A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells

Sriram Vijayraghavan; Boris Kantor

doi:10.3791/56915

JoVE Journal > Genetics

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

유전학

Протокол для производства интеграза недостаточным лентивирусные векторы для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной нокаут генов в делящихся клетках

Published: December 12, 2017

doi:

10.3791/56915

Sriram Vijayraghavan, Boris Kantor

¹Duke Viral Vector Core, Department of Neurobiology,Duke University School of Medicine

Summary

Мы описываем Производственная стратегия интеграза недостаточным лентивирусные векторы (IDLVs) как транспортные средства для доставки ТРИФОСФАТЫ/Cas9 клеток. С возможностью выступить посредником, быстрый и надежный гена редактирования в ячейках IDLVs представляют более безопасным и столь же эффективным вектор платформы для доставки генов по сравнению с интеграза компетентных векторов.

Abstract

Лентивирусные векторы являются идеальным выбором для доставки генов редактирования компонентов клетки из-за их способности для стабильно преобразователя широкий диапазон ячеек и посредническая высокий уровень экспрессии генов. Однако их способность интегрироваться в геном клетки принимающей повышает риск инсерционному мутагенность и таким образом поднимает проблемы безопасности и ограничивает их использование в клинических условиях. Кроме того постоянное выражение гена редактирования компонентов выступил эти интеграции компетентным лентивирусные векторы (ICLVs) увеличивает вероятность прослушивающем гена ориентации. В качестве альтернативы новое поколение интеграза недостаточным лентивирусные векторы (IDLVs) был разработан, рассматриваются многие из этих проблем. Здесь протокол производства новых и усовершенствованных IDLV платформы для редактирования ТРИФОСФАТЫ опосредованной гена и список шаги занимающихся очищения и концентрации таких векторов описан и их электромеханической эффективности ген редактирования с помощью ГЭС 293T был продемонстрирован клетки. Этот протокол легко масштабируема и может использоваться для создания высокого титра IDLVs, которые способны преобразователя клетки в пробирке и в естественных условиях. Кроме того этот протокол может быть легко приспособлено для производства ICLVs.

Introduction

Точное гена редактирования является краеугольным камнем основные биомедицинских достижений, которые предполагают разработку новых стратегий для решения генетических заболеваний. На переднем крае технологий ген редактирования является метод, опираясь на использование cЕврошифер regularly –яnterspaced short palindromic repeats (ТРИФОСФАТЫ) / Cas9 система, которая была первоначально определена как компонент бактериальной иммунитет против вторжения вирусного генетического материала (Обзор ссылки¹^,²). Основным преимуществом системы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 над другими инструменты для редактирования гена, таких как Цинк пальцевый nucleases (ZFNs) и транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) (обзор в ссылку³), является относительная простота плазмида дизайн и Строительство ТРИФОСФАТЫ компонентов — это функция, которая питание расширения гена редактирования из нескольких специализированных лабораторий для гораздо более широкого исследовательского сообщества. Кроме того Простота программирования ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и его потенциала для распознавания цели мультиплексном далее подпитывают его популярность в качестве экономически эффективной и простой в использовании технологии. Среди различных методов, доступных для исследователей, чтобы доставить такой ген редактирования компонентов клетки вирусных векторов на сегодняшний день остаются наиболее популярной и эффективной системы.

Лентивирусные векторы (ПЗ) появились как транспортное средство выбора для доставки компонентов ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы в естественных условиях для различных приложений⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Несколько ключевых функций делают LVs популярным выбором для этого процесса, включая их способность инфицировать деления и не деления клетки, низкой иммуногенностью и минимальным сотовой токсичности (обзор в ссылка⁸). В результате был нанят LV-опосредованной генная терапия в лечении инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ-1, ГВ и ВПГ-1, а также в коррекции дефектов, лежащих в основе человеческого наследственных заболеваний, таких, как кистозный фиброз и нео сосудистая дегенерация желтого пятна ⁴ ^, ⁵ ^, ⁷ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹. Кроме того, LVs эффективно изменен для выполнения мультиплекс гена редактирования на собственный геномной локусов, используя один вектор системы¹².

Однако присущие собственности LVs интегрировать в хост геномов может быть мутагенных и часто препятствует их полезность как средства доставки трансген, особенно в клинических условиях. Кроме того поскольку стабильно интегрированных LVs выразить их трансгенов на устойчиво высоком уровне, эта система плохо подходит для доставки генов редактирования компонентов, таких как ТРИФОСФАТЫ/Cas9; Сверхэкспрессия Cas9-руководство РНК (gRNA) и похожие белки, такие как ZFNs, связаны с повышенным уровнем пробить эффектов, которые включают в себя нежелательные мутации¹³^,¹⁴^,^,¹⁵¹⁶ ^, ¹⁷ и потенциально может повысить цитотоксичность¹⁸. Таким образом для достижения точного редактирования гена с минимальными пробить эффекты, важно для разработки систем, которые позволяют для переходных экспрессии гена редактирования компонентов.

В последние годы был разработан целый ряд платформ доставки выразить временно ТРИФОСФАТЫ/Cas9 в клетки¹⁶^,–¹⁹^,²⁰^,²¹ (обзор в ссылку²²). К ним относятся методы, которые полагаются на непосредственно представляя очищенный Cas9 вместе с соответствующим руководством РНК в клетки, который был показан более эффективными на целевых генов редактирования по сравнению с плазмида опосредованной трансфекции¹⁶. Исследования показали, что рибонуклеопротеида (RNP) комплексов, состоящих из руководство РНК/Cas9 частиц быстро перевернулся после посреднических расщепления ДНК на их цели, предполагая, что краткосрочные выражение этих компонентов является достаточной для достижения надежные ген редактирования¹⁶. Предположительно,-интеграция вирусный вектор платформ, таких как аденоассоциированный вирусных векторов (AAVs) может обеспечить жизнеспособную альтернативу доставить ген редактирования техники в клетки. К сожалению, Аав capsids обладают значительно ниже возможности упаковки чем LVs (< 5kb), которая серьезно ограничивает их способность упаковки многокомпонентных ТРИФОСФАТЫ инструментарий в пределах одного вектора (обзор в ссылка⁸). Стоит отметить, что для увеличения лентивирусные титры было показано добавление соединений, которые подавляют гистона комплексы (например, натрия бутират²³) или препятствуют клеточного цикла (например, кофеин²⁴). Несмотря на недавний прогресс переходных выражение систем, разработанных до настоящего времени по-прежнему препятствует ряд недостатков, например ниже эффективности производства, которые ведут к снижение вирусной титры и низкой электромеханической эффективности вирусов, порожденных через такие подходы к²⁵.

Интеграза недостаточным лентивирусные векторы (IDLVs) представляют собой основные улучшения в развитии средств доставки генов, как они сочетают в себе возможность упаковки LVs с дополнительным преимуществом AAV-как episomal содержание в клетках. Эти функции помогают IDLVs значительной степени обойти основные вопросы, связанные с интеграции векторы, vis-à-vis непрерывной гиперэкспрессия потенциально генотоксичных элементов и интеграции опосредованной мутагенность. Ранее было показано, что IDLVs может быть успешно изменен для повышения episomal ген выражение²⁶^,²⁷. Что касается IDLV-опосредованной ТРИФОСФАТЫ/Cas9 доставки низкие производственные титры и Нижняя выражение episome нести геномов относительно интеграза владеют лентивирусные систем ограничивает их полезность как средства bona fide для доставки изменения генома Трансгенные конструкции. Мы недавно продемонстрировали, что трансген выражение и вирусных титры, связанные с производством IDLV значительно усиливается включение привязки сайтов для транскрипционного фактора Sp1 в течение вирусных выражение кассеты²⁸. Изменение IDLVs энергично поддерживает ТРИФОСФАТЫ опосредованной гена, редактирования в пробирке (в клетках ГЭС 293T) и в естественных условиях (в постсоветском митотическая мозга, нейроны), а заставить минимальный пробить мутации, по сравнению с соответствующим ICLV-опосредованной ²⁸систем. В целом мы разработали роман, компактный, все-в-одном инструментарий ТРИФОСФАТЫ осуществляется на платформе IDLV и изложил различные преимущества использования такого доставки транспортного средства для расширения гена редактирования.

Здесь протокол производства системы IDLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 описано, включая различные этапы в Ассамблее, очистки, концентрации и титрование IDLVs, а также стратегии для проверки редактирования гена эффективность этих векторов. Этот протокол легко масштабируется для удовлетворения потребностей различных следователей и предназначен для успешного создания LV векторов с титры в диапазоне от 1 x 10¹⁰ преобразователя единиц (ту) / мл. Векторы, порожденных через этот протокол может использоваться эффективно заразить несколько различных типов клеток, включая сложные передают эмбриональных стволовых клеток, гемопоэтические клетки (Т-лимфоцитов и макрофагов) и культивировали и в vivo– вводят нейронов. Кроме того протокол одинаково хорошо подходит для производства интеграза компетентных лентивирусные векторы в аналогичных количествах.

Рисунок 1: Упаковка IDLV. () схема дикого типа интеграза белка (b) изменение плазмида была взята из psPAX2 (см. методы, плазмида строительство для подробной информации). Представитель агарозы гель изображение клонов, экранированный мутировавших интеграза клонов. Пищеварение с EcoRV и SphI были проанализированы образцы ДНК, подготовлен с использованием стандартных плазмида ДНК изоляции Мини-кит. Правильно переварить клон (число 5, пунктирной красной рамкой) был проверен последовательности прямых (Сэнгер) для замены D64E в INT. Кассета интеграза недостаточным упаковки был назван pBK43. (c) схема протокола переходных трансфекции работу для создания IDLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 векторов, показываю что transfected клеток 293T с VSV-G, упаковки и трансген кассеты (Sp1-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 все-в-одном плазмида). Вирусные частицы, которые бутон из клеточной мембраны содержат полнометражного РНК вектора (выразил от трансген кассеты). Второе поколение IDLV-упаковочные системы была использована, которая включает в себя регуляторных белков ТАТ и преподобный Rev выражение дополнить с отдельной кассеты (RSV-REV-плазмиды). Abbrev: вирус повтор, VSV-G, везикулярного стоматита LTR-Лонг терминал G-белок, промоутер pCMV цитомегаловирус; Промоутер саркомы Рауса вирус (RSV); RRE-(Rev ответ элемент). Другие нормативные элементы на кассету выражения включают Sp1-привязки сайтов, Rev ответ элемента (RRE), сурок гепатитом вирус посттранскрипционного регулирования элемент (WPRE), удлинение основной фактор 1α промоутер (EFS-NC), упаковка вектор элемент ψ (psi), человека промоутер цитомегаловирус (hCMV) и человека U6 промоутер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

1. выращивание ГЭС 293T и заполнения ячейки для Transfection Примечание: Человеческих эмбриональных почки 293T клетки (ГЭС 293T), выращенных в среде DMEM, высокие глюкоза СМИ с 10% бычьего теленка сыворотки, дополненная железа и роста промоутеров и 1 x антибиотик противогрибковое решение (10…

Representative Results

Проверка эффективности плей IDLV-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 векторовМы использовали GFP-выражая 293T клетки как модель для проверки эффективности ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной Нокаут гена. GFP + клетки были порожденных трансдукции ГЭС 293T клеток с pLenti-GFP (vBK201a) в MOI 0.5 (…

Discussion

IDLVs начали появляться как средство выбора в vivo гена редактирования, особенно в контексте генетических заболеваний, главным образом ввиду низкого риска мутагенеза, связанные с эти векторы, по сравнению с интеграции платформ доставки²² ^, ²⁸. в текущем ру…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Департамент нейробиологии, школа медицины при университете Дьюка и деканат по фундаментальной науки, Университет Дьюка. Мы также благодарим членов герцог вирусный вектор ядра для комментариев на рукопись. Плазмида pLenti CRISPRv2 был подарок от Чжан Фэн (широкой институт). LV-упаковочная система, включая psPAX2 плазмид, VSV-G, pMD2.G и pRSV-Rev был вид подарок от наконец Дидье (EPFL, Швейцария). Финансовая поддержка для проведения этой работы была оказана университета Южной Каролины школы медицины, Грант RDF18080-Е202 (B.K).

Materials

Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A99839
Allegra 25R tabletop centrifuge	Beckman Coulter	369434
xMark Microplate Absorbance plate reader	Bio-Rad	1681150
BD FACS	Becton Dickinson	338960
Inverted fluorescence microscope	Leica	DM IRB2
0.45-μm filter unit, 500mL	Corning	430773
Conical bottom ultracentrifugation tubes	Seton Scientific	5067
Conical tube adapters	Seton Scientific	PN 4230
SW32Ti swinging-bucket rotor	Beckman Coulter	369650
15 mL conical centrifuge tubes	Corning	430791
50mL conical centrifuge tubes	Corning	430291
High-binding 96-well plates	Corning	3366
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid	Corning	353025
100mm TC-Treated Culture Dish	Corning	430167
0.22 μM filter unit, 1L	Corning	430513
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)	Qiagen	27104
Tissue culture pipettes, 5 mL	Corning	4487
Tissue culture pipettes, 10 mL	Corning	4488
Tissue culture pipettes, 25 mL	Corning	4489
Hemacytometer with cover slips	Cole-Parmer	UX-79001-00
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells	ATCC	CRL-3216
293FT cells	Thermo Fisher Scientific	R70007
DMEM, high glucose media	Gibco	11965
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.04
Antibiotic-antimycotic solution, 100X	Sigma Aldrich	A5955-100ML
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	S8636-100ML
Non-Essential Amino Acid (NEAA)	Hyclone	SH30087.04
RPMI 1640 media	Thermo Fisher Scientific	11875-085
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
Trypsin-EDTA 0.05%	Gibco	25300054
BES (N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-amino-ethanesulfonic acid)	Sigma Aldrich	B9879 – BES
Gelatin	Sigma Aldrich	G1800-100G
Name	Company	Catalog Number	Comments
p²⁴ ELISA reagents
Monoclonal anti-p²⁴ antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3537
HIV-1 standards	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP968F
Polyclonal rabbit anti-p²⁴ antibody	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP451T
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG	Sigma Aldrich	12-348	Working concentration 1:1500
Normal mouse serum, Sterile, 500mL	Equitech-Bio	SM30-0500
Goat serum, Sterile, 10mL	Sigma	G9023	Working concentration 1:1000
TMB peroxidase substrate	KPL	5120-0076	Working concentration 1:10,000
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
pRSV-Rev	Addgene	12253
lentiCRISPR v2	Addgene	52961
Name	Company	Catalog Number	Comments
Restriction enzymes
BsrGI	New England Biolabs	R0575S
BsmBI	New England Biolabs	R0580S
EcoRV	New England Biolabs	R0195S
KpnI	New England Biolabs	R0142S
PacI	New England Biolabs	R0547S
SphI	New England Biolabs	R0182S

References

Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 181-190 (2010).
Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
Bellec, J., et al. CFTR inactivation by lentiviral vector-mediated RNA interference and CRISPR-Cas9 genome editing in human airway epithelial cells. Curr Gene Ther. 15 (5), 447-459 (2015).
Kennedy, E. M., et al. Suppression of hepatitis B virus DNA accumulation in chronically infected cells using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided DNA endonuclease. Virology. 476, 196-205 (2015).
Roehm, P. C., et al. Inhibition of HSV-1 Replication by Gene Editing Strategy. Sci Rep. 6, 23146 (2016).
Wang, W., et al. CCR5 gene disruption via lentiviral vectors expressing Cas9 and single guided RNA renders cells resistant to HIV-1 infection. PLoS One. 9 (12), e115987 (2014).
Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv Genet. 87, 125-197 (2014).
Lebbink, R. J., et al. A combinational CRISPR/Cas9 gene-editing approach can halt HIV replication and prevent viral escape. Sci Rep. 7, 41968 (2017).
Xu, L., et al. CRISPR/Cas9-Mediated CCR5 Ablation in Human Hematopoietic Stem/Progenitor Cells Confers HIV-1 Resistance In Vivo. Mol Ther. , (2017).
Yiu, G., Tieu, E., Nguyen, A. T., Wong, B., Smit-McBride, Z. Genomic Disruption of VEGF-A Expression in Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using CRISPR-Cas9 Endonuclease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5490-5497 (2016).
Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Res. 42 (19), e147 (2014).
Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 32 (3), 279-284 (2014).
Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).
Pattanayak, V., et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol. 31 (9), 839-843 (2013).
Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
Schaefer, K. A., et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods. 14 (6), 547-548 (2017).
Choi, J. G., et al. Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing. Gene Ther. 23 (7), 627-633 (2016).
Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Res. 43 (13), 6450-6458 (2015).
Nelson, C. E., Gersbach, C. A. Engineering Delivery Vehicles for Genome Editing. Annu Rev Chem Biomol Eng. 7, 637-662 (2016).
Jaalouk, D. E., Crosato, M., Brodt, P., Galipeau, J. Inhibition of histone deacetylation in 293GPG packaging cell line improves the production of self-inactivating MLV-derived retroviral vectors. Virol J. 3, 27 (2006).
Ellis, B. L., Potts, P. R., Porteus, M. H. Creating higher titer lentivirus with caffeine. Hum Gene Ther. 22 (1), 93-100 (2011).
Hoban, M. D., et al. Delivery of Genome Editing Reagents to Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 36, 1-10 (2016).
Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 16 (12), 1968-1976 (2008).
Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18786-18791 (2009).
Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Mol Ther Methods Clin Dev. 5, 153-164 (2017).
Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Mol Ther. 19 (3), 547-556 (2011).
Berkhout, B., Verhoef, K., van Wamel, J. L., Back, N. K. Genetic instability of live, attenuated human immunodeficiency virus type 1 vaccine strains. J Virol. 73 (2), 1138-1145 (1999).
Gomez-Gonzalo, M., et al. The hepatitis B virus X protein induces HIV-1 replication and transcription in synergy with T-cell activation signals: functional roles of NF-kappaB/NF-AT and SP1-binding sites in the HIV-1 long terminal repeat promoter. J Biol Chem. 276 (38), 35435-35443 (2001).
Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. J Biol Chem. 280 (22), 21545-21552 (2005).
Ortinski, P. I., Lu, C., Takagaki, K., Fu, Z., Vicini, S. Expression of distinct alpha subunits of GABAA receptor regulates inhibitory synaptic strength. J Neurophysiol. 92 (3), 1718-1727 (2004).
Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. J Virol. 71 (8), 6113-6127 (1997).
Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 68 (4), 2632-2648 (1994).
Xu, W., Russ, J. L., Eiden, M. V. Evaluation of residual promoter activity in gamma-retroviral self-inactivating (SIN) vectors. Mol Ther. 20 (1), 84-90 (2012).
. Testing for Replication Competent Retrovirus (RCR)/Lentivirus (RCL) in Retroviral and Lentiviral Vector Based Gene Therapy Products – Revisiting Current FDA Recommendations Available from: https://sites.duke.edu/dvvc/files/2016/05/FDA-recommendation-for-RCR-testing.pdf (2017)
. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2017)
Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (130), e56915, doi:10.3791/56915 (2017).