Summary
新しいプロトコルを特定し人間由来の微粒子を特徴付けるとおりマウス好中球。これらのプロトコルは遠心、フローサイトメトリーとイムノブロット微粒子コンテンツを分析する手法を活用し、細胞機能のさまざまなセル型から派生した微粒子の役割を研究する使用できます。
Abstract
多形核好中球由来マイクロパーティクル (PMN)-国会議員) が脂質二重層、サイズ直径 50-1,000 nm に至ると球状機構の解明。MPs は、新しく進化して、細胞間コミュニケーションとシグナリング機械の重要な部分です。彼らのサイズと彼らのリリースの性質のため最近まで MP 存在を見落としていた。しかし、技術の向上と分析方法健康および病気の機能今浮上しています。ここに示すプロトコルは、フローサイトメトリーとイムノブロットによって分離して PMN MPs を評価を目指しています。さらに、いくつかの実装例のとおりです。MP 分離のこれらのプロトコルは高速で低コスト、および高価なキットの使用を必要としません。また、彼らは MPs 前 MP リリースする前にコピー元のセルのラベルし同様、次の分離、フローサイトメトリーによる可視化・解析用膜固有の蛍光染料を使用してのラベルにできます。これらのメソッドただし、Pmn と MPs と高度な分析機器の必要性の純度を含むいくつかの制限があります。ハイエンドの流れの cytometer は確実に MPs を分析し、ノイズまたは自動蛍光性のための偽肯定的な読み取りを最小限に抑えるために必要です。記述されていたプロトコル分離し、MP 器官を定義する使用ことができ、そのマーカーと異なる刺激的な条件の下での組成変化の特徴します。エクソソーム対膜の粒子の内容が異なっているかどうか、組織の恒常性に異なる役割を満たしているかどうかを調査するためサイズの不均一性を利用できます。最後に、次の分離と MPs、細胞応答の機能および様々 な疾患モデル (を含む、多形核白血球の炎症性疾患、炎症性腸疾患や急性肺障害など) の特性を探索できます。
Introduction
最近では、「微粒子/ミクロベシクル「細胞細胞質または細胞膜由来が新興が示唆された、直径 50 1,000 nm に至るこれら構造が生物学的情報を運ぶことができる偉大な科学的な興味のなると携帯電話通信の非標準のメソッドとして機能します。免疫細胞の MPs と Pmn のホストの防衛の1、2、炎症性応答3、および創傷治癒に重要な役割を与えられたの関心は、好中球 (Pmn) 作り出される特にそれら4. 興味を持って、これまで多数のレポートを示しているプロ炎症性と抗炎症機能 PMN MPs の5潜在的なコンテキスト-病気-種-、MPs の臓器固有の役割を示唆しています。
この通信で説明されているプロトコルは、健康と病気における MPs の機能を研究するコスト効果の高い、革新的な柔軟メソッドを提供します。彼らは多くのモデル有機体、器官、および刺激条件に適用されます。彼らは MPs のいくつかの種類の同定を可能にする、プロ炎症性と抗炎症機能に対処するため、将来的に使用できます。例として記述されている上皮創傷治癒の in vitroおよびin vivoにおける PMN MPs の関数を勉強する方法があります。マウス骨髄由来の Pmn は前述方法6からいくつかの変更と合わせられたの隔離のため提案するプロトコル。
さらに、この研究で説明されているプロトコルは検出と PMN MPs の 2 つの相補的な方法で見つけることができます特定のマーカーの評価、: 西部のしみし、フローサイトメトリーします。我々 は、標準プロトコル5を使用して MPs の免疫ブロットは簡単で信頼性の高い、しかし、流れ cytometry 計測器、および改良された騒音に信号の比率の感度の最近の進歩により、MPs のさらなる分析このメソッドを使用して見つけます。本研究では記述されていたプロトコルを組み込む最近の進歩と遠心分離速度と時間のサンプル フィルタ リングと凍結/ストレージの条件のための7の加算への変更を含む元の研究の記事からの提言,8、および「バック グラウンド ノイズ」を削減、PMN MPs の検出限界を向上、MPs のさまざまなサイズの間で区別する方法。
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Protocol
すべての動物の仕事は、北西 IACUC によって承認されました。すべての実験は、調和とすべての関連する規制・制度のガイドラインの遵守に完了しました。献血者の人権のインフォームド コンセントを提示され、署名されて。さらに、本研究ではすべての被験者は、福祉の機関および連邦政府のガイドラインに従って扱われました。
注: プロトコルの手順は以下のサブセクションの下で表示されます: (i) マウス骨髄細胞の隔離;(ii) 多形核白血球の分離から骨髄;(ヒトの血液から iii) PMN の隔離(iv) MP (遠心); によって多形核白血球培養上清から分離(v); ウエスタンブロット法による MPs のキャラクタリゼーション(vi); フローサイトメトリーによる MPs のキャラクタリゼーション(viii) 孤立した国会議員の研究創傷治癒過程への応用
1. マウス骨髄細胞分離
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大腿骨と脛骨マウスの後脚からの解剖
- 吸入麻酔のため安楽死ボックス (例えば、空 1 mL ヒント] ボックス) を準備します。プラスチックの箱の蓋の内側にテープで滅菌布の上に 100% イソフルランを数滴を追加します。新しい IACUC ガイドラインに従って動物必要がありますないイソフルランとの直接接触入って来、従ってマウスとガーゼ、イソフルランを含むチップ ホルダーを配置します。
注: イソフルラン強力な吸入麻酔薬は、ヒューム フードの中慎重に処理する必要があります。 - IACUC 勧告に従ってマウスを安楽死させます。それは呼吸を停止しているまで手順 1.1.1 1-5 分で説明安楽死ボックス内には、マウスを配置します。頚部転位を実行することによって動物の死を確認します。
- ステンレス製 12 センチ、腹部皮膚 0.17 × 0.1 mm ピンセットを持ち上げて肌上部と下肢の間の半分の方法をカットします。ここから下肢を含むマウス本体の最も遠位部の皮膚の皮をむきます。10 cm 長い、まっすぐ解剖はさみ、後ろ足から筋肉を削除、大腿骨頭をそのまま股関節を脱臼します。
- はさみを使用すると、大腿骨と脛骨から筋肉を細かく分析し、大腿骨と脛骨を切り離します。骨髄のかなりの量を含んでいるので、骨の両端はそのまま残ることを確認します。
- ペーパー タオル中骨を圧延によってすべての残り肉を削除します。無血清培地 (SFM、すなわち、ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 血清または抗生物質なし) を含むペトリ皿にきれいな骨を配置します。
- 70% のエタノールで、SFM の骨をすすいでください。
- 50 mL の円錐管に SFM の 50 mL を準備します。SFM の 10 mL を 10 mL のシリンジに読み込む、25、5/8 インチのゲージの針を取り付けます。
- 骨髄 (赤み) に開口部が表示されるまでは、ハサミで骨の端をトリミングします。
- 新しい 50 mL のチューブに骨髄細胞をフラッシュします。約 3 mL/骨 SFM の 26、5/8 インチ g 針、10 mL の注射器を使用します。フラッシュしたら、細胞凝集塊を破る (使用使い捨て 1 mL プラスチック ヒント) をピペッティングによりチューブに細胞を再懸濁します。
- 吸入麻酔のため安楽死ボックス (例えば、空 1 mL ヒント] ボックス) を準備します。プラスチックの箱の蓋の内側にテープで滅菌布の上に 100% イソフルランを数滴を追加します。新しい IACUC ガイドラインに従って動物必要がありますないイソフルランとの直接接触入って来、従ってマウスとガーゼ、イソフルランを含むチップ ホルダーを配置します。
2. PMN マウス骨髄から分離
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赤のセル換散
- 4 ° C で 8 分間 350 × gで遠心分離によって収集された骨髄をペレットします。
- 0.2 %20 mL で細胞ペレットを再懸濁します赤血球画分を分離する約 20-30 秒の塩化ナトリウム。30 を超えていないこの s は PMN の換散になります。1.6 %20 mL を加えて浸透圧を復元する塩化ナトリウム。
注: この手順は非常に少しの多形核白血球の活性化につながる可能性があります。 - 2 ml の PBS とステップ 2.1.1 上記と同様に遠心分離機のセルを洗浄します。上澄みを除去します。
- 密度勾配遠心法による分離 Pmn に進みます。
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密度勾配遠心法による好中球の隔離
- 暖かい polysucrose ナトリウム diatrizoate ソリューション、1.119 g/mL と 1.077 g/mL (材料の表を参照してください)、使用する前に部屋の温度 (RT) の密度の。
- Diatrizoate グラデーション 1.077 グラム/mL の濃度溶液 15 mL の円錐管に 1.119 グラム/mL の濃度溶液 3 mL 以上 3 mL をゆっくりとレイヤリングによって骨髄細胞処理直前に、新鮮な polysucrose、ナトリウムを準備します。
注: 事前に遠くグラデーション溶液の調製は、層と貧しい好中球純度と回復の混合になります。 - 1 mL の氷冷 PBS で骨髄細胞ペレットを再懸濁します、polysucrose、ナトリウムの diatrizoate の上に生じる細胞懸濁液をオーバーレイ勾配 (ゆっくりと、層の混合を避けるために)。
- ブレーキなしの RT で 25 ° C で 850 x g で 30 分間遠心します。他の細胞は骨髄に存在から好中球の効果的な分離のため、RT で試薬を維持します。グラデーションを効率的に形成し、遠心分離のステップ後管理のできるように減速で遠心分離機を設定します。
- 視覚的に PBS の 1.077 グラム/mL の密度ソリューション (上層) 界面の単核細胞層を探します。PMN バンドを乱すことがなく、この層と密度ソリューションの残りの部分を削除します。
- 転送ピペットを使用して 15 mL チューブに PMN レイヤー全体といくつかの基になる polysucrose とナトリウム diatrizoate 1.119 g/mL の溶液を収集します。
注: 孤立した Pmn の純度は、上側のレイヤーの完全な除去に依存します。 - フィルター処理 (0.1 μ m 孔サイズのフィルターで濾過) PBS や 300 x g で 4 ° C で 5 分間遠心チューブをトップします。
- 2.2.7 のステップのように遠心分離条件を使用して PBS の 2 ml 小球形にされた Pmn を洗います。
- フィルター処理された PBS の 1 mL で再懸濁します、検定によって孤立した Pmn をカウントします。
注: この分離メソッドの結果の PMN 純度になる ~ 85-90%、フローサイトメトリーによって評価されました。主に単核リンパ球の残りの分数を汚染で構成されています。
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MP のリリースを誘発する多形核白血球の刺激
注: Pmn はインターフェロン γ (肝腎) やホルボール 12-ミリスチン酸-13-アセタート (PMA)、N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF) を含む、さまざまな活性化条件を使用して Mp を解放する刺激できます。重要なは、シミュレーション、前に Pmn おく氷の上すべての回で。- ペレット Pmn (300 × g、5 分、4 ° C) と 0.1 μ m で再懸濁しますフィルター ・ ハンクの平衡塩類 (HBSS) ソリューション、好みの刺激剤を含みます。最適な刺激は、15 mL の管に 37 ° C で 20-30 分の 1000 万 Pmn あたり 100 μ L 刺激ソリューションを使用します。
注: アクティベーターの次の濃度が正常に我々 の以前の仕事で使用: fMLF (0.5-1 ヒトとマウス Pmn の 2-5 μ M の μ M)、PMA (200 nM)、および肝腎 (100 ng/mL)。事前ラベル MPs のリリースが必要な場合インキュベート些細 Pmn (10 x 1 56) N-(2-aminoethyl) マレイミド FITC と (材料の表を参照してください) (100 μ L HBSS、15 分、37 ° C で 1 μ M)。2.3.1-2.3.3 の手順を続行します。 - Pmn を削除し、細胞培養上清を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送 4 ° C で 5 分間 850 x g でスピンダウンします。
- MP 分離細胞の培養上清から、4.2 の手順に進みます。
- ペレット Pmn (300 × g、5 分、4 ° C) と 0.1 μ m で再懸濁しますフィルター ・ ハンクの平衡塩類 (HBSS) ソリューション、好みの刺激剤を含みます。最適な刺激は、15 mL の管に 37 ° C で 20-30 分の 1000 万 Pmn あたり 100 μ L 刺激ソリューションを使用します。
3. ヒトの血液から PMN の隔離
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機関の IRB のガイドラインに従って採血の健康なボランティアを募集します。
- 健康ボランティアの前腕部から市販 5 mL クエン酸ナトリウム含有チューブ (材料の表を参照してください) に血液を収集します。
- デキストランおよびナトリウムの diatrizoate 溶液 5 mL をピペット (1.113 グラム/mL の濃度は、材料表を見なさい) 滅菌 15 mL チューブ、ゆっくりとレイヤーの上に新鮮な孤立したひと末梢血 5 mL に。
- 室温 (25 ° C) で低加速 g x 400 でないブレーキ 50 分間チューブを遠心します。
- 遠心分離の最後には、プラズマと単核細胞 (上層) 滅菌プラスチック吸引ピペットを使用してを削除します。
- 新しい滅菌 50 mL のコニカル チューブに下部層 (PMNs) を転送します。
- 0.45% の等量を追加 Pmn (ミックスも、軽くチューブを回転させることにより) 塩化ナトリウム。
- 25 ° C で 400 × g で 10 分間遠心
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赤のセル換散
- 45 の小球形にされたセルに 10 mL の冷たい、滅菌水を追加 s に続いて 10 mL の氷冷滅菌 1.8% の塩化ナトリウム浸透圧を復元します。
注: PMN の隔離のためのすべての次の手順は、多形核白血球の活性化と早期の MP 放出を避けるために氷の上行わなければなりません。散のステップ自体は軽度だが、重要ではない多形核白血球の活性化の結果、しかし、それは機能の試金のための純粋な多形人口を隔離するために不可欠です。 - ソフト減速 4 ° C で 250 x g で 10 分の細胞を遠心します。
- 3.2.1、3.2.2 の手順を繰り返します。
- カルシウムやマグネシウムなし冷たい HBSS の 5 mL の PMNs を再懸濁します。総生きているセルをカウント (検定と生存率 2:1 希釈で染色を使用、材料の表を参照してください) 刺激する前に。
注: 孤立した Pmn は刺激や分離の 2 時間以内の他の実験のため機能および細胞の変化と細胞死を避けるために使用する必要があります。
- 45 の小球形にされたセルに 10 mL の冷たい、滅菌水を追加 s に続いて 10 mL の氷冷滅菌 1.8% の塩化ナトリウム浸透圧を復元します。
4 活性化された PMN の培養上清から MP 分離
注: 同様のプロトコルはマウスとヒト Pmn からの MPs の分離されます。
- ペレット Pmn (300 × g、5 分、4 ° C) と 0.1 μ m で再懸濁しますフィルター HBSS ソリューション選択の刺激剤を含む (例 1 μ M fMLF 参照してください注: 2.3.1)。最適な刺激 15 mL チューブで 37 ° C で 20-30 分の 1000 万 Pmn あたり 100 μ L 刺激ソリューションを使用します。
- 次の刺激は 4 ° C で 5 分間 600 x g で活性化された Pmn スピンダウンし、細胞培養上清を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送。
- 13,000 × g、10 分、細胞の残骸を削除し、クリアの上清を新しい遠心管に転送 4 ° C で PMN クリア上清を遠心します。
- 4 ° C で、100,000 × g で 1 h、遠心分離MP 保管する前に培養上清を削除します。必要に応じて、ストアは-80 ° C で遠心管を実験で使用するまで封印パラフィンで MPs をペレットしました。
5. 西部にしみが付くことによって国会議員の多形核白血球の検査
- 1 %sds バッファーを追加 (100 mM Tris pH と 50-200 μ L: 7.4) ペレット MPs に (手順 4.4) から新しい 1.5 mL 遠心チューブの転送と 5 分間分離の MPs を沸騰します。
注: MPs および換散バッファーのボリュームの数する必要があります調整し、興味の各蛋白質のために最適化されました。 -
10% β-メルカプト-エタノールを含むバッファーの読み込み中レーンあたり PMN MPs の同量をロードします。
注: 当社の方法で刺激 Pmn の同じ数から分離された MPs を読み込みます。- 10% ポリアクリルアミドゲルの SDS-PAGE による lysates を分離 (1 〜 1.5 h 50 100 V を使用) と説明9としてニトロセルロース膜に総蛋白質を転送。
- 0.05% Tween 20 含有トリス緩衝生理食塩水、5% 無脂肪牛乳で 1 h の膜をブロックし、HRP 標識二次抗体に続いて (一晩で 4 ° C)、適切なプライマリと孵化します。
- 膜と耐光性カセット (1-24 h) 内の x 線フィルムを露出する電気ソリューションを追加することによってバンドを視覚化します。
6. フローサイトメトリーによる国会議員の多形核白血球の検査
-
抗体の汚損のため FACS バッファー (0.1 ミリメートルの EDTA、0.1% アジ化ナトリウムと PBS) で適切に抗体を希釈します。PMN MPs にペレットを再懸濁します (10 x 1 3 から派生した6 Pmn/条件) 100 μ L 抗体溶液で。
- アネキシン V で染色、アネキシン V の FITC 結合の 5 μ L を含むアネキシン V バッファーの小球形にされた PMN MPs を再懸濁します。抗体染色、アネキシン V ソリューションに直接目的抗体 (使用例は材料のテーブル) を追加します。蛍光脂質色素、N-(2-aminoethyl) マレイミドを追加 (材料の表を参照)、ラベルし、MPs の識別に FACS バッファーの 100 μ L に 1 μ M の濃度で。
- 染色液を 4 ° C で少なくとも 20 分の MPs を孵化させなさい
- 超遠心法 (100,000 × g、4 ° c で 1 h); で Mp を洗う上清を捨てます。
- FACS バッファーで再懸濁し、感度の向上のためのアップグレードされた電子ユニット装備指定流れの cytometer でサンプルを実行 (材料の表を参照してください)。
7. 創傷治癒における多形核白血球の機能を研究する孤立した PMN MPs 申請
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体内管理 PMN MPs の大腸の傷に
- ケタミン (100 mg/kg) とキシラジン (5 mg/kg) の混合物の腹腔内投与によるマウスを麻酔します。ペダル反射 (しっかりつま先ピンチ) によって麻酔を確認し、必要に応じて調整します。
- その胃と 28 cm 生検鉗子と高解像度カメラを搭載した内視鏡を使用して、マウスを置きます (小動物用動物用内視鏡など材料の表を参照)、3-5 の背側に沿って表面的な傷を生成、コロン。負傷の完了時にケージに戻りマウスは回復するまで温度制御 (37 ° C) マットに配置されます。
- (ステップ 7.1.1) のようにマウスを麻酔します。内視鏡を使用して、傷を与えた 24 時間 (1 日目) が負傷した後の画像を取得します。マウス ステップ 7.1.2 のように回復をしましょう。
- (24 h 後負傷) 同時に、大腸内視鏡検査を用いたマイクロインジェクション システム (29 G 針使用)9を使用して各傷のサイトに 100 μ L の HBSS + 直接で 2 x 106 Pmn から派生したマウス PMN MPs を管理します。3 日後 (4 日後負傷) (ステップ 7.1.1) のようにマウスを麻酔し、傷を癒しの画像を再取得する内視鏡を使用します。マウス ステップ 7.1.2 のように回復をしましょう。
- 最寄りの画像解析ソフトウェアを使用して取得した画像、同じエリア 1 人が負傷した後、4 日で傷し、傷の閉鎖のパーセンテージを計算するメジャーで (材料の表を参照)、アウトライン表示傷領域。
-
人間の上皮細胞の in vitro創傷治癒
- カウント カコ 2 BBe または T84、検定と種子 5 x 10 の5細胞/ウェル 24 ウェル培養皿でひと腸管上皮細胞。37 ° C と 5% の CO2の標準培養チャンバーに細胞を孵化させなさい。カコ 2 BBe や T84 48 h9内の confluency に到達します。上皮細胞の培養、以前サプリメントに DMEM と DMEM F12 (50: 50) を利用して9を説明します。
- ピペット チップを使用して単分子膜の機械的スクラッチ傷を生成し、低吸引前述した4,9。直後の時間として使用される倒立位相微分干渉顕微鏡 (5 X、10 X の使用目的) を使用してスクラッチ傷領域の画像を取得 = 0 基準点。
- 上皮細胞の傷が負傷する MPs (2-4 106 Pmn X から派生) を追加し、(48 時間後負傷、5% CO2と 37 ° C で) 追加 24 時間インキュベートします。この時にスクラッチ傷の画像を再取得します。
- 最寄りの画像解析ソフトを使用して (材料の表を参照) t で傷の面積を測定する = 0 および t 48 h. 創閉鎖の割合を計算するを選択した時点で傷の領域の違いを決定することにより =。
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Representative Results
代表的なヒトから分離された、マウスの Pmn MPs のフローサイトメトリーによる解析は、図 1に表示されます。PMN MPs のサイズの不均一性を評価して、図 1A, Bに示すように、サイズのビーズを比較することにより MPs。 メモ人間のする、サイズの不均一性に有意差は認められなかったマウスと人間の MPs の間.同様に、マウスまたは人間の起源の独立した MPs による選択のタンパク質/s の式はフローサイトメトリー、蛍光標識を使用して決定できます。ホスファチジルセリン (PhS) の発現を調べることができますたとえば、アネキシン V で染色。マウス骨髄 PMN MPs は図 1C、Dに表示されます。アネキシン V と CD11b 染色人間 MPs、図 2A、Bに示すように、選択のいくつかのマーカーの発現を評価もできます。フローサイトメトリーによる PMN MPs を検出する別の方法は、図 2Cに示すように、刺激する前に離 Pmn を染色します。たとえば、PMN 脂質マーカー N-(2-aminoethyl) マレイミド FITC 緑 MPs のリリースで fMLF 刺激の結果前に染色を容易に検出できる流れによって。注記のうち、N-(2-aminoethyl) マレイミド FITC と染色しながら以前に使用されているラベルし、末梢血中10から取得または動物11、ラベリングのための目的のため他のマーカーの使用に注入された MPs を検出生体外でまたは生体内でアプリケーションは、調査員によって決定する必要があります。Cytometry 流れに加えて PMN 国会議員は興味の蛋白質のイムノブロット分析できます。図 3 MPs のいくつかの既知の活性剤で刺激された人間の Pmn から派生のように、キー炎症の発現を調べた (マトリックス メタロペプチダーゼファミリー 9 (MMP-9)、ミエロペルオキシダーゼ (MPO)) と抗炎症 (アネキシン A1) 分子。代表 immunoblots、肝腎の PMN 刺激から明らか (50 ng/mL)、PMA (200 nM)、fMLF (1 μ M) MPs MMP 9 のさまざまなレベルを表現し、。しかし、Latrunculin B (1 μ M) 前に fMLF (5 μ M) を用いた刺激によるアクチン細胞骨格の唯一の摂動は PMN MPs の MPO の豊富な存在につながった。同様に、アネキシン A1 (検出なしに高) のさまざまなレベルは、MPs 以下の記述作動条件で見つかりませんでした。PMN MP 組成が刺激依存性であることが示唆されました。
最後に、図 4を示していますどのように勉強する分離 PMN MPs を使用することができます傷癒しの in vitroとin vivo大腸損傷。PMN MPs は、文化、癒しを監視によってあらかじめ決められた時点で買収をイメージングできる場所の傷負傷上皮単分子膜に追加できます。MPs は、生検鉗子や内視鏡画像9によって生成された、大腸の傷に直接さらに microinjected することができ、治癒への影響を評価することができます。すぐにポスト負傷 (または指定されているそれ以外の場合) 創傷治癒のin vitroとin vivoの両方の分析のための傷を与えたの画像を取得し、あらかじめ決められた時点で癒しのプロセスを継続的に。市販の画像解析ソフトを使用して、傷領域 (サイズ) への変更が測定し、創傷閉鎖率を決定するために使用します。PMN MPs MPO を含むいずれかのアプリケーションが上皮化単分子膜を培養または体内大腸傷に遅延治癒9につながる有害な影響を持っています。
図 1.PMN MP サイズとフローサイトメトリーによる表面マーカーの解析。(A) 流れの cytometer 知られていたサイズのコントロール ビーズ (材料の表を参照) を最適化され、SSC と FSC 直交表現に散布図で表されます。B に示すように PMN MP サンプルと相対的なサイズ比較を取得するビーズを使用 (B) ヒト PMN MPs が分離・ ビーズで説明されている条件を使用して、フローサイトメトリーで分析しました。MP サイズの不均一性を見ることができます。(C-D)MPs fMLF 刺激によるマウス骨髄由来 Pmn は、フローサイトメトリーで分析しました。代表的なフロー図は、無染色 (C) または (D) MPs。 長方形領域を示します Annexin V-肯定的な MPs (FITC 陽性 MPs) をステンド グラス アネキシン V FITC を表示します。SSC: 側方散乱。FSC: 前方散乱。PhS: ホスファチジルセリン。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.PMN MP 染色やフローサイトメトリーによる解析します。(A) Unstained (B) Annexin V FITC-hCD11b-APC-染色議員広場エリアを囲む PMN のアネキシン V/CD11b 二重肯定的な人口-MPs (C) 分離した新鮮な人間の PMNs (1 x 106) 蛍光色素で染色した。、N-(2-aminoethyl) マレイミド FITC と fMLF で刺激します。MPs は細胞培養上清から隔離され、フローサイトメトリーで分析しました。四角形の領域を囲む N-(2-aminoethyl) マレイミド FITC の肯定的な MP 人口 (M FITC、y 軸のラベル)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.PMN MPs の組成が刺激依存します。(A) ヒト Pmn 肝腎、tnf α、fMLF、PMA、または latranculin fMLF (LtB-fMLF) に続いて B の組み合わせで刺激を受けました。MPs は超遠心法による結果の細胞培養上清から分離したし、1 %sds バッファーにタンパク質溶解液を調製します。蛋白質が 10% のポリアクリルアミドゲルの電気泳動によってサイズで区切られた、ニトロセルロース膜に転送および適切な HRP 標識二次抗体に続いて、MMP 9、MPO、またはアネキシン A1 の一次抗体の検出します。(B) 代表的な電子顕微鏡によるヒト PMN MPs のイメージを描くサイズの不均一性。エキソソーム < 100 nm は、白い矢印で示されます。スケール バー = 250 nm (左と右のパネル)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:上皮における Pmn の役割を勉強に孤立した PMN MPs の使用は創傷治癒します。(A) 炭酸カルシウム 2 BBe ひと腸管上皮細胞が合流スクラッチ負傷、そしてすぐに負傷した後に追加された 300 万 Pmn から派生した MPs を受けるにメッキされました。代表的なイメージ コントロール (左のパネル)、PMN MP 扱われる上皮細胞 (右側のパネル) で創傷閉鎖 (48 時間後負傷) を表示します。スケールバー = 100 μ m (B) PMN MPs の大腸に及ぼす影響を調べるため癒し体内の傷、内視鏡を用いたマイクロインジェクション システムを用いた創傷部に直接分離 PMN MPs を注入した (24 h が負傷後に大腸の傷は。記載されている破線と注射針の穿刺場所は白い矢印で示されている)。傷の閉鎖だった内視鏡評価 3 日後 (4 日後負傷)。スケールバー = 300 μ m。 (C) マウスが負傷した後の 4 日間を安楽死させ、大腸の粘膜傷いたハサミで抽出、最適な切削温度 (O.C.T) 化合物に埋め込まれ、液体窒素で凍結。8 ミクロンの傷の染色再上皮化 (上部パネル) のレベルを査定する E-カドヘリン (緑) と核の染色 DAPI (青)、または DAPI (青) とキ67 (赤) で合計と増殖の上皮細胞を可視化するには傷の端 (下のパネル)。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
分離・同定多形核白血球由来の MPs のためのプロトコルは、この通信で説明されます。キーのいくつかの重要なポイントは、プロシージャの成功のためのアカウントに撮影する必要があります。まず、Pmn を新鮮な分離し、自発的な活性化と脱顆粒を防ぐために分離の 2 時間以内の実験で使用する必要があります。Pmn 分離時、刺激のポイントまでのすべての処理は、活性化と早期 MP リリース12を防ぐために氷の上実行する必要があります。第二に、1 h 以上の遠心を最大限にフローサイトメトリーによる解析のための MPs。 サード、ペレット、楽器は (ビーズの種類は特定調整は楽器が指定した蛍光ビーズの組み合わせで正しく校正が必要楽器の) MP サイズを正しく定義します。たとえば、流れの cytometers の 1 つのメーカーでは、サイズ関連のパラメーターとして FSC ビーズの使用をお勧めします、その他は SSC ビーズに最適化されています。さらに、MP の解析に使用される流れの cytometer はバック グラウンド ノイズからの MPs を解決する最善に改善された電子を装備する必要があります。
サイズ パラメーターに加え MPs を正しく識別するには、上記の手順で説明するように染色蛍光を利用をお勧めします。さらに、フローサイトメトリーによってには、ダスト粒子または集録時にバック グラウンド ノイズを増加する他の沈殿物の包含を最小限に抑えるために 0.1 μ m フィルター システムを介して準備と分離の間にすべてのソリューションがフィルター。重要なは、国会議員の貯蔵条件が考慮されなければなりません。少し証拠8と私たち自身の未発表の観察は、凍結 MP が膜破裂と MP の破損につながることを示唆しています。最後に、さまざまな多形核白血球活性化条件とタイミングが変更し、MP 収量を改善します。
このメソッドのいくつかの制限があります。マウスの骨髄から Pmn の分離は通常純粋な (~ 85-90%) とフローサイトメトリーによる解析によって決定されたように、他の免疫細胞 (主に単核リンパ球) によって汚染されます。したがって、結果分離は他の免疫細胞が発表した MPs の少量を含めることができます。選択肢は使用でき、市販の磁気ビーズによる Pmn の分離を含みます、しかし、これは長く、かなりより高価な手順でしょう。最後に、サイズ パラメーターに加えて、蛍光標識なし塵からの MPs の決定的な差別化やサンプルを汚染することができます同じようなサイズの他の水溶性や浮遊粒子は挑戦し、エラーが発生しやすい。
将来は、特定のマーカーの付いた PMN MPs の並べ替えを助ける MP 作曲を特定の刺激条件や病気のモデルを解明し、治療するために、診断マーカーと治療標的としてうまくいけば MPs の使用を許可炎症性疾患。
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Disclosures
著者はこの通信に関連するあらゆる種類の利害の衝突があります。
Acknowledgments
北西ファインバーグ学校の医学フローサイトメトリーのコアを実行する博士 Suchitra スワミナサンのテクニカル サポートに感謝しております。(NIH) DK101675 によって提供された資金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | Atlanta Biologics | S11150 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher | BP2482 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | Sterile and filtered through a 0.1 micron filter unit |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Density 1.119 g/ml. Solution of polysucrose and sodium diatrizoate. Bring to room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | Decon labs | 2701 | |
| HBBS | Corning | 21-022-CV | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | T8154 SIGMA | Diluted 1:2 for cell viability counting |
| Isoflurane | Abbot | 50033 | |
| Anti-human CD11b-APC conjugated | Biolegend | 301350 | Clone ICRD44 (Final concetration: 1 µg/mL) |
| BODIPY FL | Invitrogen | B10250 | N-(2-aminoethyl) maleimide |
| Annexin V Binding Buffer | Biolegend | 422201 | |
| Calibration Beads for Flow Cytometry | BioCytex | 7803 | |
| FITC Annexin V | Biolegend | 640906 | |
| Polymorphprep | Axis-Shield PoC AS | Sodium diatrizoate/Dextran 500, density 1.113 g/ml | |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes | BD Falcon | 357575 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 µm cell strainers | Celltreat | 229485 | |
| Vacutainer tubes | BD | 367251 | |
| Equipment | |||
| LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP) | BD | (SORP) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75007210 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | (L8-80 M) | |
| Micro-centrifuge | ThermoFisher Scientific | VV-17703-15 (Fresco 17) | |
| Swinging bucket centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004503 (Megafuge 40R) | |
| Biopsy forceps, 28 cm | Storz | 27071zj | |
| Software | |||
| Image J | National Institute of Health | Open source |
References
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