A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Sriram Vijayraghavan; Boris Kantor

doi:10.3791/56915

JoVE Journal > Genetics

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

유전학

Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen

Published: December 12, 2017

doi:

10.3791/56915

Sriram Vijayraghavan, Boris Kantor

¹Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology,Duke University School of Medicine

Summary

Wir beschreiben die Produktionsstrategie der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) als Vehikel für Zellen CRISPR/Cas9 bereitzustellen. Mit der Fähigkeit, schnell und robust Gene in Zellen bearbeiten zu vermitteln IDLVs präsentieren ein sicherer und ebenso wirksame Vektor Plattform für gen-Lieferung im Vergleich zu Integrase-kompetente Vektoren.

Abstract

Lentivirale Vektoren sind eine ideale Wahl für die Bereitstellung von gen-Bearbeiten von Komponenten auf Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit zur stabil transducing einen breiten Bereich von Zellen und hohe Stufen der Genexpression zu vermitteln. Jedoch ihre Fähigkeit zur Integration in das Wirtsgenom Zelle erhöht das Risiko der insertional Mutagenität und damit Sicherheit Bedenken und schränkt ihre Verwendung in klinischen Umgebungen. Weiter, geliefert der anhaltenden Ausdruck der gen-Bearbeiten von Komponenten durch diese Integration zuständigen Lentivirale Vektoren (ICLVs) erhöht die Wahrscheinlichkeit von promiscuous Gene targeting. Als Alternative hat eine neue Generation von Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) entwickelt, die viele dieser Bedenken befasst. Hier Produktionsprotokoll einer neuen und verbesserten IDLV-Plattform für CRISPR-vermittelten gen bearbeiten und Liste der Schritte bei der Reinigung und Konzentration von solchen Vektoren beschrieben und deren Transduktion und gen-Bearbeitung Effizienz mit HEK-293T Zellen zeigte. Dieses Protokoll ist leicht skalierbar und kann verwendet werden, um hohe Titer IDLVs generieren, die in der Lage, transducing Zellen in Vitro und in Vivo. Darüber hinaus kann dieses Protokoll für die Herstellung von ICLVs leicht angepasst werden.

Introduction

Gen präzise Bearbeitung bildet den Grundstein biomedizinische Fortschritte, die die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung genetischer Krankheiten betreffen. An die Spitze der gen-Bearbeitungs-Technologien ist die Methode unter Berufung auf die Nutzung der clustered rregelmässig –IchNterspaced sHort pAlindromic REpeats (CRISPR) / Cas9-System, das zunächst identifiziert wurde als Bestandteil des bakteriellen Immunität gegen die Invasion der viralen Erbsubstanz (rezensiert in Referenzen¹^,²). Ein wesentlicher Vorteil des CRISPR/Cas9-Systems gegenüber anderen gen-editing-Tools, wie z. B. Zinkfinger-Nukleasen (ZFN) und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) (rezensiert in Referenz³), ist die relative Einfachheit der Plasmid-Design und Bau von CRISPR-Komponenten – ein Feature, das den Ausbau der gen-Bearbeitung von wenigen Speziallabors für eine viel breitere Forschungsgemeinschaft angetrieben hat. Darüber hinaus haben die Einfachheit der CRISPR/Cas9 Programmierung und seine Kapazität für Multiplex Zielerfassung seine Popularität als eine kostengünstige und einfach zu bedienende Technologie weiter angeheizt. Unter den verschiedenen Methoden zur Verfügung, um Forscher solche gen-Bearbeiten von Komponenten an Zellen zu liefern bleiben virale Vektoren bei weitem die beliebteste und effizientes System.

Lentivirale Vektoren (LVs) entstanden als das Fahrzeug der Wahl für die Komponenten des CRISPR/Cas9 System in Vivo für unterschiedlichste Anwendungen⁴^,⁵^,⁶^,⁷liefert. Mehrere wichtige Funktionen machen LVs eine beliebte Wahl für diesen Prozess, einschließlich ihrer Fähigkeit, sowohl trennende und nicht teilenden Zellen, niedrige Immunogenität und minimale zelluläre Toxizität (rezensiert in Referenz⁸) zu infizieren. Infolgedessen wurde LV-vermittelte Gentherapie in der Behandlung von Infektionskrankheiten wie HIV-1, HBV und HSV-1, sowie bei der Korrektur von Mängeln, die zugrunde liegenden menschlichen Erbkrankheiten, wie Mukoviszidose und Neo-Kreislauf Makuladegeneration eingesetzt ⁴ ^, ⁵ ^, ⁷ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹. Außerdem, LVs wurden effektiv geändert um Multiplex-gen an unterschiedliche genomic Loci mit einem einzigen Vektor System¹²Bearbeitung ausführen.

Jedoch kann die inhärente Eigenschaft des LVs in das Wirtsgenom integrieren mutagen und oft behindert ihre Nützlichkeit als Transgen Lieferfahrzeuge, vor allem im klinischen Umfeld. Da zudem stabil integriert LVs ihre transgene auf einem nachhaltig hohen Niveau zum Ausdruck bringen, ist dieses System ungeeignet für die Lieferung von gen-Bearbeiten von Komponenten wie CRISPR/Cas9; Überexpression des Cas9-Guide RNA (gRNA) und ähnliche Proteine wie ZFN, sind verbunden mit erhöhten Konzentrationen von Ziel-Effekte, darunter unerwünschte Mutationen¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶ ^, ¹⁷ und können potenziell Zytotoxizität¹⁸verbessern. Daher unbedingt um präzise zu erreichen gen-Bearbeitung mit minimal Ziel Effekte, Design-Systemen, die für die transiente Expression des Gens, die Bearbeitung von Komponenten ermöglichen.

In den letzten Jahren wurden eine Vielzahl von Plattformen entwickelt, um vorübergehend CRISPR/Cas9 in Zellen¹⁶^,¹⁹^,²⁰^,²¹ (rezensiert in Referenz²²) zum Ausdruck bringen. Dazu gehören Methoden, die direkt Einführung von gereinigten Cas9 zusammen mit der passenden Guide-RNAs in Zellen, die gezeigt wurde, effektiver auf gezielte gen-Bearbeitung im Vergleich zu Plasmid-vermittelte Transfektion¹⁶abhängig. Studien haben gezeigt, dass Ribonucleoprotein (RNP) komplexe, bestehend aus Leitfaden RNA/Cas9 Partikel werden schnell umgedreht nach Vermittlung Spaltung der DNA auf ihre Ziele, was darauf hindeutet, dass kurzfristige Ausdruck dieser Komponenten zu erzielen ist robuste gen¹⁶bearbeiten. Denkbar, nicht-Integration von viralen Vektoren Plattformen wie Adeno-assoziierten viralen Vektoren (Flugabwehrpanzer) bieten eine echte Alternative um gen-Bearbeitung Maschinen an Zellen zu liefern. Leider AAV Capsids besitzen deutlich geringere Verpackung Fähigkeit als LVs (< 5kb), die schwer behindert ihre Fähigkeit, das Mehrkomponenten CRISPR-Toolkit innerhalb einer einzigen Vektor (rezensiert in Referenz⁸) zu verpacken. Es ist erwähnenswert, dass die Zugabe von Verbindungen, die Histon Deacetylases (z.B. Natrium Butyrat²³) hemmen oder verhindern den Zellzyklus (z.B. Koffein²⁴) gezeigt worden, um Lentivirale Titer zu erhöhen. Trotz der jüngsten Fortschritte sind die transiente Expression-Systeme so weit entwickelt noch mehrere Mängel auf, z. B. geringere Produktionseffizienz, behindert durch führen zu reduzierten virale Titer und niedrigen Transduktion Effizienz erzeugt durch Viren solche Ansätze²⁵.

Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) stellen einen großen Fortschritt in der Entwicklung von gen-Lieferfahrzeuge, wie sie die Verpackung-Fähigkeit des LVs mit dem zusätzlichen Vorteil der AAV-artigen episomal Wartung in Zellen verbinden. Diese Funktionen helfen IDLVs, die die wichtigsten Probleme im Zusammenhang mit Integration von Vektoren, Vis À Vis kontinuierliche Überexpression von potenziell genotoxische Elementen und Integration-vermittelten Mutagenität weitgehend zu umgehen. Es wurde bereits gezeigt, dass IDLVs erfolgreich zur Verbesserung der episomal gen Ausdruck²⁶^,²⁷geändert werden kann. In Bezug auf IDLV-vermittelten CRISPR/Cas9 Lieferung beschränkt niedrige Titer und niedriger Ausdruck von Episome getragen Genomen relativ Integrase-kompetente Lentivirale Systeme ihre Nützlichkeit als Bona Fide -Tools für die Bereitstellung von Genom-Bearbeitung transgene Konstrukte. Wir zeigten kürzlich, dass Transgene Ausdruck und virale Titer IDLV Produktion durch die Einbeziehung von Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor Sp1 in der viralen Ausdruck Kassette²⁸erheblich verbessert werden. Die modifizierte IDLVs unterstützt robust CRISPR-vermittelten gen Bearbeitung sowohl in Vitro (in HEK-293T Zellen) und in Vivo (im Post-mitotische Gehirnneuronen), während minimalste Ziel Mutationen im Vergleich zu den entsprechenden ICLV-vermittelte Induktion Systeme-²⁸. Insgesamt entwickelten wir eine neuartige, kompakte, all-in-One CRISPR-Toolkit auf einer IDLV Plattform durchgeführt und erläutert die verschiedenen Vorteile der Verwendung solch ein Transportvehikel für verbesserte gen zu bearbeiten.

Hier ist das Produktionsprotokoll des IDLV-CRISPR/Cas9-Systems beschrieben, darunter die verschiedenen Schritte in der Montage, Reinigung, Konzentration und Titration von IDLVs sowie Strategien, die gen-Bearbeitung Wirksamkeit dieser Vektoren zu validieren. Dieses Protokoll ist leicht skalierbar, um die Bedürfnisse der verschiedenen Forschern und wurde entwickelt, um erfolgreich LV Vektoren mit Titer im Bereich von 1 x 10¹⁰ transducing Einheiten (TU) erzeugen / mL. Die Vektoren generiert durch dieses Protokoll können genutzt werden, um effizient mehrere verschiedene Zelltypen, einschließlich schwer transduzieren embryonale Stammzellen, blutbildenden Zellen (T-Zellen und Makrophagen) und kultiviert und in Vivozu infizieren- eingespritzte Neuronen. Darüber hinaus ist das Protokoll für die Produktion der Integrase-kompetente Lentivirale Vektoren in ähnlichen Mengen gleich gut geeignet.

Abbildung 1: IDLV Verpackung. (a) schematische Darstellung der Wildtyp Integrase Protein (b) das modifizierte Plasmid wurde von psPAX2 abgeleitet (siehe Methoden, Plasmid-Konstruktion für Details). Vertreter Agarose Gelbild geschirmt für mutierte Integrase Klone Klone. DNA-Proben mit den standard Plasmid DNA-Isolierung Mini-Kit zubereitet wurden durch Vergärung mit EcoRV und SphI analysiert. Der richtig verdaut Klon (Nummer 5, gestrichelten roten Feld) wurde weiter durch Sequenzierung der direkten (Sanger) für die D64E Substitution in INTüberprüft. Die Integrase-defizienten Verpackung Kassette wurde pBK43 genannt. (c) schematische Darstellung der transiente Transfektion Protokoll eingesetzt, um generieren IDLV-CRISPR/Cas9 Vektoren zeigen, dass 293T Zellen mit VSV-G, Verpackungen und Transgen Kassetten (Sp1-CRISPR/Cas9 all-in-One Plasmid) transfiziert. Viruspartikel, die heraus von der Zellmembran Knospe enthalten die Full-length RNA des Vektors (ausgedrückt aus der Transgen-Kassette). Die zweite Generation der IDLV-Verpackungssystem diente, worunter die regulatorische Proteine Tat und Rev Rev Ausdruck wird von einer separaten Kassette (RSV-REV-Plasmid) ergänzt. Abbrev: LTR Long Terminal repeat, VSV-G, Stomatitis vesicularis Virus G-Protein, pCMV-Zytomegalievirus Veranstalter; Rous Sarkom-Virus (RSV) Veranstalter; RRE-(Rev-Response-Element). Weitere regulatorische Elemente auf der Expressionskassette gehören Sp1-Bindungsstellen, Rev Response-Element (RRE), Murmeltier Hepatitis Virus posttranskritionelle regulatorische Element (WPRE), Kern-Dehnung Faktor 1α Förderer (EFS-NC), der Vektor-Verpackung Element-ψ (Psi), menschliches Cytomegalovirus (hCMV) Veranstalter und menschlichen U6 Förderer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

(1) Kultivierung HEK-293T Zellen und Aussaat zur Transfektion Hinweis: Menschliche embryonale Nieren 293T (HEK-293T) Zellen wachsen in DMEM, hohe Glukose Medien mit 10 % bovine Kälberserum ergänzt mit Eisen und Wachstum Promotoren und 1 x Antibiotikum antimykotische Lösung ergänzt (100 X Lösung enthält 10.000 Einheiten Penicillin 10 mg Streptomycin und 25 µg Amphotericin B pro mL). Die Medien ist auch mit 1 X Natrium Pyruvat, 1 X nicht-essentielle Aminosäure-Mix und 2 mM L-Glutamin ergä…

Representative Results

Validierung der Ko-Effizienz der IDLV-CRISPR/Cas9 VektorenDie Effizienz von CRISPR/Cas9-vermittelte gen Knockout Validierung verwendet wir GFP exprimierenden 293T Zellen als Modell. GLP +-Zellen wurden durch Transduktion von HEK-293T Zellen mit pLenti-GLP (vBK201a) bei einer MOI von 0,5 (Abb. 3 b, “keine-Virus” Panel) erzeugt. Die SgRNA-GLP/Cas9 all-in-One-Vektor-Kassette wurde in IDLV oder ICLV Partikel verpackt und die Effizienz der Pro…

Discussion

IDLVs haben damit begonnen, als das Fahrzeug der Wahl für die in-Vivo -gen-Bearbeitung, vor allem im Zusammenhang mit genetischen Erkrankungen, weitgehend aufgrund des geringen Risikos Mutagenese diese Vektoren im Vergleich zu integrieren Lieferung Plattformen²² zugeordnet entstehen ^, ²⁸. im aktuellen Manuskript, wollten wir ausführlich das Protokoll verbunden mit der Produktion von der verbesserten all-in-One IDLV-CRISPR/Cas9 System, das vor kurzem in…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten die Abteilung für Neurobiologie, Duke University School of Medicine und Dekanat für Grundlagenforschung, Duke University bedanken. Wir danken auch Mitglieder des Duke viraler Vektor Kerns für Kommentare auf das Manuskript. Plasmid pLenti CRISPRv2 war Geschenk von Feng Zhang (Broad Institute). Die LV-Verpackungssystem einschließlich der Plasmide psPAX2, war VSV-G, pMD2.G und pRSV-Rev eine Art Geschenk von Didier Trono (EPFL, Schweiz). Gewähren Sie finanzieller Unterstützung für diese Arbeit von der University Of South Carolina School Of Medicine, zur Verfügung gestellt wurde, RDF18080-E202 (B.K).

Materials

Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge	Beckman Coulter	369434
xMark Microplate Absorbance plate reader	Bio-Rad	1681150
BD FACS	Becton Dickinson	338960
Inverted fluorescence microscope	Leica	DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL	Corning	430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes	Seton Scientific	5067
Conical tube adapters	Seton Scientific	PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor	Beckman Coulter	369650
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430791
50mL conical centrifuge tubes	Corning	430291
High-binding 96-well plates	Corning	3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid	Corning	353025
100mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
0.22 μM filter unit, 1L	Corning	430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)	Qiagen	27104
Tissue culture pipettes, 5 mL	Corning	4487
Tissue culture pipettes, 10 mL	Corning	4488
Tissue culture pipettes, 25 mL	Corning	4489
Hemacytometer with cover slips	Cole-Parmer	UX-79001-00
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells	ATCC	CRL-3216
293FT cells	Thermo Fisher Scientific	R70007
DMEM, high glucose media	Gibco	11965
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA)	Hyclone	SH30087.04
RPMI 1640 media	Thermo Fisher Scientific	11875-085
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
Trypsin-EDTA 0.05%	Gibco	25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid)	Sigma Aldrich	B9879 – BES
Gelatin	Sigma Aldrich	G1800-100G
Name	Company	Catalog Number	Comments
p²⁴ ELISA reagents
Monoclonal anti-p²⁴ antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3537
HIV-1 standards	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP968F
Polyclonal rabbit anti-p²⁴ antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG	Sigma Aldrich	12-348	Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL	Equitech-Bio	SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL	Sigma	G9023	Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate	KPL	5120-0076	Working concentration 1:10,000
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
pRSV-Rev	Addgene	12253
lentiCRISPR v2	Addgene	52961
Name	Company	Catalog Number	Comments
Restriction enzymes
BsrGI	New England Biolabs	R0575S
BsmBI	New England Biolabs	R0580S
EcoRV	New England Biolabs	R0195S
KpnI	New England Biolabs	R0142S
PacI	New England Biolabs	R0547S
SphI	New England Biolabs	R0182S

References

Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).
Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).
Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146 (2016).
Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9 (12), e115987 (2014).
Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968 (2017).
Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. , (2017).
Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).
Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), e147 (2014).
Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).
Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).
Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).
Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27 (2006).
Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).
Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).
Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).
Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).
Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).
Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).
Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).
Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).
Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).
Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).
. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products – Revisiting Current FDA Recommendations Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017)
. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017)
Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).