A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Sriram Vijayraghavan; Boris Kantor

doi:10.3791/56915

JoVE Journal > Genetics

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

유전학

פרוטוקול עבור הייצור של וקטורים Lentiviral חשוכת-Integrase עבור CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי חלוקת תאים

Published: December 12, 2017

doi:

10.3791/56915

Sriram Vijayraghavan, Boris Kantor

¹Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology,Duke University School of Medicine

Summary

אנו מתארים את האסטרטגיה הייצור של וקטורים lentiviral חשוכת-integrase (IDLVs) בתור כלי רכב להעברת CRISPR/Cas9 לתאים. עם היכולת לתווך ג’ין מהיר וחזק עריכה בתאים, IDLVs להציג דרך בטוחה יותר, פלטפורמה וקטור יעיל באותה מידה המסירה הגן לעומת integrase-המוסמכת וקטורים.

Abstract

וקטורים lentiviral הם הבחירה האידיאלית עבור אספקת רכיבים לעריכת גנים בתאים עקב שטמונה בהם stably transducing רחבה של תאים, מתווכים רמות גבוהות של ביטוי גנים. עם זאת, היכולת שלהם להשתלב הגנום של התא המארח מגבירה את הסיכון המוטגניות insertional ובכך מעלה חששות בטיחות, מגביל את שימושם בהגדרות קליניים. עוד, הביטוי מתמיד של רכיבים לעריכת גנים מועברים על ידי הללו עליות וקטורים אינטגרציה-כשיר lentiviral (ICLVs) ההסתברות של ג’ין מופקר מיקוד. כחלופה, דור חדש של וקטורים lentiviral חשוכת-integrase (IDLVs) פותחה הנותן מענה הרבה חששות אלה. כאן הפרוטוקול הייצור של פלטפורמה IDLV חדשות ומשופרות בתיווך CRISPR גן עריכה של רשימת הצעדים מעורב הטיהור, שמתואר הריכוז של וקטורים כזה שלהם התמרה חושית ואת יעילות לעריכת הגן באמצעות HEK-293T הודגם תאים. פרוטוקול זה הוא שניתן להרחבה בקלות והוא יכול לשמש כדי ליצור IDLVs כייל נוגדנים גבוה כי הם מסוגלים transducing תאים בתוך חוץ גופית ו vivo בתוך. יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לייצור של ICLVs.

Introduction

ג’ין מדויק עריכה צורות היסוד של התקדמות גדולה ביו המערבות הפיתוח של אסטרטגיות מקוריות כדי להתמודד עם מחלות גנטיות. At בחזית טכנולוגיות לעריכת ג’ין היא השיטה להסתמך על השימוש clustered regularly –אניnterspaced sהורט palindromic repeats (CRISPR) / מערכת Cas9 היה מזוהה תחילה רכיב של חיידקי חסינות מפני הפלישה של החומר הגנטי הנגיפי (נבדקה הפניות¹^,²). יתרון גדול של מערכת CRISPR/Cas9 על עריכת הגן כלים אחרים, כגון אבץ-אצבע nucleases (ZFNs) ו- nucleases אפקטור activator דמוי שעתוק (TALENs) (נבדקה הפניה³), הוא הפשטות היחסית של פלסמיד עיצוב ו בניית רכיבים CRISPR — תכונה יש מופעל הרחבת גן לעריכת ממעבדות מיוחדים כמה רחב יותר לקהילה מחקר רב. בנוסף, הפשטות של תכנות CRISPR/Cas9 ואת יכולת זיהוי המטרה מרובבת יש נוספת מונעת את הפופולריות שלו כטכנולוגיה חסכוניים, קל לשימוש. בין השיטות השונות לרשות החוקרים למסור לרכיבים אלה לעריכת ג’ין תאים, וקטורים ויראלי נותרו עד כה במערכת הפופולרית והיעילה ביותר.

Lentiviral וקטורים (אותו) הופיעו כמו הרכב של לספק את הרכיבים של CRISPR/Cas9 מערכת ויוו עבור יישומים שונים ומגוונים⁴^,⁵^,⁶^,⁷. מספר תכונות מפתח להפוך אותו בחירה פופולרית עבור תהליך זה כולל את היכולת שלהם להדביק החלוקה הלא-חלוקת תאים, immunogenicity נמוך, והן רעילות מינימלית הסלולר (נבדקה הפניה⁸). כתוצאה מכך, LV בתיווך ריפוי גנטי כבר מועסקים בטיפולים של מחלות זיהומיות, כגון HIV-1, HBV ו- HSV-1, כמו גם את התיקון של פגמים הבסיסית האנושית מחלות תורשתיות, כגון סיסטיק פיברוזיס, ניאו-וסקולרית ניוון מקולרי ⁴ ^, ⁵ ^, ⁷ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹. Moreover, הזינו אותו ביעילות שונו כדי לבצע ג’ין מולטיפלקס העריכה ברורים לוקוסים גנומית באמצעות מערכת של וקטור יחידה¹².

עם זאת, המאפיין הטבועה של אותו לשלב לתוך הגנום המארח יכול להיות מוטגן, לעיתים קרובות מגבילה את השירות שלהם בתור כלי רכב משלוח transgene, במיוחד בהגדרות קליני. יתר על כן, מאז אותו משולבת stably אקספרס transgenes שלהם ברמה גבוהה בר קיימא, מערכת זו היא נועד למסירה של עריכת ג’ין רכיבים כגון CRISPR/Cas9; ביטוי של Cas9-מדריך RNA (gRNA), חלבונים דומים כגון ZFNs, קשורים עם רמות גבוהות של חופש-יעד אפקטים, הכוללים מוטציות לא רצויים¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶ ^, ¹⁷ פוטנציאלי יכול לשפר את cytotoxicity¹⁸. כדי להשיג דיוק לעריכת ג’ין עם תופעות מינימליות את המטרה, לכן לבריאותה של עיצוב מערכות המאפשרות עבור הביטוי ארעית של ג’ין עריכה רכיבים.

בשנים האחרונות פותחו מגוון רחב של פלטפורמות משלוח לבטא transiently CRISPR/Cas9 תאים¹⁶^,¹⁹^,²⁰^,²¹ (נבדקה הפניה²²). אלה כוללים שיטות המסתמכות על ישירות ידביקו מטוהרים Cas9 יחד עם RNAs המדריך המתאים תאים, אשר הוצגה להיות יעילה יותר ממוקד לעריכת ג’ין לעומת תקנים בתיווך פלסמיד¹⁶. מחקרים הראו כי ribonucleoprotein (RNP) מתחמי המורכב מדריך RNA/Cas9 החלקיקים מופעלים במהירות לאחר תיווכה ביקוע DNA במטרות שלהם, רומז כי הביטוי לטווח קצר של רכיבים אלה מספיקה להשיג גנים חזקים עריכה¹⁶. . שכעיקרון, שילוב שאינו וקטור ויראלי פלטפורמות כגון adeno-הקשורים וקטורים ויראלי (AAVs) יכול לספק אלטרנטיבה מעשית כדי לספק מכונות לעריכת גנים לתאים. למרבה הצער, AAV capsids בעלי יכולת אריזה נמוך משמעותית מאשר אותו (< 5kb), אשר פוגעת קשות ביכולתם כדי לארוז את ערכת הכלים CRISPR רב רכיבים בתוך וקטור יחידה (נבדקה הפניה⁸). ראוי לציין כי תוספת של תרכובות היסטון deacetylases (למשל, נתרן butyrate²³) לעכב או לעצור את מחזור התא (למשל, קפאין²⁴) הוכחו להגביר את lentiviral titers. למרות התקדמות האחרונות, המערכות ביטוי ארעי פיתחה עד כה הם עדיין מובן חסרונות מספר, כגון יעילות ייצור נמוכה יותר, אשר להוביל titers ויראלי מופחתת ויעילות נמוכה התמרה חושית של וירוסים שנוצר דרך כך ניגש²⁵.

וקטורים lentiviral חשוכת-Integrase (IDLVs) מייצגים לקידום המשמעותי בפיתוח של ג’ין-מסירה רכב, המשלבים את היכולת אריזה של אותו עם ערך מוסף כמו AAV תחזוקה episomal בתאים. תכונות אלה מסייעות IDLVs במידה רבה לעקוף את הנושאים העיקריים הקשורים עם שילוב של וקטורים, ושהבנק vis ביטוי רציף של פוטנציאל genotoxic רכיבים, המוטגניות בתיווך אינטגרציה. בעבר הוכח כי ניתן לשנות בהצלחה IDLVs כדי לשפר את ג’ין episomal ביטוי²⁶^,²⁷. לגבי משלוח בתיווך IDLV CRISPR/Cas9, ייצור נמוך titers וביטוי התחתון של הגנום בעקיצות episome ביחס למערכות lentiviral integrase שולטים מגביל את השירות שלהם פיד ה בונה כלי להעברת לעריכת הגנום בונה מהונדס. לאחרונה להדגים כי הביטוי transgene והן titers ויראלי המשויך IDLV ייצור באופן משמעותי משופר על ידי הכללת מחייב אתרים עבור גורם שעתוק Sp1 בתוך קלטת הביטוי ויראלי²⁸. IDLVs ששונה robustly הנתמכים בתיווך CRISPR גן לעריכת במבחנה (בתאים HEK-293T) והן ויוו (בתוך הנוירונים במוח mitotic פוסט), תוך גרימת מוטציות את המטרה מזערית בהשוואה המתאימה בתיווך ICLV מערכות²⁸. בסך הכל, פיתחנו רומן, ערכת CRISPR קומפקטי, ה-all-in-one נישא על פלטפורמה IDLV, התווה את יתרונות שונים של שימוש כזה משלוח הרכב לעריכה ג’ין משופרת.

כאן, פרוטוקול הייצור של המערכת IDLV-CRISPR/Cas9 הוא כמתואר לעיל, כולל את השלבים השונים הכרוכים הרכבה, היטהרות, ריכוז, וכן טיטור של IDLVs, כמו גם אסטרטגיות כדי לאמת את היעילות לעריכת גנים של וקטורים אלה. פרוטוקול זה בקלות להרחבה כדי לענות על הצרכים של חוקרים שונים והוא נועד ליצור בהצלחה LV וקטורים עם titers בטווח של 1 x 10¹⁰ יחידות (טו) transducing / mL. הווקטורים שנוצר באמצעות פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל ביעילות תדביק את מספר סוגי תאים שונים, לרבות קשה-עד-מגלי בתאי גזע עובריים, תאים hematopoietic (תאי-T ו מקרופאגים), ותרבותית, vivo– נוירונים מוזרק. יתר על כן, הפרוטוקול היא באותה מידה מותאם היטב עבור הייצור של וקטורים lentiviral integrase-המוסמכת בכמויות דומות.

איור 1: אריזה IDLV. (א) סכמטית פראי סוג integrase חלבון (ב’) פלסמיד ששונה נבעה psPAX2 (ראה שיטות בנייה פלסמיד לפרטים). נציג agarose ג’ל תמונה של שיבוטים איבחון integrase מוטציה שיבוטים. דגימות די אן איי המוכנים דנ א פלסמיד רגיל בידוד ערכת מיני נותחו על ידי עיכול עם EcoRV ו- SphI. מתעכל כראוי השיבוט (מס ‘ 5, תיבת אדום מקווקו) נוסף אומתה על ידי רצף ישיר (סנגר) עבור החלפה D64E ב INT. בקלטת האריזה לקויה integrase נקרא pBK43. (ג) תיאור סכמטי של פרוטוקול תקנים ארעי מועסקים ליצירת וקטורים IDLV-CRISPR/Cas9, מציג 293T תאים transfected עם VSV-G, אריזה transgene קלטות (Sp1-CRISPR/Cas9 ה-all-in-one פלסמיד). נגיפים זה באד של קרום התא להכיל את הרנ א באורך מלא של וקטור (הביע מ הקלטת transgene). הדור השני של מערכת IDLV-אריזה שימש, אשר כוללת את חלבוני Tat, הכומר Rev ביטוי נוסף מצורפים מ קלטת נפרדת (RSV-REV-פלסמיד). Abbrev: משמאל לימין-ארוך-מסוף stomatitis vesicular אני חוזר, VSV-G, וירוס גרם חלבון, יזם pCMV-cytomegalovirus; סרקומה ראוז יזם וירוס (RSV); הכנה-(רכיב תשובה Rev). רכיבים אחרים רגולטוריות בקלטת ביטוי כוללות אתרים מחייב Sp1, רכיב Rev תשובה (הכנה), מרמיטה הפטיטיס וירוס Posttranscriptional תקינה רכיב (WPRE), מקדם 1α גורם התארכות הליבה (EFS-NC), האריזה וקטור רכיב ψ (psi), אנושי המקדם Cytomegalovirus (hCMV) ויזם U6 אנושי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Protocol

1. culturing HEK-293T תאים ותאים זריעה על תרביות תאים הערה: כליות עובריים אנושיים 293T (HEK-293T) התאים גדלים DMEM, מדיה גלוקוז גבוהות בתוספת 10% שור עגל סרום בתוספת ברזל וצמיחה היזמים, 1 x פתרון אנטיביוטיקה-antimycotic (פתרון x 100 מכיל 10,000 יחידות פניצילין סטרפטומיצין 10 מ ג, 25 µg שהוא גוסס B לכל מ”ל). התקשור…

Representative Results

אימות של נוקאאוט-היעילות של וקטורים IDLV-CRISPR/Cas9השתמשנו GFP-לבטא 293T תאים כמודל כדי לאמת את היעילות של CRISPR/Cas9-מתווכת נוקאאוט גנטי. GFP + תאים נוצרו על ידי התמרה חושית של תאים HEK-293T עם pLenti-GFP (vBK201a)-MOI של 0.5 (איור 3b, “לא-וירוס” לוח). הקלטת sgRNA-כדי-GFP/Cas9 ה-all-in-one וקט…

Discussion

IDLVs החלו להסתמן כמו הרכב של ויוו ג’ין-עריכה, במיוחד בהקשר של מחלות גנטיות, בעיקר בשל הסיכון נמוך מוטגנזה מכוונת המשויך וקטורים אלה בהשוואה שילוב פלטפורמות משלוח²² ^, ²⁸. בחוברת הנוכחית חיפשנו לפרט פרוטוקול המשויך הייצור של המערכת IDLV-CRISPR/Cas9 ה-all-in-one משופרת שפ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות המחלקה לנוירוביולוגיה, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת דיוק ו- Office של דין עבור המדע הבסיסי, אוניברסיטת דיוק. אנו מודים גם חברי הגרעין וקטור ויראלי הדוכס להערות על כתב היד. פלסמיד pLenti CRISPRv2 היה מתנה ג’אנג פנג (במכון). מערכת LV-האריזה כולל את psPAX2 פלסמידים, VSV-G, pMD2.G, pRSV-Rev היה מתנה נחמדה Trono דידייה (EPFL, שווייץ). תמיכה כספית עבור עבודה זו העניקה של דרום קרוליינה מהפקולטה לרפואה באוניברסיטה, להעניק RDF18080-E202 (B.K).

Materials

Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge	Beckman Coulter	369434
xMark Microplate Absorbance plate reader	Bio-Rad	1681150
BD FACS	Becton Dickinson	338960
Inverted fluorescence microscope	Leica	DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL	Corning	430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes	Seton Scientific	5067
Conical tube adapters	Seton Scientific	PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor	Beckman Coulter	369650
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430791
50mL conical centrifuge tubes	Corning	430291
High-binding 96-well plates	Corning	3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid	Corning	353025
100mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
0.22 μM filter unit, 1L	Corning	430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)	Qiagen	27104
Tissue culture pipettes, 5 mL	Corning	4487
Tissue culture pipettes, 10 mL	Corning	4488
Tissue culture pipettes, 25 mL	Corning	4489
Hemacytometer with cover slips	Cole-Parmer	UX-79001-00
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells	ATCC	CRL-3216
293FT cells	Thermo Fisher Scientific	R70007
DMEM, high glucose media	Gibco	11965
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA)	Hyclone	SH30087.04
RPMI 1640 media	Thermo Fisher Scientific	11875-085
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
Trypsin-EDTA 0.05%	Gibco	25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid)	Sigma Aldrich	B9879 – BES
Gelatin	Sigma Aldrich	G1800-100G
Name	Company	Catalog Number	Comments
p²⁴ ELISA reagents
Monoclonal anti-p²⁴ antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3537
HIV-1 standards	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP968F
Polyclonal rabbit anti-p²⁴ antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG	Sigma Aldrich	12-348	Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL	Equitech-Bio	SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL	Sigma	G9023	Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate	KPL	5120-0076	Working concentration 1:10,000
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
pRSV-Rev	Addgene	12253
lentiCRISPR v2	Addgene	52961
Name	Company	Catalog Number	Comments
Restriction enzymes
BsrGI	New England Biolabs	R0575S
BsmBI	New England Biolabs	R0580S
EcoRV	New England Biolabs	R0195S
KpnI	New England Biolabs	R0142S
PacI	New England Biolabs	R0547S
SphI	New England Biolabs	R0182S

References

Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).
Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).
Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146 (2016).
Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9 (12), e115987 (2014).
Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968 (2017).
Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. , (2017).
Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).
Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), e147 (2014).
Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).
Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).
Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).
Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27 (2006).
Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).
Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).
Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).
Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).
Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).
Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).
Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).
Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).
Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).
Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).
. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products – Revisiting Current FDA Recommendations Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017)
. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017)
Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).