Summary
여기 우리는 프로토콜 설명 높은 처리량 RNAi 심사 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 폭로를 위한, 특히 rhabodvirus 및 vaccinia 바이러스 치료, 하지만 그것은 다른 oncolytic 쉽게 적용할 수 있습니다 바이러스 플랫폼 또는 변조 바이러스 복제를 일반적으로 호스트 유전자 발견.
Abstract
높은 처리량 게놈 넓은 RNAi (RNA 간섭) 심사 기술 바이러스 복제에 영향을 주는 호스트 요소를 발견 하기 위해 널리 사용 되었습니다. 여기 우리는 특별히 치료를 향상의 목표와 라바 바이러스는 oncolytic rhabdovirus, vaccinia 바이러스의 복제를 조절 하는 잠복 호스트 대상에이 기술의 응용 프로그램을 제시. 이 방법은 다른 oncolytic 바이러스에 적용 이며 또한 포유류 세포에 있는 바이러스 복제를 조절 하는 호스트 대상 식별 하는 데 이용 될 수 있다 사용 oncolytic 라바 바이러스와 oncolytic vaccinia 바이러스에 대 한 프로토콜 테스트 하는 동안 일반. 이 프로토콜 개발 및 포유류 세포, 주요 고려 사항 및 기본 높은 처리량 RNAi 스크린, 그리고에 대 한 단계별 가이드를 실시 하기 위한 중요 한 준비 단계에서 높은 처리량 RNAi 심사에 대 한 분석 결과의 유효성 검사에 설명 합니다. 실시 하는 주 높은 처리량 RNAi 스크린; 또한, 그것은 광범위 하 게 보조 화면 유효성 검사와 3 차 검증 연구를 수행 하기 위한 방법을 설명 합니다. 검사는 광범위 하 고 편견 패션, 바이러스 복제를 하나 infectivity, 등 생체 외에서 시험을 개발할 수 있습니다의 모든 측면을 변조 호스트 요소에에서 카탈로그를 하나 수 있다는 높은 처리량 RNAi의 혜택 버스트 크기, 그리고 세포 독성입니다. 그것은 biotherapeutic 대상 외 현재 지식 기반을 밝히기 힘이 있다.
Introduction
높은 처리량 게놈 넓은 RNAi 심사 공개 연구 바이러스 생물학 등의 다양 한 분야에서 생물 학적 통찰력을 위한 도구로 입증 되었습니다. 지난 십년 동안 수많은 그룹 인데요 셀 기반 대규모 RNAi 심사 광범위 하 게 변조 바이러스 복제 (,12,3,4 검토 됨 호스트 유전자를 식별 하 , 5 , 6 , 7). 흥미롭게도, 이러한 스크린 수가 많은 암 세포와 바이러스에 현재 oncolytic 바이러스 vaccinia 바이러스8,9,10 포함 하 여 여러 실시 되었습니다 , Myxoma 바이러스11, 포진 심 플렉스 바이러스12, vesicular 구내 염 바이러스13,14및 마 라바 바이러스15. 이러한 연구의 대부분의 초점은 바이러스 복제의 일부 측면에 영향을 주는 호스트 요소 식별에 그리고 oncolytic 바이러스 치료 향상을 위한 biotherapeutic 목표 식별에 동안, 귀중 한 데이터에 이러한 데이터 세트에서 채굴 수 있습니다. 이 관계. 그것은 분명 그 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 식별 하는 강력한 잠재력 하지 완전히 악용 되어.
Oncolytic 바이러스 플랫폼의 과다는 현재 단계의 임상 시험 될지도 성공 했다는 헤 르 페 스 단순 바이러스 reovirus, vaccinia 바이러스를 포함 하 여 전 임상 및 임상 연구에서 테스트 되 고 있습니다. 이러한 플랫폼의 대부분에 대 한 노력 강화 치료를 변경 바이러스 게놈 향해 감독 되었습니다. 예를 들어, 종양 특이성을 증가, 특정 바이러스 유전자가 되었습니다 삭제 하거나 크게 정상 세포, 종양 세포에만 바이러스의 복제를 제한 하려면 변경 합니다. 경우에 따라 transgenes 추가 되었습니다 GM-CSF (granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자) 면역 응답 약효를 또는 NIS (나트륨 요오드 화물 symporter) 에서 생체 내 이미징 및 세포 radioiodide 통풍 관 같은 치료 용도입니다. 그러나, 아주 작은 작업 호스트/종양 유전자를 조작 하 고 호스트/종양 유전자 oncolytic 바이러스 복제에의 영향을 탐구에 집중 되었습니다. 높은 처리량 검열 기술의 도래와 함께 그것은 지금 게놈 규모에 주인 바이러스 상호 작용을 조사 하 고 호스트 게놈 oncolytic 바이러스 치료 향상을 조작 하는 기회를 해독 가능 (16, 에서 17,18).
우리는 첫 번째 연구 설명-의 증거-개념 높 처리량 유전자 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 대상 호스트를 식별 하기 위해 심사를 사용 하 여에 대 한 보고. 라바 바이러스 oncolysis, 현재 단계에서 테스트 중인 oncolytic rhabdovirus 변조 호스트 유전자를 I 및 II 시험, 우리 게놈 넓은 RNAi 스크린에 걸쳐 실시는 siRNA (짧은 방해 RNA)와 중복에서 3 다른 종양 세포 라인 18,120 유전자15를 대상으로 하는 라이브러리. 조회 화면에서 확인 된 경로 분석 응급실 (바인딩과 그물) 스트레스 응답 경로 구성원의 농축을 밝혔다. 우리는 그 기본 화면에서 다른 대상 시퀀스와 siRNA를 사용 하 여 보조 유효성 검사에 대 한 이러한 경로 내에서 10 안타를 선택. 3 차 유효성 검사의 일환으로, 우리는 IRE1α와 구조 실험을 실시 (inositol 필요한 효소 1 알파)를 대상에 적중 되었는지 확인. 생체 외에서 그리고 vivo에서 IRE1α의 작은 분자 억제 물을 사용 하 여 테스트 결과 극적으로 향상 된 oncolytic 효능.
Workenhe 외. 12 또한 실시 풀링된 lentiviral shRNA (짧은 헤어핀 RNA)를 사용 하 여 게놈 넓은 RNAi 스크린 인간 포진 심 플렉스 바이러스 제한 호스트 요소를 식별 하는 16,056 유전자를 대상으로 하는 라이브러리 타입 1 (HSV-1) 돌연변이 KM100 중재 oncolysis의 유 방 암 세포입니다. 기본 화면에서 그들은 343 유전자 모의 감염 세포; 이상 KM100 감염 세포의 향상 된 세포 독성 이어질의 최저 확인 그들은 선택 보조 유효성 검사에 대 한 이러한 유전자의 24. 24 유전자 중 8 유전자는 그들 중 하나는 보조 화면에서 확인 되었다 SRSF2 (2 요소 떠들고/아르기닌 풍부한 접합) 이후 3 차 유효성 검사 중 유전 구조 실험을 사용 하 여 확인 했다 되 고. 그룹의 식별을 DNA topoisomerase 억제제 화학요법 SRSF2의 인 산화를 감소를 보여주었다 TUBO 종양 방위 쥐의 확장된 생존에이 억제제 리드와 함께 HSV-1 KM100의 조합 치료에 갔다.
앞서 언급 한 연구에서 비슷한 워크플로 뒤를 이었다. 각 보조 화면 기본 화면에서 확인 하는 조회 수의 선택 수에 따라 기본 게놈 넓은 RNAi 스크린으로 시작 했다. 이 히트 대상에 했다는 포함 3 차 검증 연구에 의해 그 뒤를 이었다 유전 수행 하 여 대상 유전자 제품 비보를 조작 하 여 수행 하는 궁극적인 유효성 검사 실험 체 외에 구조. 이 문서에서는, 우리는 먼저 개발 및 최적의 transfection 조건, 바이러스, 및 감염의 길이 결정 하는 포함 한다 높은 처리량 siRNA 심사 분석 결과의 유효성 검사에 대 한 일반적인 프로토콜 제공. 높은 처리량 siRNA 화면으로 보조 화면 유효성 검사와 3 차 유효성 검사를 수행 하기 위한 방법에 대 한 전반적인 설명을 우리는 또한 주를 실시 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다.
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Protocol
1. 개발 및 분석 결과 심사 하는 높은 처리량 siRNA의 유효성 검사
참고: 모든 실험, Hepes 버퍼링 성장 미디어 각 셀 라인에 대 한 적절 한 사용 합니다. 3 차 검증 분석 결과 최적화에서 워크플로 개요 그림 1 을 참조 하십시오.
- 최적의 transfection 조건의 결정
- 종양 세포 선을 선택 또는 이상적으로 여러 종양 세포 transfection 조건 (예: 786-O, NCI H226, SF268, U373, OVCAR 8, U20S; 참조 셀 라인의 선택에 대 한 자세한 토론)을 최적화 하는 라인.
- Transfection 시 약 또는 여러 테스트를 선택 합니다. 그것은 일부 더 독성 또는 특정된 셀 라인에 다른 사람 보다 효율적인 수 있습니다 여러 transfection 시 약을 테스트 하려면 필요할 수 있습니다. 또한, 일부 바이러스 감염에 영향을 줄 수 또는 영상에 높은 배경 신호를 생성할 수 있습니다 명심 하십시오.
- 긍정적인 결정 [e. g. 세포 죽음을 유도 PLK 1(Polo Like Kinase 1) mRNA를 표적으로 하는 siRNA] transfection 컨트롤 (예: 비 대상으로 siRNA)을 부정.
- Transfection 시 약 (예를 들어 0.05, 0.1, 0.15 0.2 μ/잘) 및 밀도 (예: 625, 1250, 2500 셀/잘) 시드 셀의 양을 다 하지만 특정 transfection 시 약에 대 한 역방향 transfection 프로토콜을 따르십시오. 다음과의 복제를 포함: 세포 치료, 모의 (즉, 셀 플러스 transfection 시 약), 셀과 셀 양수 및 음수 transfection 제어 siRNA와 페 페 (샘플 접시 그림 2A 참조 레이아웃)입니다.
- 일반적으로 10의 우물에서 최종 농도 대 한 각 siRNA의 80 nM 희석을 준비 nM (라이브러리, 따라 siRNA의 높은 농도 필요할 수 있습니다). 명시 하지 않으면, transfection 시 희석제와 siRNA를 희석. Transfection 시 약의 희석을 준비 합니다.
- 피펫으로 5 잘 희석된 transfection 시 약의 5 μ 뒤 당 siRNA의 μ. 이 단계를 촉진, U-하단 96 잘 접시, siRNA 믹스 (대 한 치료 및 모의 transfected 세포) 혼자 siRNA 희석제의 열에 따라 배포 됩니다. 두 번째 열, 희석된 transfection 시 약 및 transfection 시 약 희석 액 (치료 셀)에 대 한 혼자 따라 배포 합니다.
- 5 μ/잘 희석된 transfection 시 약 또는 transfection 시 약에서 희석제의 뒤 전자 피펫으로, 384-잘 접시의 해당 우물에 siRNA 또는 희석제 siRNA를 포함 하는 첫 번째 열의 내용 피펫으로 5 μ/잘 사용 하는 두 번째 열입니다.
- 1026 x g, 실내 온도에 1 분 동안에 격판덮개 원심과 transfection 시 약에 대 한 처방으로 품 어 (예: 5-20 분).
- 접시는 잠복기 동안 다양 한 밀도의 셀 정지를 준비 합니다. 피펫으로 30 잘 당 세포 현 탁 액의 μ. 인큐베이터에 접시를 배치 하기 전에 접시 셀19의 균일 한 정착 수 있도록 실내 온도에 45-60 분 동안 앉아 보자.
참고: 짧은 잠복기 siRNA와 transfection 시 약에 대 한 처방 인 경우는 부 화 하기 전에 셀 정지를 준비 합니다. - 최저 화면에 대 한 선택의 원하는 길이 따라 48 ~ 72 h에 대 한 품 어.
- 고정 하 고 얼룩 포름알데히드, Hoechst 33342와 PBS (인산 염 버퍼 염) 4% 포름알데히드와 Hoechst 33342의 5 ug/mL의 최종 농도에 각 잘 구성 된 솔루션을 준비 합니다. 신호는 너무 약하거나 너무 강한, 각각 하는 경우 필요에 따라 더 높은 (예: 7.5 ug/mL) 또는 Hoechst의 낮은 농도 (예: 2 ug/mL)를 보십시오.
- 모든 우물에 직접 고정 하 고 얼룩 솔루션의 30 μ를 분배. 37 ° c.에 30 분 동안 접시를 품 어 4 ° c.에 접시를 저장 비 confocal 현미경을 사용 하는 경우 접시 세탁기;를 사용 하 여 PBS를 가진 접시를 세척 대부분의 경우, confocal 현미경을 사용 하 여 세척 필요 하지 않습니다.
- 잘 당 셀의 수를 계량 하는 스크립트를 개발 합니다.
참고: 있습니다 여러 소프트웨어 스위트가이 목적을 위해 하 고, 각 스크립트를 생성 하는 다른 방법으로 할 수 있습니다, 그들은 모두 일반적으로 농도 계산 뿐만 아니라 핵, 세포 및 관심 영역을 식별 하는 수단을가지고 형태학 속성입니다. 심사 스크립트를 개발할 때 그것은 접시 당 스크립트를 실행 하 고 아마도 처리 시간을 최소화 하기 위해 꼭 필요한 측정을 포함 하는 데 필요한 시간을 고려 하는 것이 중요. 예를 들어 휴대폰 번호, 척도를 하나 지정된 강도; 위에 잘 당 Hoechst 지역 계산할 수 있습니다. 그리고 바이러스 확산, 계량 하나 지정된 강도 위에 잘 당 GFP (녹색 형광 성 단백질) 영역을 계산할 수 있습니다. "아래로 앞된" 스크립트 필수 정보가 손실 됩니다 보장 하기 위해 더 정교한 스크립트를 비교 해야 합니다. - Transfection 시 금액 이며 밀도 중요 한 세포 죽음 (0-30% 세포 생존)에 결과 최소한 (예: 90-100% 세포에 독성을 시드 셀 최적의 transfection 조건을 결정 결과 분석 세포 생존)입니다. 참고: 그것은 긴 두 배로 시간 셀 라인에서 세포 죽음 표현 형을 관찰 하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 그림 2B 와 2c 대표적인 결과 참조 하십시오. 또한, 비 대상으로 siRNA와 transfected 세포는 약 90-100% 합칠 고정 시 나중에 하나는이 confluency의 세포를 감염 하려는 것입니다 확인 합니다.
- 바이러스의 최적의 금액 및 감염의 길이
- 같은 역 transfection 단계를 수행 하십시오 (참조 1.1.4.1 1.1.4.4) 위에서 설명한; 그러나만 최적의 transfection 조건 (1.1.8 참조)를 사용 하 여 (예: 786-O 셀: 1500 셀/잘 및 RNAiMAX의 0.05 μ/잘) [예: 웰 스 모의 치료 세포와 바이러스로 감염 되는 여분의 웰 스 또한, 포함 하는 고 transfected 세포, 세포 페 비 대상으로 siRNA, 및 것 들 (즉, siRNA 억제 또는 복제 향상 호스트 유전자를 대상으로) 알려 지는 경우 긍정적인 바이러스 컨트롤 페 셀].
- 샘플 접시 레이아웃 그림 3A 를 참조 하십시오. 48-72 h에 대 한 품 어.
- 추가 바이러스 웰 스 감염 (개월) (예: 0.001 ~ 10;의 복합성의 범위와 형광 기자 단백질 (예: GFP)를 표현 하는 oncolytic 바이러스 감염 범위 선택 있을 따라 달라 집니다 저항 수준 또는 셀 라인의 민감성에.). 감염 되지 않은 웰 스도 포함 됩니다. 피펫으로 40 80 μ의 마지막 볼륨에 대 한 잘 당 각 바이러스 희석의 μ. 실 온에서 30 분 400 x g에서 각 격판덮개 원심
- 다음과 같은 감염, 세포 살이 콘텐츠, 이미지 자동 현미경 일정 한 간격 (예: 모든 4-8 h). 그림 3B 와 3c를참조 하십시오.
- 바이러스 확산 (예: 잘 당 GFP 지역)을 계량 하는 스크립트를 개발 (1.1.7 참조). 이미지를 분석 하 고 시간 포인트 및 증가 확산 감소의 검출을 허용 하는 한 나를 선택 합니다. 확인 시간-포인트 확산에 작은 변화 탐지를 촉진 하기 위하여 선형 범위 내에서을 나. Z-팩터 추정 (또는 Z') 주어진된 시간-포인트와 나에 대 한.
참고: 추정 계수 Z = 1-3 (σp + σn) / | μp-μn| 어디 σp 는 긍정적인 바이러스 컨트롤의 표본 표준 편차, σn 은 부정적인 바이러스의 샘플 표준 편차 컨트롤; 그리고 μp 긍정적인 바이러스 컨트롤 및 μn 부정적인 컨트롤의 표본 평균이 표본 평균이. 0.5-예상된 Z 팩터 1.0은20,21심사에 적합 하 고 우수한 시험으로 간주. - 부정적인 바이러스 제어 siRNA 모의 transfected 및 치료 우물에 그것을 비교 하 여 바이러스 복제에 영향을 주지 않습니다에 확인 하십시오. 그것은 종종 몇 가지 부정적인 siRNA 컨트롤 바이러스 복제에 영향을 줄 수로 여러 부정적인 컨트롤을 테스트 하는 데 필요한입니다.
- 같은 역 transfection 단계를 수행 하십시오 (참조 1.1.4.1 1.1.4.4) 위에서 설명한; 그러나만 최적의 transfection 조건 (1.1.8 참조)를 사용 하 여 (예: 786-O 셀: 1500 셀/잘 및 RNAiMAX의 0.05 μ/잘) [예: 웰 스 모의 치료 세포와 바이러스로 감염 되는 여분의 웰 스 또한, 포함 하는 고 transfected 세포, 세포 페 비 대상으로 siRNA, 및 것 들 (즉, siRNA 억제 또는 복제 향상 호스트 유전자를 대상으로) 알려 지는 경우 긍정적인 바이러스 컨트롤 페 셀].
- 높은 처리량 검사 분석 결과의 최종 유효성 검사
- 1.2.1, 1.2.2, 위의 단계 하지만이 시간 감염 셀만 최적의 방어를 반복 합니다. 라이브 영상, 대신 수정 하 고 접시 (1.1.5과 1.1.6에서와 같이)에 최적의 얼룩 시간 포인트 (1.2.4 참조).
- 이미지 접시입니다. 화면에 사용 될 동일한 스크립트를 사용 하 여 결과 분석 (1.1.7 및 1.2.4 참조). Transfection 조건 (즉 좋은 최저 스에서 페 긍정적인 transfection 제어와 부정적인 transfection 제어와 페 스에서 최소한의 독성)을 확인 합니다. 분석 결과의 견고성을 확인 하기 위해 Z 요소를 추정 (1.2.4 참조).
- 추가 테스트 및 높은 처리량 검열을 실시 하기 위한 고려 사항
- 특히 뚜껑 지켜진다 고 여러 접시 한 번에 centrifuged 때 일부 격판덮개 원심 분리, 동안 균열 수로 결정 플레이트의 내 구성을 테스트 합니다. 크래킹, 뚜껑 없이 원심 (제공 플레이트는 물개), 버킷 당 centrifuged 격판덮개의 수를 감소 또는.
- 시간이 지남에 transfection 시 믹스의 안정성을 테스트 합니다. Transfection 시 접시에 추가 됩니다, 일단 셀;의 추가 하기 전에 상당한 지연이 있을 수 있습니다. 따라서, 그것은 있는 transfection 시 혼합 효과가 유지 됩니다 기간을 아는 것이 중요입니다. 화면, 세포 transfection 시 믹스 판 추가 사전 준비가 필요할 수 있습니다.
- 액체 디스펜서를 사용 하 여 준비 합니다. Transfection 시 약, 세포, 바이러스, 분배 하는 데 필요한 볼륨을 결정 하 고 튜브 보유, 볼륨 미리 분배 (해당 되는 경우 장치는이 기능), 잃어버린 볼륨 및 병 사용에 필요한 잔여 볼륨 수정 분배.
- 설정 하 고 테스트 프로그램을 transfection 시 약, 세포, 및 바이러스 분배 하는 데 사용 됩니다. Transfection 시 약의 손실을 최소화 하기 위해 제한, 만약에 가능 하다 면, 수 미리 dispenses. 액체 디스펜서를 보정 하 고 그것의 정확성과 정밀 테스트 프로토콜을 설정 합니다.
- Transfection 시 약, 세포와 바이러스의 대량 분배에 대 한 준비
- 먼저 접시 접시 한 번에 trypsinized feasibly 수 있는 셀의 수를 고려 하는 하나의 일괄 처리에서 처리할 수를 결정, 될 수 있는 결정 판 수 centrifuged 한 번에 하나의 일괄 처리를 처리 하는 데 필요한 시간의 길이 액체 디스펜서와 또한 영상에 필요한 시간 접시. 참고: 일반적으로, 한 번에 약 30 접시를 처리 하는 것은 매우 가능 하 고 접시의 3 배치를 처리 하는 것은 하루에 관리.
- 경험적으로 접시의 하나의 일괄 처리를 처리 하는 데 필요한 transfection 시 약의 볼륨을 확인 합니다. 이 볼륨은 증류수의 분배 5 μ에 의해 적절 한 여러 번 한 접시 하나의 일괄 처리를 처리 하는 데 필요한 것입니다 해당 횟수에 걸쳐 테스트 합니다.
- 셀의 동등한 배급을 보장 하기 위해, 번호판의 1 개의 배치에서 세포를 분배 하는 데 필요한 시간을 예상 하고있다. 일괄 처리에 필요한 셀의 볼륨을 포함 하는 병을 준비 하 고 같은 접시의 배치를 통해 분배 하는 데 걸리는 시간 동안 일정 한 간격 한 번에 접시의 여러 열에 셀을 분배. 테스트는 얼마나 자주 그것은 혼합 셀의 동등한 배급을 유지 하기 위해 셀 필요가 있을 것입니다.
- 바이러스의 동등한 배급을 보장 하기 위해, 하지만 이번이에 confluent 우물에 바이러스를 분배 (1.4.4.3 참조), 위의 같은 절차를 반복 합니다. 바이러스 균등 하 게 분산 되지 원뿔 튜브에 vortexing 바이러스 분배 이전 각 튜브를 준비 하는 것이 좋습니다.
- 화면에 대 한 충분 한 세포 성장에 대 한 일정을 결정 하는 세포의 성장을 추적 합니다. 또한, 화면에 필요한 수를 예측 하려면 로그 단계에서 성장 하는 셀의 접시 당 수확 될 수 있는 셀의 평균 수를 결정 합니다.
- 높은 처리량 검열을 위한 최종 준비 단계
- 최대 심사 개시 전에 한 달에 모든 화면에 필요한 재료의 결정 합니다. (자료 참조) 모든 필요한 시 약을 주문. 바이러스의 필요한 금액에 확인 (선호, 최적화 하는 동안 사용 된 동일한 재고 사용 합니다.).
- 최대 심사 개시 전에 2 주를 해 동 하 고 화면에 필요한 세포를 성장. 원심 분리기 및 평방 원심 분리기 양동이의 가용성을 확인 합니다.
- 역방향 transfection 및 감염, 70% 에탄올, 2 X transfection 시 약 희석 액의 주식에 대 한 미디어 병 심사 개시 전에 주 동안 준비 (예: 2 X Opti-MEM), 필요 (예: siRNA 도서관에서 희석 하는 경우 RNase-free 물, 하나 transfect 세포를 2 X를 사용 하 고 싶을 것 이다), 그리고 aliquots (번호판의 배치 당 하나) 바이러스의. 셀의 상태를 확인 합니다.
- Hoechst 33342 얼룩의 재고 솔루션을 준비 (예: 5 mg/mL). 하나 centrifuging 요구 될 경우 균형 접시를 준비 합니다.
- 접시 와셔에에서 확인 좋은 작업 순서 경우에 사용 됩니다. 액체 디스펜서는 제대로 보정 하 고 분배 정확 하 고 정확 하 게 확인 하십시오. 또한, 프로그램 액체 디스펜서에 제대로 설정 되어 확인 하십시오.
2. 기본 높은 처리량 화면 실시
참고: RNAi 스크린을 개시, 이전 결정 판 (예: 384-잘 접시) 필요가 siRNA 도서관 및 심사 컨트롤 배열 될. 다음 단계는 가장 한 사람 (즉, 사람이 A) 주로 transfection 시 고 접시, 및 두 번째 사람 (즉, B) 되 고 셀에 대 한 책임 분배에 대 한 책임으로 두 사람에 의해 실시 transfection 직전 및 셀을 준비 하기 위한 접시 centrifuging 괄호에는 33 접시의 하나의 일괄 처리에 대 한 몇 가지 구체적인 (즉, 라이브러리의 절반) 786-O 셀 라인.
- 역방향 transfection에 대 한 준비
- 사람 a: 충분 한 미디어, 트립 신 및 PBS 접시는 37 ° C 물 목욕에의 한 일괄 처리를 처리 하는 데 필요한 장소. 선택 사항: 셀, 접시를 Trypsinize 하 고 접시 당 세포의 수를 계산 하는 배치 당 필요한 접시의 수의 실시간 견적을 제공 하기 위해.
- 냉장고에서 플레이트 (예: 33 플레이트)의 배치를 얻을 하 고 서 리 없애다에 접시를 수 있도록 20-30 분을 기다립니다. 플레이트는 녹이 고, 하는 동안 다음 단계를 계속 합니다.
- 사람 a: 피펫으로 50ml 원추형으로 튜브 transfection 시 약 희석 접시의 하나의 일괄 처리에 필요한 금액 (예: 2 x 37.125 mL) 37 ° C 물 욕조에 그들을 배치. 70% 에탄올 (예: 250-500 mL 병)로 두 병을 채우십시오. 두 50 mL 원뿔 튜브를 PBS와 증류수로 채워.
- 사람 a: 담가 70% 에탄올의 병으로 튜브 액체 디스펜서. 모든 도움말 transfection 시 약 (예: 접시의 외부 우물 사용 하지 않는 경우)를 분배에 대 한 사용 되지 것입니다, 먼저 불필요 한 튜브 분리 합니다. 튜브는 아래 튜브 고려 될 수 있다 살 균 하는 지점을 표시를 주위에 마스킹 테이프의 조각을 넣으십시오. 약 25 mL와 함께 프라임. 잃어버린된 볼륨을 대체 하는 병으로 추가 에탄올을 붓는 다. 튜브를 하자 5 분의 최소 에탄올에 앉아.
- 사람 b: 셀 trypsinize을 준비. 70% 에탄올과 조직 문화 (TC) 후드를 스프레이. 스프레이 및 필요한 pipets, 팁, 병 및 microfuge 관 셀 후드에 준비 (2.2.1.1 및 2.2.1.2 참조). 1026 x g 실 온에서 2 분 동안에 세트에 봉인된 격판덮개 원심 이전 뚜껑 (참조 1.4.1)에 보관 됩니다 때 격판덮개 원심 분리 동안 부 수를 결정 하는 경우 TC 후드에서 플레이트에서 뚜껑을 제거 합니다.
- 사람 a: 격판덮개에서 물개를 제거 합니다. 하기 전에, 도중 또는 후 물개 (에 따라 필요한 보육의 길이), 제거 된 피펫으로 transfection 시 약 (예: 375 μ/튜브의 RNAiMAX/0.05 μ의 최종 농도) 원뿔 관에 필요한 금액 포함 하는 미리 데워 transfection 시 희석제 (예: 37.125 mL/튜브).
- 10 번 위아래로 pipetting으로 혼합. Transfection 시 사용 되 고 (예를 들어 0-10 분)에 대 한 처방으로 실 온에서 품 어.
- Transfection 역
- 사람 B는 다음 작업을 완료 했습니다.
- 셀 (예: 3 격판덮개 786-O 셀)를 trypsinizing 시작 합니다. 각 접시에서 미디어 발음 PBS의 9 mL로 씻어. 피펫으로 trypsin 접시 당 3 mL입니다. 약 5 분 Resuspend 미디어의 22 mL로 세포에 대 한 37 ° C에서 품 어. 피펫으로 10 번 왔다 갔다입니다.
- 무 균 병으로 각 조직 배양 접시에서 세포 현 탁 액 결합. 반전으로 세포 현 탁 액을 혼합. 피펫으로 세포 현 탁 액 2 개의 별도 microfuge 관으로의 1 mL aliquots. 각 microfuge 관에서 샘플을 제거 하 고 셀을 카운트. 세포 현 탁 액 밀도 필요 (예: 1500: 셀/음)에 필요한 볼륨을 계산 하 고 충분 한 희석된 세포 현 탁 액을 준비 (예: 500 mL) 접시의 한 배치에 걸쳐 분배 하.
- 사람 a는 사람 b 동시에 다음 작업을 완료
- 액체 디스펜서 빈 에탄올의 튜브. 약 25 mL PBS의 튜브를 총리 하 고 튜브를 비우십시오. Transfection 시 약에 몰입 하 고 세포 현 탁 액의 뒷부분에 나오는 살 균 보관 마스킹 테이프 아래 튜브의 섹션 되도록 튜브를 처리할 때는 주의 해야 합니다. Transfection 시 약 해결책의 1 개의 원뿔 관 안전 하 게 할 수 있는 격판덮개 떨어져 설정 합니다.
- 피펫으로 transfection 시 약 해결책을 아래로 10 번. Transfection 시 솔루션 튜브 프라임. Transfection 시 약의 손실을 최소화 하기 위해 충분 한 솔루션을 거의 도움말을 취소 프라임. 액체 디스펜서에 올바른 프로그램을 선택 하 고 잘 당 transfection 시 약의 5 μ 분배.
주의: 밀접 하 게 그래서 그 밖으로 실행 하기 전에 보충은 transfection 시의 레벨을 모니터링 합니다. 완료는 격판덮개의 세트 떨어져 더 transfection 시 솔루션을 추가 하는 큐를 제공 해야 한다. - 실 온에서 1 분 동안 1026 x g에서 격판덮개 원심 이 시간 뚜껑 있을 것 이다, 그래서 그것은 (예: 2 격판덮개 버킷 당) 크래킹을 방지 하기 위해 한 번에 적은 격판덮개 원심 해야 할 수 있습니다. Transfection 시 약 사용에 대 한 처방으로 실내 온도에 번호판을 품 어 (예: 10-20 분).
- 부 화, 동안 transfection 시 솔루션의 튜빙을 빈 하 고 PBS를 포함 하는 전체 50 mL 원뿔 튜브에 배치. 약 25 mL 못쓰게 하 여 PBS의와 관과 비우는 린스.
- 더는 팁 분배 transfection 시 약을 위해 사용 되었다 보다 세포를 분배 하는 데 사용할 경우, 사용 하지 않는 튜브를 다시 연결 하 고 다시 PBS 가진 튜브를 rinsing 전에 70% 에탄올과 모든 튜브 소독 (2.1.2.2 참조).
- 일단 준비 된 세포 현 탁 액을 포함 하는 병을 섞는다. 셀 서 스 펜 션에서 튜브를 놓고 각 팁 제대로 분배 볼 정도로 프라임. 모든 접시에 걸쳐 세포 현 탁 액의 당 30 μ를 분배. 필요한 경우, 정착 피하기 위해 정기적으로 세포 현 탁 액을 혼합.
주의: 가끔 미디어를 포함 하는 서 스 펜 션의 방울은 팁의 양쪽에 충실 수 있습니다. 이 관찰은 가능한 한 빨리 발음 또는 70% 에탄올에 묻은 보풀 티슈로 닦아. - 빈 셀 서 스 펜 션의 튜빙. 약 25 mL PBS, 뒤에 증류수 약 50ml의 튜브를 헹 굴.
- 인큐베이터에 접시를 반환 하기 전에 실내 온도에 시드 셀의 시간에서 45-60 분 앉아서 접시를 허용 합니다. 유전자 입을 (예: 48 h)의 원하는 길이에 그대로 인큐베이터에 접시를 품 어 (1.1.4.5 참조).
- 사람 B는 다음 작업을 완료 했습니다.
- 감염
- 세포, 감염 전날 시간을 절약 하기 피펫으로 멸 균에 감염 되지 않은 웰 스에 대 한 미디어를 포함 하는 접시의 각 배치를 감염 하는 데 필요한 미디어의 정확한 양을 병 (예: 2 x 350 mL 및 33 번호판에 대 한 2 x 50 mL). 또한, 정밀도 및 정확도, 액체 디스펜서를 테스트 하 고 필요한 경우 다시 보정.
- 37 ° c.에 미디어를 따뜻한 70% 에탄올, PBS와 2 개의 50 mL 원뿔 튜브과 증류수 두 병을 채우십시오. 실내 온도에 원심 분리기 인지 확인 합니다.
- 튜브 70% 에탄올으로 소독 하 고 앞에서 설명한 (및 참조 하십시오 2.1.2.2 2.2.2.1)으로 PBS와 린스. 튜브는 에탄올에 앉아있는 동안 피펫으로 정확한 양의 미디어를 포함 하는 것은 이전 병에 필요한 바이러스 감염에 대 한 준비 (2.3.1 참조). 25 mL를 못쓰게 하 고 비우는 다음으로 PBS 가진 튜브를 헹 구 십시오.
- 인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 TC 후드에 그들을 배치. 프라임 미디어와 함께 배관. 감염된 제어 우물에 미디어의 40 μ를 분배. 비어 있는 미디어의 튜브와 25 mL PBS와 린스. (주의 2.2.2.5 참조)
- 혼합 후 바이러스, 바이러스를 포함 하는 병으로 튜브를 놓습니다. 바이러스의 40 μ는 접시에 걸쳐 분배. 실 온에서 400 x g에서 30 분 동안 접시 원심 인큐베이터에 접시를 반환 합니다. 이전 결정된 길이의 시간 (예: 24 시간)에 대 한 번호판을 품 어 (1.2.4 참조).
- 및 세포를 얼룩이 지기
- 고정, 전날 시간을 절약 하기 및 플레이트의 각 일괄 처리에 대 한 포름알데히드와 PBS (예: 37% 포름알데히드의 그리고 4% 포름알데히드의 최종 농도 대 한 PBS의 270 mL 179 mL)를 포함 하는 솔루션을 얼룩의 병을 준비 하지만 생략 합니다 Hoechst 얼룩입니다. 물 빛에서 캐비닛에 저장 합니다.
- 앞에서 설명한 (및 참조 하십시오 2.1.2.2 2.2.2.1)으로 70% 에탄올과 PBS와 튜브를 헹 굴. Hoechst의 필요한 볼륨을 추가 (예.는 5 mg/mL의 Hoechst의 7.5 μ g/mL의 우물에서 최종 농도 2.5 mL) 담합 하 여 얼룩이 솔루션 및 혼합.
- 분배 및 모든 접시에 걸쳐 솔루션 얼룩의 30 μ. 30 분 동안 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 다음 화, 번호판, 물개를 적용 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 접시를 저장. 필요한 경우 접시를 세척 (1.1.6 참조).
- 이미징 및 이미지 분석
- 자동화, 높은 콘텐츠 현미경으로 판 이미지. 이전 결정된 설정을 사용 하지만 먼저 테스트 설정을 아무 조정 만들 필요가.
- 계량은 GFP (또는 다른 형광 기자) 영역과 잘 이전 개발된 스크립트를 사용 하 여 당 Hoechst 영역 (1.3.2 참조). 약간의 수정 플레이트의 모든 분석 배치 하기 전에 만들 필요가 있는지를 먼저 접시의 소수와 스크립트를 테스트 합니다.
- 조회 수를 식별 합니다. 참고: 강력한 Z-점수/매드 (평균 절대 편차) 메서드는이 쪽으로 자주 사용 되는 메서드입니다. 일반적으로,의 점수 > 2 또는 <-2 컷-오프로 설정 됩니다. 이 메서드는 siRNA 샘플 번호판을 임의로 분산 및, 예를 들어 그룹화 함수 샘플 사실상 부정적인 컨트롤로 사용 되는 때에 가장 적합 합니다. 이러한 비 특히 바이러스 확산 (세포 독성 조회 수 필터링에 자세한 사항은 내용 참조) 감소 예상 되는 것으로 세포 독성 siRNAS 밖으로 필터링.
3. 보조 화면 TRC (RNAi 컨소시엄) shRNA 라이브러리 안타의 유효성 검사
주: 선택 가능한 기술 심사 및 보조 유효성 검사에 대 한 조회 수에 대 한 내용은 토론을 참조 하십시오. 기본 화면에 사용 되는 동일한 분석 결과 개발 및 검증 프로토콜 siRNA 기술을 보조 유효성 검사에 대 한 선택 하는 경우 사용할 수 있습니다 (1 참조).
- 글리세롤 주식으로 관심의 후보 유전자를 대상으로 사용자 지정 TRC shRNA 라이브러리를 가져옵니다.
- 글리세롤 주식에서 transfection 품질 플라스 미드 DNA를 준비 합니다. 참고: 자세한 프로토콜 (즉, "shRNA/sgRNA/ORF 글리세롤 및 플라스 미드 DNA 준비")는 여기서 찾을 수 있습니다: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
- ShRNA DNA 플라스 미드를 가진 관심사의 유전자를 대상으로 표현 하는 lentiviruses를 생성 합니다. 참고: 96 잘 접시에서 lentivirus 생산에 대 한 상세한 프로토콜 [즉 "shRNA/sgRNA/ORF 높은 처리량 바이러스 생산 (96 잘)"] 여기에서 찾을 수 있습니다: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
- lentiviruses 가진 세포를 감염. 참고: lentiviral 감염 96 잘 접시 (즉 "Lentiviral 감염")에 대 한 상세한 프로토콜은 사용할 수 있는 온라인에 http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral %20infection%20200909.pdf입니다.
- 어느 다음 puromycin 선택 셀 oncolytic 바이러스 감염 (선택 프로토콜에 대 한 참고) 성공적으로 불리고 셀 또는 (puromycin 선택) 없이 즉시 다음 변환. 최적의 바이러스 및 바이러스를 가진 외피의 길이 확인 하려면 기본 화면에 대 한 사용 하는 동일한 방법을 사용 합니다.
4. 제 3 유효성 검사
참고: 3 차 유효성 검사의 목적은 주로 히트 대상, 특정, 종양에 고 향상 효능을 확인 하는 vivo에서. 하나는 또한 그것은 종양 세포 라인의 스펙트럼 확산 변조 여부를 테스트할 수 있습니다.
-
후보 유전자의 그 최저의 확인은 대상에
- 먼저 표현 형 및 유전자 침묵 사이의 상관 관계 되는지 확인 합니다. 개발 된 동일한 분석 결과 사용 하 여 화면에 대 한 또는 향상 또는 큰 형태로 확산의 억제를 평가 하기 위해 6-잘 형식에 대 한 수정. Gene(s) 관심 플러스와 마이너스 바이러스를 대상으로 siRNA와 transfected 세포와 시간 과정을 수행 합니다.
- 바이러스에 감염 된 세포를 포함 하는 우물을 이미지 하 고 일정 한 시간 간격으로 감염 되지 않은 우물에서 세포 lysates를 수집 합니다. 유전자 침묵 및 향상 또는 확산의 억제 사이 상관 관계가 있는지 여부를 확인 합니다. 유전자 침묵 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 및 서쪽 blotting에 의해 평가.
- 히트 대상에 확인 하는 유전자 구조 실험을 수행 합니다. 참고: 일반적인 구조 실험에 후보 유전자는 노크 다운 RNAi 셀 RNAi 저항 cDNA (예: 유전자의 ortholog)와 뚜렷이 페는 동시에 하는 동안 결정 하 후보 유전자 표현 여부는 유전자의 표현 형 복원 또는 "구조." 안정적인 셀 라인 RNAi 저항 cDNA의 후보 유전자의 overexpressing도 사용할 수 있습니다.
- 또는 유전자 구조 실험 대신 사용 하 여 여러 개의 직교 분석 히트에 대상 인지 확인 [예: 결정 같은 표현 형의 최저 시 여러 siRNAs와 대상 유전자의 최저 시 취득 여부 shRNA 대상 유전자에 대 한 그리고 CRISPR (Clustered 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복)와 녹아웃 표현 여러 안정적인 셀 라인에서 대상 유전자-여러 셀 라인에서 Cas9 기술.].
-
히트 종양 관련 이며, 종양 세포 라인의 범위에 걸쳐 확산 변조 확인
- 4.1.1, 같이 하지만 정상 세포 뿐만 아니라 다른 종양 세포 라인 비슷한 분석을 실시 합니다.
-
후보 유전자의 조작 vivo에서 효능 향상 확인
참고: 아래에 설명 된 vivo에서유전자를 조작 하기 위한 세 가지 방법 대상입니다.- 대상 유전자를 조작 하는 약물을 찾아. 동일한 유전자를 대상으로 작은 분자 억제제 같은 약물이 있는 경우에, oncolytic 바이러스 비보와 함께 그것을 관리. 그것은 마약을 관리 하기 위한 최적의 타이밍을 결정 하는 것이 중요입니다.
- 억제 또는 한 여부에 따라 유전자 대상 overexpress 바이러스 억제 하거나 유전자 목표를 강화 하고자 하는 엔지니어. 억제 유전자, 유전자 또는 유전자를 대상으로 하는 표현 shRNA 지배적인 부정적인 표현 하 oncolytic 바이러스 엔지니어. 을 강화 하기 위해 유전자 대상의 표현 transgene 유전자 overexpressing와 oncolytic 바이러스 복제.
- 노크 다운 또는 각각 shRNA 또는 CRISPR Cas9 기술를 사용 하 여 노크 아웃 유전자와 세포 라인을 설계 합니다. 임 플 란 트 설계 셀 라인 고 야생-타입 라인에서 vivo에서 세포 oncolytic 바이러스 감염 이후. 참고:이 방법은 증거의 원칙으로 하며 추가 시간과 자원을 개발 하는 유전자에서 조작 vivo에서, 예를 들어 마약 투자 가치가 있을 것이 있는지 여부를 확인할 수 있습니다.
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Representative Results
워크플로 호스트 oncolytic 바이러스 치료를 향상 시키기 위해 목표를 식별 하는 데에 대 한 개요는 그림 1에 표시 됩니다.
그림 1에서 볼 수 있듯이 중요 한 첫 번째 단계는 높은 처리량 RNAi 스크린 실시 분석 결과 개발입니다. 그림 2A transfection 최적화 분석 결과 대 한 샘플 접시 레이아웃을 제공합니다. 그림 2B 예상된 결과의 대표 이미지의 구성 이며 그림 2C 예상된 결과의 대표 작. PLK-1, 유전자는 세포 죽음을 유도 하 고 siRNA 때 려 눕 힘 효율성을 모니터링 하는 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다의 siRNA 최저 다음 0-30 사이 세포 생존 기대할 것이 %, 셀 라인은 오래 하지 않는 경우에 시간을 두 배로 걸리는 l 세포 죽음 표현 형을 관찰 하는 onger. 비 대상으로 siRNA 최소한 치료 세포의 비슷한 상대 생존 세포 독성 되어야 합니다.
분석 결과 개발의 또 다른 핵심 요소는 나 감염 세포 및 감염에 대 한 시간의 길이를 결정 하는. 그림 3A 바이러스 및 바이러스를 가진 외피의 길이 결정 하기 위한 샘플 접시 레이아웃을 제공 합니다. 그림 3B 다양 한 개월에서 라이브 시간-786-O 셀 vvDD-eGFP (oncolytic vaccinia 바이러스 티 미 딘 키 니 아 제 및 Vaccinia 성장 인자 유전자 삭제와 함께 향상 된 GFP를 표현)로 감염의 과정의 결과를 보여 줍니다. VvDD-eGFP 0.05 나에 감염 하는 셀의 대표 이미지는 그림 3C에 표시 됩니다. 그림 3B에서 플롯 결과에 따라, 하나 선택할 수 있습니다 0.05 나 고 21 h의 감염의 길이이 시간 포인트는 선형 범위와이 티에서 예상된 Z 비율 이내이 증가 및 확산 감소의 검출에 대 한 허용 나 포인트 0.6 증가 동료 및 확산을 감소 하는 동료입니다. 이 분석 결과 유효성 검사의 일환으로, 하나이 나 고 시간 포인트에서 셀을 수정 하 고 Z 요소를 계산 합니다.
설명 하는 프로토콜에 따라 우리 실시 게놈 넓은 RNAi 스크린 (예: OVCAR-8, U373, NCI H226) 3 개의 다른 종양 세포 라인에 걸쳐 중복에 18,120 유전자15를 대상으로 siRNA 도서관. 미친 메서드를 사용 하 여 1008 명 중 적어도 2 3 암 세포 라인 (그림 4A) 일반적인 파악. 조회 화면에서 확인 된 경로 분석 UPR (펼쳐진된 단백질 응답) ERAD (바인딩과 그물 관련 단백질 저하) 경로 (그림 4A) 위원의 농축을 밝혔다. 우리는 주 화면 (그림 4B)의 다른 대상 시퀀스와 siRNA를 사용 하 여 보조 유효성 검사에 대 한 이러한 경로 내에서 10 안타를 선택. 3 차 유효성 검사의 일환으로, 우리는 IRE1α와 ATF6α 유전자 구조 실험을 실시 (활성화 전사 요소 6 알파)이이 안타 대상 (그림 4C)에 있 었 확인 하.
그림 1: 워크플로 호스트 대상 oncolytic 바이러스 치료 향상을 식별의 도식. 첫 번째 단계는 개발 transfection 조건 셀에 siRNA를 소개 하 여 함께 최적의 세포를 감염 바이러스 (즉, 나)의 결정에 대 한 최적화를 포함 하는 높은 처리량 RNAi 심사에 대 한 분석 결과 유효성을 검사 하 고 바이러스를 가진 외피의 길이입니다. 두 번째 단계는 높은 처리량 게놈 넓은 스크린을 이다. 전체 게놈 전체 유전자를 대상으로 하는 siRNA 도서관 결정 접시에 짓고. 세포는 다음 리버스 siRNA 라이브러리와 페. 48-72 시간 잠복기 유전자 입을 수 있도록, 다음 세포는 바이러스의 최적의 금액으로 감염 됩니다. 외피 바이러스와의 최적의 길이 후 셀 스테인드, 그리고 이후에 콘텐츠 현미경으로 몇 군데 고정은. 이후 이미지 및 데이터 분석 "안타" 라고 크게 변조 바이러스 복제, 유전자를 식별 하는 데 도움이 됩니다. 보조 유효성 검사 스크린은 일반적으로 서로 다른 시드 영역 사용 하 여 siRNA 또는 shRNA 기본 화면에서 선택 안타에 수행 됩니다. 3 차 검증 실험 안타에 대상, 특정 종양 vivo에서효능 향상을 확인 수행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: transfection의 최적화는 높은 처리량 RNAi 심사 분석 결과 대 한 조건. (A) 두 개의 다른 셀 라인 transfection 조건 최적화에 대 한 샘플 접시 레이아웃. (B) 786-O 셀 (1500 셀/잘)의 대표 이미지 Hoechst 33342 72 h 인큐베이션 transfection 시 약 희석 혼자 (즉 치료), transfection 시 약 및 희석제 (즉 모의 다음으로 물 페), 비를 대상으로 siRNA와 siRNA PLK-1을 대상으로. (C) 대표 PLK 1 siRNA와 페 셀의 22% 생존을 보여주는 transfection 최적화 실험 결과 (n = 24) 및 비 대상으로 siRNA와 페 셀의 94% 생존 (n = 8). 오차 막대 = ± SD, 표준 편차; 스케일 바 = 200 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 바이러스의 금액 및 높은 처리량 RNAi 심사 분석 결과 대 한 바이러스를 가진 외피의 길이. (A)는 샘플 접시 레이아웃 최적화 바이러스 및 바이러스를 가진 외피의 길이. 열 1 및 24 transfection 포함 컨트롤 및 왼쪽은 감염 되지 않은. 열 2 23 치료 셀, 모의 transfected 세포 및 긍정적이 고 부정적인 바이러스 컨트롤 모든 감염 한 개월 범위 열 2와 3에서에서 바이러스로 시작 된 페 셀 포함. (B) 786-O 셀 되었고 역 비 대상으로 siRNA와 페 48 h에 대 한 인 큐베이 팅. 그들은 연속적으로 표시 하 고 5 시간 후 감염 (hpi)에서 시작 하는 8 h 간격 몇 군데 개월에서 vvDD GFP 감염 되었습니다. 잘 (± SD) 당 평균 GFP 지역 각 시간 지점에 대 한 계산 (n = 12) 그래프에 표시 하 고. 점 A와 B 사이의 계산 Z 비율 0.6 이며, 점 B와 C 사이의 계산 Z 계수는 0.6. (C)는 잘 시간 포인트에서 0.05 나 감염의 대표적인 라이브 이미지 표시. 확대, 10 x; 9 필드/잘; 스케일 바 = 200 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 게놈 넓은 스크린 Rhabdovirus이 중재 Oncolysis의 강력한 감광 ER 스트레스 응답 봉쇄 식별. (A) 높은 처리량 RNAi의 중복 조회 수 개요 벤 다이어그램 3 종양 세포 라인, 그리고 테이블에 스크린 (+ 합성 치명적인;-, 아무 상호 작용) 및 회로도 (안타에서 개설 된 빨강) 보여주는 내 ERAD 내 키 안타 경로입니다. (B) EC50 교대 (검은 막대, 왼쪽 y 축) U373 셀 마 라바 바이러스 (48 h) 다음 siRNA (72 h) 화면에서 조회 수 내/ERAD의 시리즈를 대상으로 치료와 치료에 대 한 결정 했다. SiRNA 최저 (72 h)에 따라 각 유전자에 대 한 상대 mRNA 식 화이트 (오른쪽 y 축)에 그려져 있습니다. (C) 세포 생존 능력 분석 실험 라바 바이러스 감염 후 48 h를 실시 했다, U373에서 ectopically을 표현 하는 셀 마우스 ATF6α (또는 제어 GFP) ± siRNA 인간의 ATF6α를 대상으로 (또는 비 대상 [NT] 제어; 왼쪽된 패널) 또는 인간 XBP1(s) (또는 컨트롤 ) ± siRNA 인간 IRE1α를 대상으로 (또는 제어; 오른쪽 패널). 서쪽 오 점 유전자 입을 소성 유전자 발현을 보여주는 표시 됩니다. EC50 이동; 세포의 50%를 죽 일 것을 요구 하는 바이러스의 복용량에 변화 = 오차 막대 = ±SD; XBP1(s) = X 상자 의무적인 단백질 1 (접합); (B)에서 단방향 ANOVAs 수행한 뒤는 Bonferroni p 값; 파생 여러 비교 포스트 hoc 테스트 (C), 학생의 t-테스트를 수행한 파생 p 값; * p < 0.05; #p < 0.05입니다. (이 그림 마 호 외에서 수정 되었습니다. 2011,15). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기 선물이 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 식별 하기 위해 높은 처리량 RNAi 심사 위한 프로토콜. 이 성공적으로 oncolytic 라바 바이러스와 oncolytic vaccinia 바이러스, 테스트 되었습니다 하지만, 앞에서 언급 했 듯이, 그것은 적응 시킬 수 있다 다른 oncolytic 바이러스 또는 다른 바이러스와 함께 사용 하기 위해 일반적으로 바이러스 복제를 조절 하는 유전자를 호스트를 식별 하기 위해. 심사 프로토콜 또한 증가 하거나 감소 확산, 유전자를 식별 하도록 설계 되었습니다 하지만 다른 정보에 대 한 쉽게 수정할 수 있습니다. 마 라바 바이러스, 예를 들어, 우리의 스크린 oncolysis 점수 세포 생존 능력 분석 결과 간단한 resazurin 기반 중요 한 염료를 이용 하 여 조절 하는 유전자를 식별 하도록 설계 되었습니다 ( 그림 4참조)15. 바이러스, 부 화 다음이 화면에서 포름알데히드와 함께 Hoechst 얼룩 세포를 고치고, 대신 우리 각 잘 (최종 농도 20 μ g/ml)에 resazurin 염료 적절 하 고, 6 h 부 화 후 흡 광도 측정 (573 nm)와 플레이트 리더입니다. 우리 또한 휴대폰 번호를 판독으로 Hoechst 얼룩에 따라 사용 할 수 있습니다. 바이러스 복제를 모니터링 하는 대리 모 기자를 사용 하 여이 화면에 필요 했다, 하는 동안 기자 단백질, 형광 단백질은 용이 하 게 화면 최적화로 하나 예를 들어 바이러스 복제를 모니터링할 수 있습니다, 특정 바이러스 라이브; 또한, 기자 단백질으로 바이러스는 덜 복잡 하 고 얼룩 바이러스 성 항 원에 대 한 항 체를 사용 하 여 보다 비용이 많이 드는 하지만 화면 하나 없이 가능 합니다. 또한, 하나 더욱 수정 infectivity, 버스트 크기, 그리고 면역 세포 죽음 같은 더욱 상세한 하위 고기에 영향을 주는 호스트 요인 조사 분석 결과를 만들 수 있습니다. 각각의 경우에 하나 두번째와 유효성 검사 방법과 전략 스크리닝 하는 유사한 분석 결과 개발 프로토콜을 따를 것입니다.
프로토콜, 이상적으로 라인과 여러 종양 세포 transfection 조건 최적화 하는 것이 좋습니다. 여러 셀 라인 최적화 적어도 두 가지 이유가 있다. 이유 중 하나입니다 모든 셀 라인 높은 처리량 검열 의무가 셀 본질적인 편견을 피하기 위해 여러 셀 라인 검사를 활성화 하는 주요 이유 하지만 일부 transfect 하기 어려울 수 있습니다 또는 음, 준수 하지 않을 수 있습니다. 셀 라인의 선택은 하나의 목표에 크게 의존. 하나는 특정 암 종류에 초점을 하거나 광범위 한 스펙트럼을 커버를 여러 암 종류를 선택 선택할 수 있습니다. 또는, 하나는 저항 종양 세포 라인 oncolytic 바이러스 감염에 덜 저항 하도록 조작 될 수 있는 호스트 요소를 식별 하는 종양 세포 라인에 초점을 하실 수 있습니다.
셀 라인의 선택 이외에 긍정적이 고 부정적인 바이러스 컨트롤의 선택 화면에 대 한 중요 한 고려 사항입니다. 어떤 경우에,에 필요한 또는 복제를 제한 하는 바이러스 유전자 알고 않을 수도 있습니다 또는 알려져 있다, 그들은 특정 셀 수 있습니다. 따라서, 하나 확인할 수 대략적인 견고성과 분석 결과의 동적 범위 서로게이트 컨트롤을 사용 하 여. 예를 들어 감염 되지 않은 셀 또는 셀 최저 시 확산을 감소 하는 유전자를 식별 하는 데 대리 긍정적인 제어로 낮은 나 감염 사용할 수 하나. 최저 시 확산을 강화 하는 유전자를 식별 하나 감염 바이러스의 희석 시리즈와 함께 셀 수 고 대리 긍정적인 제어로 최대 신호 웰 스를 사용 합니다.
보조 화면 유효성 검사에 대 한 안타의 선택과 고용 기술 유형의 신중한 심의 요구 하는 또 다른 문제입니다. 후보자는 일반적으로 보조 화면 유효성 검사 여부 그들은 크게 변조 여러 암 세포 선에서 확산 (해당 되는 경우 기본 화면 여러 셀 라인에서 실시 됐다)에 히트의 크기에 따라 선택 및 생물 학적 관심에. 데이비드22,23, 팬더24, 문자열25 PINdb26 등 생물 정보학 도구 경로 및 생물 학적 관심을 도울 수 있다. 머서 외. 8 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어의 사용을 설명 하 고 있다 또한 이용할 그들은 안타의 분석 및 시각화에 대 한 개발 하는 알고리즘. 그 유전자 침묵은 결과 해석 하는 때 고려해 야 할 하나의 요소는 조사 되 고 바이러스 라이프 사이클 단계에 따라 다른 영향 있을 수 있습니다. 예, 그것은 가능한 그 최저 라이프 사이클 초기에 유전자의 나중 단계에서 최저 복제를 증가 시킬 수 있습니다 동안 바이러스 복제 억제 수 있습니다. 종종, 보조 화면 siRNA 유전자 당 여러 siRNAs와 다른 씨 지역와 다른 공급 업체에서 실시 됩니다. 그러나, 보완 기술 후보 유전자를 대상으로 CRISPR-Cas9 또는 lentivirus 벡터 shRNA 표현 등 사용할 수 있습니다.
분석의 방법 또한 중요 한 고려 사항입니다. 우리 여기 강력한 Z-점수를 사용 하 여 제안 또는 함께 화가20,27 컷-오프의 히트 전화에 대 한 제안 > 2 또는 <-2. 컷-오프 증가 하거나 더 많은 잘못 된 반응을 제거 하거나 더 많은 거짓 제외 어 캡처에 초점 인지에 따라 감소 될 수 있습니다. 예를 들어, vaccinia 바이러스9최근 높은 처리량 화면, 낮은 컷오프 (없음 어퍼 컷-오프로 최저 시 확산을 감소 하는 유전자를 식별에 초점을 했다 설명 했다)-1.5에서 설정 했다. 또한 z-점수, B 점수20,,2829,30, SSMD (엄격 하 게 표준화 된 평균 차이), 등 사용할 수 있는 다른 방법이 있다. 무덤 외.31 히트 목록 합계 순위, 매드, z 점수와 SSMD에 의해 생성 된 비교 하 고 각 방법의 분석 결과 다른 히트 목록에 발견. 토토, 거기에 완벽 한 방법 또는 커트 오프. 궁극적으로, 보조 화면 유효성 검사와 3 차 검증 연구 진정한 안타를 확인 합니다.
세포 독성 안타를 필터링 하는 방법 또한 고려 되어야 한다. 한 가지 방법은 병렬 더하기 또는 빼기 바이러스 기본 화면을입니다. 이 자신의 세포 독성 siRNAs의 탐지를 허용 한다. 이것은 우리의 마 라바 바이러스 화면15;에 우리의 접근 방법 그러나, 이건 자주 실용적입니다. 아마도 강력한, 덧붙여 더 실용적인 방법을 안타 부분의 보조 화면 유효성 검사, 하나의 초점 안타를 식별 하는 경우에 특히 최저 시 감소 복제도 세포 독성을 확인입니다. Myxoma 바이러스, 전체 게놈 기본 화면에서 예를 들어, Teferi 외. 11 1,588 siRNAs 최저 시 바이러스 복제 감소 확인. 그들은 이러한 siRNAs;와 보조 세포 독성 화면을 실시 하는 세포 독성 siRNAs를 필터링 하려면 그들은 세포 생존 능력 72 h 후 transfection resazurin 기반 세포 생존 능력 분석 실험을 사용 하 여 측정. 세포 독성 siRNAs ≤-1.96의 Z 점수에 따라 확인 되었다. 또 다른 방법은 단순히 시 반 외. 로 감소 > 50%로 일정 비율, 예를 들어에 의해 세포 수의 감소에 따라 기본 심사 데이터에서 세포 독성 siRNAs를 필터링 하는 것입니다. 9, 리 외. 로 특정 점수에 따라 또는 14; 호스트 요인 vesicular 구내 염 바이러스 복제에 필요한 그들의 연구에서 그들은 siRNA 안타 > 3.0 표준 편차는 평균에서 세포 생존 능력 감소를 제외. 셀의 평균 수는 세포 핵의 Hoechst 얼룩에 따라 결정 되었다 하 고, 비록 명시적으로 명시 된 평균 했다 겉보기 접시 당 기준으로 계산 그것은 분명 평균 GFP 신호 접시 당으로 계산 되었다.
어떤 높은 처리량 RNAi 스크린의 한계는 가양성 분석 결과 디자인, 기술 사용의 결과로 또는 체계적인 오류를 통해 올 수 자주 높은 숫자입니다. 예를 들어 단백질은 바이러스의 복제에 영향을 크게 수 있습니다 하지만 진 입을 위한 선택 시간이 너무 짧은 분석 결과 디자인 덕 거짓 부정으로 이어지는 효과 감지 하는 단백질의 반감기를 주어진 수 있습니다. 그 불완전 한 최저와 siRNA 기술을 오프 대상 효과 도입할 수 있습니다 또한 가양성을 잘 설립. 가장자리 효과32같은 체계적인 오류 뿐만 아니라 잘못 된 결과 생성할 수 있습니다. 여기 접시의 외부 우물에서 신호는 체계적으로 인해 증발 접시의 나머지 부분 보다 낮거나 높은 수 있습니다. 이러한 문제를 포함 하 여, 예를 들어 주소 전략이 있다: 오프 대상 효과33을 줄이기 위해 siRNA의 농도 감소, 가장자리 효과 완화 하기 위해 미디어와 함께 외부 우물을 채우기 위해 접시 레이아웃 재구성 또는 채용 감지 하 여 가장자리 효과32,,3435등 체계적인 오류 카운터 개발 된 계산 방법. 가양성을 다루는 일반적인 방법 보조 화면을 기본 화면에 따라 수행 하는 것입니다. False 네거티브를 처리 하는 방법으로 하나 수 있습니다 히트 전화에 대 한 차단 휴식과 보조 심사에 대 한 잠재적인 false 네거티브를 포함. 이것, 물론, false 네거티브는 잘라 아래 잘 캡처하지 것입니다. 기본 화면 또는 가짜 결과 제한 하는 3 중도 실시 한다. 궁극적으로, 아무리 어떤 전략, 고용 높은 처리량 화면이 것입니다 철저 하 게 모든 진정한 히트 하지만 식별 데이터는 하나 시 대문자로 될 수 있는 몇 가지 귀중 한 안타 내 것의 보고를 제공할 수 있습니다.
또 다른 대안은 이다 풀링된 shRNA 및 CRISPR Cas9 라이브러리를 사용 하지만이 프로토콜 우리 기준점과 siRNA shRNA 기술과의 사용 설명. 풀링된 shRNA 라이브러리 Workenhe 외 에 고용 되었다 12 연구 소개에 설명 된입니다. 풀링된 CRISPR Cas9 기술 게놈 규모 화면 Zika 바이러스36, 웨스트 나 일 바이러스37,38, 뎅기열 바이러스39 , 간염 등 바이러스의 복제에 필요한 호스트 요소 식별을 수행 하는 데 사용 되었습니다. C 바이러스39. 풀링된 라이브러리를 사용 하 여의 장점은 그들은 덜 비싼 구매, 전문된 인프라 (예: 액체 처리 장치,이 콘텐츠 현미경, 로봇 장비), 필요 하지도 할 그들은 운영의 높은 비용 이 인프라를 유지 하 고 적은 소모품 필요. 단점은 판독의 유형은 더 제한입니다. 날짜를 가장 하지 않을 경우 모든 풀링된 라이브러리 호스트 바이러스 상호 작용 화면 판독은 세포 생존 능력 또는 부족 하나 더 복잡 한 고기 쉽게 조사할 수 없습니다. 요청을 받고 생물학 질문에 따라 형식 선택 합니다.
박테리아와 효 모 인간 세포에 지금 현재의 게놈 규모 스크린에 첫 번째 활성화 스크린 연구의 다양 한 분야에서 발견을 위한 넓은 문을 열었습니다 지난 몇 년간 유전자 검사 기술에 있는 전진. 이러한 유전 스크린은 하지만 있었습니다 근본적인 생물학 질문, 하지만 우리에 게 준 키 잠금 해제 통찰력 개발 하 고 biotherapeutics을 개선 하. 아직도 배울 레슨과 도전이 기술로 극복할 수 있다, 그러나 날짜에 결과 흥미로운 되었습니다. 발견 더욱으로 소설 CRISPR Cas9 라이브러리를 포함 하 여 기술 심사, 마이크로 그리고 vivo에서 기술 심사 성숙 계속 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 혁신, 오타와 지역 암 재단, 그리고 테리 폭스 연구소에 대 한 암 연구, 캐나다 재단에 대 한 온타리오 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다. K.J.A. Vanier 캐나다 대학원 장학금, 건강 연구-마스터의 수상, 캐나다 연구소에 의해 지원 되었다 및 온타리오 대학원 장학금.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| siRNA library | GE Dharmacon | G-005005-02 | |
| Corning 384-well plate | Corning | 3985 | |
| Falcon 384-well plate | Becton Dickinson | 353962 | |
| Water | Sigma | W4502 | |
| siGenome SMARTpool PLK1 | GE Dharmacon | M-003290-01 | |
| AllStars Negative Control siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
| siGenome Non-targeting siRNA Pool #2 | GE Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| DMEM/HIGH Glucose | GE Healthcare Life Sciences | SH30022.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F15051-500ML | |
| HEPES solution (1M) | Sigma | H3535-100ML | |
| Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 2500056 | |
| DPBS/Modified | GE Healthcare Life Sciences | SH30028.02 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778100 | |
| Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | 1225011 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 22600-050 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma | R7017-5G | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H21492 | |
| Formaldehyde (37% by weight) | Fisher Scientific | F79-4 | |
| 500 ml bottles | Corning | 430282 | |
| Adhesive Sealing Film For Microplates | Excel Scientific | 361006007 | |
| Peelable Heat Sealing Foil | Thermo Fisher Scientific | AB-3720 | |
| BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette | Fisher Scientific | 11-120-625 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MicroFlo Select (liquid dispenser) | Fisher Scientific | 11120621 | |
| BioTek Synergy HT plate reader | Biotek | N/A | |
| Opera Imaging and Analysis Instrument | PerkinElmer | HH10000115 | |
| KiNEDx Robotic Arm | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | KX-300-660 | |
| Cytomat 24C Series Automated Incubator | Thermo Fisher Scientific | 50080227 | |
| JANUS Automated Workstation | PerkinElmer | AJI4M01 | |
| Plate Carousel | Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics) | N/A | |
| Alps 3000 plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-3000 |
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