni di siRNA sono distribuiti in modo casuale attraverso le piastre e non, ad esempio, raggruppati per funzione come i campioni vengono utilizzati come controlli negativi de facto . Filtrare il siRNA citotossici come questi dovrebbe diminuire non specifico virus diffuso (vedi discussione per ulteriori dettagli sull'applicazione di filtri citotossici hits).

3. convalida di schermo secondario di successi con la libreria di shRNA TRC (il Consorzio di RNAi)

Nota: Vedi discussione per ulteriori dettagli sulla selezione hits per convalida secondario e possibili tecnologie di retinatura. Se tecnologia siRNA è selezionata per la convalida secondaria, lo stesso protocollo di sviluppo e validazione di test può essere utilizzato come è stato utilizzato per la schermata principale (Vedi 1).

  1. Ottenere una libreria personalizzata di shRNA TRC geni candidati di interesse come scorte di glicerolo di targeting.
  2. Preparare il DNA del plasmide di transfezione qualità provenienti dalle scorte glicerolo. Nota: Un protocollo dettagliato (cioè "ShRNA/sgRNA/ORF glicerolo e preparazione del DNA del plasmide") può essere trovato qui: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  3. Producono lentivirus esprimono shRNA targeting per i geni di interesse con i plasmidi di DNA. Nota: Un protocollo dettagliato per la produzione di lentivirus in piastre da 96 pozzetti [cioè "shRNA/sgRNA/ORF High Throughput produzione virale (ben 96)"] può essere trovato qui: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  4. Infettare le cellule con il lentivirus. Nota: Un protocollo dettagliato per l'infezione lentivirale in piastre da 96 pozzetti (cioè "Lentivirali infezione") è disponibile online presso http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
  5. Infettare le cellule con virus oncolytic entrambi seguente selezione con puromicina (Vedi 3.4 per il protocollo di selezione) di cellule trasdotte con successo o trasduzione immediatamente seguente (senza selezione con puromicina). Per determinare la quantità ottimale di virus e il tempo d'incubazione con virus, utilizzare lo stesso metodo utilizzato per la schermata principale.

4. terziario convalida

Nota: Lo scopo del terziario convalida è principalmente confermare che il colpo è il bersaglio, tumore-specifici e migliora l'efficacia in vivo. Uno può anche verificare se modula diffusione attraverso uno spettro di linee cellulari tumorali

  1. Conferma che atterramento del gene candidato è il bersaglio
    1. Prima di confermare che c'è una correlazione tra fenotipo e silenziamento genico. Utilizzare il test stesso che è stato sviluppato per lo schermo o modificarla per un formato di 6 pozzetti valutare il miglioramento o l'inibizione della diffusione in un formato più grande. Condurre un corso di tempo con cellule trasfettate con siRNA i geni di interesse plus e minus virus di targeting.
    2. Immagine i pozzetti contenenti cellule infettate da virus e raccogliere i lisati cellulari dai pozzetti non infetti a intervalli di tempo regolari. Determinare se esiste una correlazione tra il silenziamento genico e potenziamento o inibizione della diffusione. Valutare il silenziamento genico da reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) e/o macchiarsi occidentale.
    3. Eseguire un esperimento genetico salvataggio per confermare che il colpo è il bersaglio. Nota: In un esperimento di salvataggio tipico, il gene candidato è abbattuto con RNAi mentre allo stesso tempo le cellule transfected transitoriamente con il cDNA di RNAi resistente (ad es. ortologo del gene) che esprimono il gene candidato per determinare se il fenotipo del gene viene ripristinato o "salvato". Possono essere impiegate anche linee cellulari stabili che overexpressing RNAi resistente del cDNA del gene candidato dell'interesse.
    4. In alternativa, invece di un esperimento genetico salvataggio, utilizzare saggi ortogonale multipli per confermare che il colpo è il bersaglio [ad es. verificare se lo stesso fenotipo è ottenuto all'atterramento del gene target con più siRNA, all'atterramento di il gene dell'obiettivo in più linee cellulari stabili che esprimono shRNA contro il gene bersaglio e al momento KO con CRISPR (Clustered regolarmente interspaziati breve ripetizione palindromo)-tecnologia Cas9 in linee cellulari multiple.].
  2. Conferma che il colpo è tumore-specifici e modula la diffusione attraverso una gamma di linee cellulari tumorali
    1. Condurre un dosaggio simile come in 4.1.1, ma con le cellule normali, così come con altre linee cellulari di tumore.
  3. Conferma che la manipolazione del gene candidato migliora l'efficacia in vivo
    Nota: Descritti di seguito sono tre possibili metodi per la manipolazione del gene bersaglio in vivo.
    1. Trovare un farmaco per manipolare il gene bersaglio. Se c'è un farmaco come un inibitore di piccola molecola che gli obiettivi dello stesso gene, amministrarlo con il virus oncolytic in vivo. È importante determinare l'intervallo ottima per la somministrazione del farmaco.
    2. Ingegnere il virus per inibire o iperesprimono il gene bersaglio a seconda se uno desidera per inibire o migliorare il gene bersaglio. Per inibire il gene, ingegnere il virus oncolytic per esprimere un dominante negativo del gene o per shRNA espresso il gene di targeting. Per migliorare l'espressione del gene bersaglio, clonare il virus oncolytic con un transgene che overexpressing il gene.
    3. Ingegnere di cellula con il gene abbattuto o eliminato mediante shRNA o tecnologia di CRISPR-Cas9, rispettivamente. La linea cellulare ingegnerizzati e il selvaggio-tipo cella linea in vivo dell'impianto e successivamente infettare con il virus oncolytic. Nota: Questo metodo serve come un prova-de-principio e può aiutare a determinare se investire tempo e risorse per sviluppare una droga per manipolare il gene in vivo, per esempio, sarebbe utile.

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Representative Results

Nella Figura 1viene presentata una panoramica del flusso di lavoro per identificare gli obiettivi di host per migliorare la terapia virus oncolytic.

Come illustrato nella Figura 1, il primo passo importante per lo svolgimento di uno schermo di RNAi di alto-rendimento è sviluppo di analisi. Figura 2A fornisce un esempio di layout di piastra per l'analisi di ottimizzazione di transfezione. Figura 2B è costituito da immagini rappresentative dei risultati attesi, e nella figura 2 è un complotto rappresentativo dei risultati attesi. A seguito di siRNA atterramento di PLK-1, un gene che induce la morte delle cellule e può essere utilizzato come controllo positivo per monitorare siRNA atterramento efficienza, uno si aspetterebbe la sopravvivenza delle cellule per essere tra 0-30%, a meno che la linea cellulare ha un lungo tempo nel qual caso di raddoppiamento occorreranno l Onger per osservare il fenotipo di morte delle cellule. Gli siRNA di targeting dovrebbe anche essere minimamente tossico per le cellule con una sopravvivenza relativa simile a quella di cellule non trattate.

Un altro elemento chiave di sviluppo di analisi consiste nel determinare il MOI a cui infettare le cellule e la lunghezza del tempo per l'infezione. Figura 3A fornisce un esempio di layout di piastra per determinare la quantità di virus e il tempo d'incubazione con virus. Figura 3B raffigura i risultati di un tempo-corso live di 786-O cellule infettate con Daniele-eGFP (virus di vaccinia virus oncolytic che esprimono GFP avanzata con i geni della timidina chinasi e fattore di crescita di Vaccinia eliminati) a vari MOIs. Immagini rappresentative di cellule infettate con Daniele-eGFP presso un MOI di 0.05 sono mostrati in Figura 3. Sulla base dei risultati tracciati in Figura 3B, uno potrebbe selezionare un MOI di 0.05 e una lunghezza di infezione di h 21 quanto ciò consentirebbe per il rilevamento di aumenti e diminuzioni nella diffusione come questo punto di tempo è all'interno di un intervallo lineare e il fattore Z stimato a questo ti me-punto è 0.6 per coorti che aumentano e per coorti che fanno diminuire la diffusione. Come parte di questo test di convalida, uno desidera fissare le cellule a questo MOI e punto di tempo e calcolare il fattore di Z.

Seguendo il protocollo descritto, abbiamo condotto schermi RNAi genoma attraverso tre linee cellulari di tumore diverso (ad esempio OVCAR-8, U373, NCI-H226) in duplice copia con una libreria di siRNA 18.120 geni15di targeting. Utilizzando il metodo MAD, abbiamo identificato 1008 visite comuni a almeno 2 fuori le linee cellulari di 3 cancro (Figura 4A). Analisi dei percorsi dei successi identificato nelle schermate ha rivelato arricchimento dei membri della UPR (unfolded protein response in) e vie di ERAD (degradazione della proteina del reticolo endoplasmatico-associata) (Figura 4A). Abbiamo selezionato 10 colpi all'interno di queste vie per la convalida secondario utilizzando siRNA con sequenze di destinazione diversi da quelli della schermata principale (Figura 4B). Come parte della convalida terziario, abbiamo condotto un esperimento genetico salvataggio con IRE1α e ATF6α (alfa di fattore 6 del trascrizione d'attivazione) per confermare che questi successi sono stati il bersaglio (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: schema di flusso di lavoro per identificare gli obiettivi di host per migliorare la terapia virus oncolytic. Il primo passo è quello di sviluppare e validare un test per high throughput screening di RNAi, che include l'ottimizzazione delle condizioni di transfezione per l'introduzione del siRNA nelle cellule, determinare la quantità ottimale di virus (cioè MOI) per infettare le cellule con e il tempo d'incubazione con virus. Il secondo passo è quello di condurre una schermata del genoma di alto-rendimento. Una libreria di siRNA targeting geni attraverso l'intero genoma è schierata su piastre di microtitolazione. Le cellule sono poi retromarcia transfected con la libreria di siRNA. Dopo un periodo di incubazione di 48-72 h per consentire per il silenziamento genico, le cellule sono infettate con la quantità ottimale di virus. Dopo la lunghezza ottimale di incubazione con virus, cellule sono fissi e macchiate e successivamente ripreso con un microscopio ad alto contenuto. Successiva analisi di immagine e dati vi aiuterà a identificare i geni che modulano significativamente la replicazione del virus, che sono indicati come "colpi." Una schermata di convalida secondario viene eseguita su selezionare risultati da sullo schermo primario, generalmente utilizzando siRNA o shRNA con regioni di seme differente. Esperimenti di convalida terziario vengono eseguiti per confermare che i colpi sono il bersaglio, tumore-specifici e migliorare l'efficacia in vivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Condizioni di ottimizzazione di transfezione per test di screening di alto-rendimento RNAi. (A) un esempio di layout di piastra per l'ottimizzazione delle condizioni di transfezione con due linee cellulari diverse. (B) immagini rappresentative di 786-O cellule (1500 cellule/pozzetto) colorati con Hoechst 33342 dopo 72 h di incubazione con transfezione reagente diluente da solo (cioè non trattati), reagente di transfezione e diluente (cioè mock transfettate), con non-targeting siRNA e con siRNA targeting PLK-1. (C) rappresentante risultati dal test di ottimizzazione di transfezione risultati 22% sopravvivenza delle cellule trasfettate con siRNA PLK-1 (n = 24) e 94% di sopravvivenza delle cellule trasfettate con siRNA di targeting (n = 8). Barre di errore = ± DS, deviazione standard; scala bar = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: determinazione della quantità di virus e tempo d'incubazione con virus per test di screening di alto-rendimento RNAi. (A) un esempio piastra di layout per ottimizzare la quantità di virus e tempo d'incubazione con virus. Controlli di colonne 1 e 24 contengono la transfezione e sono rimasto non infetti. Colonne 2 a 23 contengono cellule non trattate, finte transfected le cellule e le cellule transfettate con controlli positivi e negativi virus tutti infettati con una gamma di MOIs a partire con nessun virus nelle colonne 2 e 3. (B) 786-O cellule erano inversione trasfettate con siRNA di targeting e incubati per 48 h. Successivamente vennero infettati con Daniele-GFP presso il MOIs indicato ed imaged a intervalli di 8 h a partire da post-infezione 5 ore (hpi). L'area media di GFP per pozzetto (± SD) è stata calcolata per ogni punto di tempo (n = 12) e tracciata sul grafico. Il fattore Z calcolato tra i punti A e B è 0,6 e il Z-fattore calcolato tra i punti B e C è 0,6. (C) rappresentante immagini in diretta di un pozzo infettati con un MOI di 0.05 agli intervalli di tempo indicati. Ingrandimento, x 10; 9 campi/pozzo; scala bar = 200 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Genome-wide Screen identifica ER Stress Response blocco come un potente sensibilizzante di Rhabdovirus-mediata oncolitici. (A) diagramma di Venn, che illustra il numero di colpi sovrapposti di alto-rendimento RNAi schermi in 3 linee cellulari di tumore e una tabella (+, sintetico letale;-, nessuna interazione) e diagramma schematico (colpisce evidenziata in rosso) che illustrano colpi chiave all'interno dell'UPR ed ERAD vie. (B) turni di50 CE (barre nere, asse y di sinistra) sono stati determinati per U373 cellule trattate con il virus di Maraba (48 h) dopo il trattamento con siRNA (72 h) una serie di colpi UPR/ERAD dalla schermata di targeting. Espressione di mRNA relativa per ciascun gene seguendo siRNA atterramento (72 h) è raffigurato in bianco (asse y di destra). (C) saggi di vitalità cellulare sono stati condotti 48 h dopo l'infezione del virus di Maraba, in U373 cellule che esprimono ectopically del mouse ATF6α (o controllo GFP) ± siRNA umano ATF6α di targeting (o non-targeting [NT] controllo; pannello di sinistra) o XBP1(s) umano (o controllo ) ± siRNA umano IRE1α di targeting (o controllare; a destra pannello). Western blot dimostrando silenziamento genico ed espressione genica ectopico sono mostrati. CE50 turni = shift nella dose di virus necessaria per uccidere il 50% delle cellule; Barre di errore = ± SD; XBP1(s) = X-la proteina 1 (splicing); (B), sono stati eseguiti unidirezionali ANOVAs seguita da un Bonferroni il test post-hoc di confronto più per ricavare i valori di p; (C), t-test di student sono stati effettuati per ricavare i valori di p; * p < 0,05; #p < 0.05. (Questa figura è stata modificata da Mahoney et al., 201115). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui presentiamo un protocollo per impiegare HTS RNAi per identificare gli obiettivi di host che possono essere manipolati per migliorare la terapia virus oncolytic. Questo è stato testato con successo con virus oncolytic Maraba e virus vaccinia virus oncolytic, ma, come osservato, può essere adattato per l'uso con altri virus oncolytic o altri virus in genere per identificare geni ospitanti che modulano la replicazione del virus. Il protocollo di screening è inoltre progettato per identificare i geni che aumentano o diminuiscono la diffusione, ma può essere facilmente modificato per altre letture. I nostri schermi con virus di Maraba, per esempio, sono stati progettati per identificare geni modulando oncolitici utilizzando un'analisi semplice basato su resazurin vitale della tintura per segnare la vitalità cellulare (Vedi Figura 4)15. In queste schermate, dopo incubazione con virus, anziché fissare le cellule con formaldeide e colorazione con Hoechst, abbiamo erogato resazurin tintura in ogni pozzetto (concentrazione finale di 20 μg/mL) e, dopo un'incubazione di 6 h, abbiamo misurato assorbanza (573 nm) con un lettore di piastre. Abbiamo potuto anche utilizzare basato sulla macchiatura di Hoechst come una lettura del numero di cellulare. Mentre usando un reporter di surrogato per monitorare la replica del virus era inutile in questa schermata, vivono un virus con una proteina reporter, particolare di una proteina fluorescente facilitare l'ottimizzazione dello schermo come uno può, ad esempio, monitorare la replica del virus; Inoltre, un virus con una proteina reporter è meno ingombrante e costosa rispetto all'utilizzo di anticorpi a macchiare per gli antigeni virali, ma è possibile allo schermo senza uno. Inoltre, si potrebbero fare anche ulteriori modifiche per il dosaggio di indagare i fattori ospite che incidono sulla infettività, dimensione burst e ancora più dettagliati fenotipi come la morte delle cellule immunologiche. In ogni caso, uno seguirebbe un simile protocollo di sviluppo analisi, strategia e metodi di convalida secondaria e terziaria di screening.

Nel protocollo, si consiglia di ottimizzare le condizioni di transfezione idealmente con più linee cellulari di tumore. Ci sono almeno due ragioni per l'ottimizzazione con linee cellulari multiple. Una ragione è che non ogni linea cellulare sia soggetta a screening ad alta resa, come alcuni possono essere difficili a transfect o può non aderiscono bene, ma dei motivi principali è quello di consentire lo screening con linee cellulari multiple al fine di evitare distorsioni intrinseche delle cellule. La scelta delle varietà di cellula dipende in larga misura dai propri obiettivi. Si può scegliere di concentrarsi su un tipo particolare di cancro o di selezionare i tipi di cancro più disparate per coprire uno spettro più ampio. In alternativa, si potrebbe desiderare di concentrarsi su linee cellulari tumorali che sono resistenti a identificare fattori dell'ospite che possono essere manipolati per rendere le linee cellulari di tumore meno resistenti all'infezione del virus oncolytic.

Oltre alla selezione di linee di cellule, la selezione di controlli positivi e negativi virus è una considerazione importante per qualsiasi schermo. In alcuni casi, i geni di virus che sono necessari o limitano la replica non possono essere conosciuti o, se sono noti, possono essere cellula-specifico. Di conseguenza, si può determinare la robustezza approssimativo e la gamma dinamica del dosaggio utilizzando i controlli surrogati. Ad esempio, uno potrebbe usare le cellule non infette o cellule infettate con un basso MOI come controllo positivo surrogato per identificare i geni che fanno diminuire la diffusione all'atterramento. Per identificare i geni che aumentano la diffusione su atterramento, uno potrebbe infettare le cellule con una serie di diluizioni di virus e utilizzare pozzetti con il segnale massimo come controllo positivo surrogato.

Selezione di successi per la convalida di schermo secondario e il tipo di tecnologia da impiegare è un'altra questione che richiede un'attenta riflessione. I candidati sono selezionati generalmente per la convalida di schermo secondario basata sulla grandezza del colpo, il se si modula significativamente diffusione in linee cellulari di cancro multiple (se schermi primari sono stati condotti in linee cellulari multiple) e su interesse biologico. Strumenti di bioinformatica come DAVID22,23, PANTHER24, STRING25 e26 di PINdb possono aiutare a isolare i percorsi e visite di interesse biologico. Mercer et al. 8 descrivere l'uso di open source software di analisi e hanno anche messo a disposizione un algoritmo che hanno sviluppato per la visualizzazione e l'analisi dei successi. Uno dei fattori da prendere in considerazione quando si interpretano i risultati è quella del silenziamento genico può avere impatti diversi a seconda della fase nel ciclo di vita del virus che sta studianda. Ad esempio, è possibile che colpo di un gene presto nel ciclo di vita può inibire la replicazione del virus, mentre atterramento in una fase successiva può aumentare la replica. Spesso, schermi secondari sono condotte con siRNA da un fornitore diverso con regioni di seme differente con più siRNA per gene. Tuttavia, tecnologie complementari targeting geni candidati possono essere impiegati come vettori CRISPR-Cas9 o lentivirus esprimenti shRNA.

Il metodo di analisi è anche una considerazione critica. Suggeriamo qui utilizzando il robusto Z-score o suggerito MAD20,27 con cut-off per la chiamata hit di > 2 o < -2. Il cut-off può essere aumentato o diminuito a seconda che il focus sia eliminando più falsi positivi o di catturare più falsi negativi. Per esempio, in uno schermo di alto-rendimento recente con vaccinia virus9, il cut-off inferiore è fissato a -1.5 (no cut-off superiore sono stati descritti come il focus è stato sull'identificazione di geni che è diminuito di diffusione su atterramento). Ci sono anche altri metodi che possono essere impiegati compreso il z-score, SSMD (differenza media rigorosamente standardizzata) e la B Punteggio20,28,29,30. Barrows et al31 rispetto a liste dei risultati generate dal rango di somma, MAD, z-score e SSMD e trovato che ogni metodo di analisi ha provocato diverse liste di colpo. In toto, non c'è nessun metodo perfetto o cut-off. In definitiva, gli studi di convalida convalida e terziario di schermo secondario confermerà veri successi.

Il metodo di filtraggio citotossici colpi deve anche essere considerato. Un modo è di condurre gli schermi primari in parallelo più o meno virus. Questo permette la rilevazione di siRNA che sono citotossici per conto proprio. Questo era il nostro approccio nel nostro Maraba virus schermi15; Tuttavia, questo non è spesso pratico. Forse un metodo più pratico, oltre ad essere robusto, è per l'accertamento di hits che sono citotossici come parte della secondaria schermata convalida, soprattutto se la messa a fuoco è quello di identificare hits che diminuzione la replica all'atterramento. Per esempio, in uno schermo primario intero genoma con virus Myxoma, Teferi et al. 11 identificato 1.588 siRNA che è diminuito di replicazione del virus all'atterramento. Per filtrare gli siRNA citotossici, hanno condotto una schermata secondaria citotossicità con questi siRNA; hanno misurato la cellula attuabilità 72 h post-transfezione utilizzando un'analisi di attuabilità cellulare basato su resazurin. SiRNAs citotossici sono stati identificati basato su uno Z-score ≤-1.96. Un altro approccio è quello di filtrare semplicemente citotossici siRNAs dai dati screening primario basati su una riduzione del numero delle cellule di una certa percentuale, ad esempio, di una riduzione > 50% come Sivan et al. 9, o sulla base di un punteggio particolare come Lee et al. 14; nel loro studio di fattori dell'ospite, necessaria per la replicazione del virus di stomatite vescicolare, essi esclusi colpi di siRNA che ridotta vitalità cellulare > 3.0 deviazioni standard dalla media. Il numero medio di cellule è stato determinato in base alla Hoechst colorazione dei nuclei delle cellule e, anche se non esplicitamente indicato, la media apparentemente è stata calcolata su una base a piastra, come è chiaro che la media segnale GFP è stata calcolata su una base a piastra.

Una limitazione di qualsiasi schermata di RNAi di alto-rendimento è il frequente elevato numero di falsi positivi e negativi, che possono venire in conseguenza la progettazione di test, la tecnologia utilizzata o attraverso errori sistematici. Ad esempio, una proteina può influenzare significativamente la replicazione del virus, ma il tempo scelto per il silenziamento genico può essere troppo breve dato emivita della proteina per rilevare il suo effetto che conduce a un falso negativo in virtù del progetto assay. È assodato che atterramento incompleta e gli effetti di fuori bersaglio della tecnologia siRNA possono anche introdurre falsi positivi e negativi. Errori sistematici, come ad esempio l'effetto bordo32, possono generare risultati fuorvianti come bene. Qui il segnale nei pozzetti della piastra esterni potrebbe essere sistematicamente superiore o inferiore rispetto al resto della piastra a causa dell'evaporazione. Ci sono strategie per affrontare alcuni di questi problemi tra cui, ad esempio: diminuendo la concentrazione di siRNA per ridurre gli effetti fuori bersaglio33, riconfigurare il layout della piastra per riempire i pozzetti esterni con i media per attenuare l'effetto di bordo o che impiegano metodi di calcolo che sono stati sviluppati per rilevare e contrastare gli errori sistematici quali l'effetto bordo32,34,35. Un metodo generale per trattare con falsi positivi è di condurre una schermata secondaria seguito sullo schermo principale. Come un modo di trattare con falsi negativi, uno può rilassarsi il cut-off per la chiamata hit e includono potenziali falsi negativi per selezione secondaria. Questo, naturalmente, non catturerà falsi negativi che sono ben di sotto del cut-off. Gli schermi primari dovrebbero essere effettuati anche in doppio o triplice copia per limitare i risultati spuri. In definitiva, non importa quali strategie sono impiegate, schermo di alto-rendimento non identificherà esaustivamente tutti i veri successi, ma può fornire un tesoro di dati da cui uno è probabile che alcuni colpi importanti che possono essere capitalizzati al momento della miniera.

In questo protocollo, abbiamo descritto l'utilizzo di siRNA disposte e tecnologia di shRNA, anche se un'altra alternativa è l'uso di shRNA in pool e librerie CRISPR-Cas9. Una libreria di shRNA pool è stata impiegata nella Workenhe et al. 12 Studio illustrato nell'introduzione. Pool CRISPR-Cas9 tecnologia è stata utilizzata per condurre gli schermi su scala genomica per identificare fattori di host richiesti per la replicazione del virus come virus36Zika, virus37,38West Nile, virus di febbre rompiossa39 ed epatite C virus39. Il vantaggio dell'utilizzo di librerie di pool è che sono meno costosi per l'acquisto, non richiedono infrastrutture specializzate (per esempio liquido gestione dispositivi, i microscopi ad alto contenuto e attrezzature robotizzate), né hanno alti costi di funzionamento e il mantenimento di questa infrastruttura, e richiedono meno materiali di consumo. Lo svantaggio è che i tipi di letture sono più limitati. Nelle schermate di interazione ospite-virus maggior parte se non tutti riuniti biblioteca fino ad oggi, la lettura è la vitalità cellulare o mancanza; uno non può prontamente sonda per fenotipi più complessi. La scelta del formato dipende la domanda biologica.

Gli avanzamenti nella tecnologia di screening genetico durante i parecchi decenni passati che prime schermate abilitati in batteri e lieviti per ora attuali schermi su scala genomica in cellule umane hanno aperto la porta spalancata per la scoperta nei vari campi di studio. Questi schermi genetici non solo ci hanno permesso di rispondere alle domande fondamentali della biologia, ma ci hanno dato le chiavi di sblocco intuizioni sviluppando e migliorando biotherapeutics. Mentre ci sono ancora lezioni da imparare e sfide da superare con questa tecnologia, i risultati fino ad oggi sono stati entusiasmanti. Le scoperte saranno probabilmente ancora maggiore come romanzo tecnologia comprese le biblioteche CRISPR-Cas9 di screening, microfluidica e in vivo tecnologie di retinatura continuano a maturare.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni da Ontario Institute per ricerca sul cancro, la Fondazione canadese per l'innovazione, l'Ottawa Regional Cancer Foundation e l'Istituto di ricerca di Terry Fox. K.J.A. è stata sostenuta da un Vanier Canada Graduate Scholarship, un Istituto canadese per la salute-Master di ricerca Award e una borsa di studio laureato di Ontario.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables
siRNA library GE Dharmacon G-005005-02
Corning 384-well plate Corning 3985
Falcon 384-well plate Becton Dickinson 353962
Water Sigma W4502
siGenome SMARTpool PLK1 GE Dharmacon M-003290-01
AllStars Negative Control siRNA Qiagen SI03650318
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 GE Dharmacon D-001206-14-20
DMEM/HIGH Glucose GE Healthcare Life Sciences SH30022.01
Fetal Bovine Serum Sigma F15051-500ML
HEPES solution (1M) Sigma H3535-100ML
Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare Life Sciences SV30010
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 2500056
DPBS/Modified GE Healthcare Life Sciences SH30028.02
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778100
Oligofectamine Thermo Fisher Scientific 1225011
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 22600-050
Resazurin sodium salt Sigma R7017-5G
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H21492
Formaldehyde (37% by weight) Fisher Scientific F79-4
500 ml bottles Corning 430282
Adhesive Sealing Film For Microplates Excel Scientific 361006007
Peelable Heat Sealing Foil Thermo Fisher Scientific AB-3720
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette Fisher Scientific 11-120-625
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
MicroFlo Select (liquid dispenser) Fisher Scientific 11120621
BioTek Synergy HT plate reader Biotek N/A
Opera Imaging and Analysis Instrument PerkinElmer HH10000115
KiNEDx Robotic Arm Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) KX-300-660
Cytomat 24C Series Automated Incubator Thermo Fisher Scientific 50080227
JANUS Automated Workstation PerkinElmer AJI4M01
Plate Carousel Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) N/A
Alps 3000 plate sealer Thermo Fisher Scientific AB-3000

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References

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Ricerca sul cancro problema 134 Oncolytic virus RNAi schermo ad alta produttività cancro vaccinia rhabdovirus cella host genomica funzionale
Genome-wide RNAi Screening per identificare i fattori ospite che modulano la terapia Virus Oncolytic
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Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, … More

Allan, K. J., Mahoney, D. J., Baird, S. D., Lefebvre, C. A., Stojdl, D. F. Genome-wide RNAi Screening to Identify Host Factors That Modulate Oncolytic Virus Therapy. J. Vis. Exp. (134), e56913, doi:10.3791/56913 (2018).

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