Summary
建立一个稳定的细胞系, 过度表达一个有兴趣的基因, 研究基因功能, 可以通过稳定的转化后, 选择单一克隆通过逆转录病毒感染后。在这里, 我们表明, ht29-dr3 细胞系产生这种方式阐明的机制, 死亡受体 3 (dr3) 有助于抗肿瘤诱导的细胞凋亡。
Abstract
研究感兴趣的基因的功能可以通过操纵其表达水平来实现, 比如通过击倒细胞系降低其表达, 或者通过过度表达细胞系增加其表达。瞬态转染和稳定转染是外源基因表达常用的两种方法。瞬态转染只对短期表达有用, 而稳定转染则允许外源基因整合到宿主细胞基因组中, 在那里它将被连续表达。因此, 稳定转染通常被用于长期遗传调控的研究。在这里, 我们描述了一个简单的协议, 以产生一个稳定的细胞系过度表达标记死亡受体 3 (dr3), 以探索 dr3 功能。我们在抗逆转录病毒感染后选择单克隆, 以保持稳定细胞系的同质性和纯度。使用该协议生成的稳定细胞系使 dr3 缺乏的 ht29 细胞对抗炎药物敏感, 从而重组 ht29 细胞的凋亡反应。此外, dr3 上的 flag 标记补偿了良好 dr3 抗体的不足, 并促进了抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的分子机制的生化研究。
Introduction
异源基因表达经常被用来研究感兴趣的基因的功能。在细胞和分子生物学中, 有两种方法, 即瞬态转染和稳定转染, 将一段 dna 或 rna 插入宿主细胞1,2。短暂转染的 dna 或 rna 不能传递给子细胞, 因此基因改变只能保留很短的时间。另一方面, 在稳定转染的细胞中, 外源基因被整合到宿主细胞基因组中, 维持其在细胞系中的表达。因此, 稳定转染是一种通常保留用于长期遗传调控研究的方法。稳定的细胞系也可以作为异种移植移植到小鼠模型中进行体内研究3。稳定转染可分为两类: 病毒转染和非病毒转染。与非病毒转染相比, 病毒感染可以将基因转移到更广泛的人类细胞中, 效率更高的是4、5、6、7。此外, 来自单个克隆的稳定细胞系具有均匀性和克隆纯度的优势。
不受控制的细胞生长和分裂是癌症最显著的特征。在临床环境中, 抗肿瘤药物是许多类型肿瘤的主要治疗方法8。然而, 抗肿瘤药物的一些重大限制不容忽视。首先, 这些化疗也会杀死正常细胞和不想要的癌细胞, 从而导致严重的副作用 8.其次, 抗管蛋白药物并不能有效对抗所有类型的肿瘤, 尽管管蛋白在各种不同的组织中无处不在, 作为细胞骨架蛋白9,10.目前尚不清楚为什么抗管蛋白药物在临床治疗中对卵巢癌、肺癌和血癌表现出很有希望的疗效, 但在肾癌、结肠癌或胰腺癌中却没有。最后, 即使是同类型肿瘤患者, 对抗肿瘤药物的反应也会有所不同, 无法预测。可能有一个关键的效应分子, 影响不同患者对抗肿瘤药物的敏感性, 导致在临床治疗中看到的各种结果12。因此, 应考虑患者对抗肿瘤治疗的潜在差异敏感性, 以优化治疗干预13。
高通量全基因组 sirna 文库屏幕表明, dr3 击倒可使敏感细胞对抗肿瘤药物产生耐药性, 并暗示 dr3 在化疗诱导的细胞凋亡中的作用14。作为肿瘤坏死因子受体 (tnfr) 超家族的成员, dr3 已被报道在不同系统中介导细胞凋亡15、16、17、18.因此, 我们着手建立稳定的细胞系过度表达 dr3, 研究分子机制, 其中抗肿瘤药物诱导细胞凋亡。人类结肠癌细胞线 ht29 可以提供一个合适的细胞模型来研究 dr3 过度表达, 该细胞系被发现缺乏 dr3。此外, 在诊所, 结肠癌对抗炎药物不敏感 19.
在本文中, 我们描述了一种方法, 允许产生 ht29-dr3 稳定的细胞系通过逆转录病毒感染。我们进一步展示了如何使用西方印迹验证这些细胞中的 dr3 表达, 以及如何通过使用细胞活力分析和形态学观察来评估对抗结核药物的敏感性。细胞从单个克隆体中被扩增, 因此具有均匀遗传背景的优势。此外, dr3 上的 flag 标签允许通过显微镜对细胞 dr3 进行可视化, 并通过生化方法分析基因表达和蛋白质相互作用。此外, 这些细胞可以在小鼠体内进行异种移植, 以进一步分析肿瘤的进展, 以应对体内14的抗肿瘤药物。
这里介绍的 ht29-dr3 细胞系统为研究抗肿瘤药物如何杀死癌细胞的分子机制提供了一个有效的工具。由于过度表达和击倒细胞系是研究基因功能的常用工具, 该协议可以很容易地适应其他感兴趣的基因或其他细胞系, 从而转化为一种广泛使用的方法。
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Protocol
请注意, 此处描述的所有鼠标实验均已根据清华大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 获得批准并进行。
1. dr3 多表达细胞系的生成
- 通过在 c 期终止点将带有 3x flag 的全长 dr3 cdna 插入 bshi/xhoi 限制地点的 vmxs-ires-blastisistiin 中, 构建 dr3 表达的质粒。
- 在60毫米的盘子里生长 plat-a 细胞, 其中含有4毫升的 dulbecco 的改性鹰培养基 (dmem)。第二天, 当细胞达到 80%-90% 的融合时, 使用2微克的质粒 pmxs-ir3-flag, 使用转染试剂 (见材料表), 根据制造商的手册20对细胞进行转染。
- 72小时后, 收集上清液, 使用0.45μm 无菌过滤器过滤培养基, 并在4°c 的黑暗中保持病毒悬浮液。
- 在 dmem 中的60毫米盘中培养 ht29 细胞, 并在37°c 下以5% 的 co2 孵育细胞.
- 第二天, 当细胞达到 30%-50% 的融合, 感染细胞与2毫升的病毒悬浮液存在8微克 1, 5-二甲基-5-二氮二甲酰亚胺甲基溴化物每毫升的病毒悬浮液。在37°c 孵育4-6小时后, 吸入病毒悬浮液, 加入4毫升新鲜的 dmem, 并将盘子返回孵化器。
- 在感染24小时后将介质从盘子中丢弃, 并用2毫升预热的 pbs 仔细清洗细胞。在细胞中加入1毫升胰蛋白酶 edta, 在37°c 孵育3分钟。
- 在10X 放大倍率下观察到大多数细胞已分离后, 用含有10% 胎儿牛血清 (fbs) 的2毫升完整 dmem 停止胰蛋白酶化。在15毫升管中收集细胞悬浮液, 并在室温 (rt) 下以 200 x g 离心细胞5分钟。
- 取出上清液, 在 dmem 10 毫升中重新悬浮细胞颗粒。通过轻轻向上和向下移液混合。按30、100和300的因子稀释细胞。将150毫米的细胞中的细胞中的细胞中的 dmm 含有 1μgml blasticidin。在具有 5% co2 的37°c 孵化器中孵育约 1-2周.
- 在此期间, 每天以10倍的放大倍率使用倒置显微镜观察菌落。当菌落直径约为1-2 毫米时, 标记在盘子底部的隔离良好的菌落。
- 吸入培养基, 用3毫升预热的 pbs 清洗细胞。在60毫米的盘子里加入2毫升的色氨酸 edta。使用无菌钳拿起蒸压无菌克隆气瓶, 并将其放置在60毫米的盘子中。拿起含有色氨酸 edta 的钢瓶, 轻轻地将它们放在有标记的菌落上。确保每个克隆气缸只包含一个菌落, 并避免与附近的菌落污染。
- 将盘子送回孵化器3分钟。
- 3分钟后, 以10倍的放大倍率检查显微镜下的细胞, 看看它们是否已分离。当细胞被提升后, 在每个圆筒中加入70μl 培养基以灭活胰蛋白酶。将细胞悬浮液与200μl 移液器轻轻混合。在此过程中, 请确保不要移动气缸。
- 将细胞悬浮液从每个菌落转移到两个24孔板, 每个井含有1毫升的 dmem。在 a 板中每口井加入30μl 的细胞悬浮液, 在 b 板的相应井中加入 70μl, 适当地标记板, 然后将其放回孵化器中。
2. dr3 过度表达细胞系的验证
- 当 b 板中的细胞处于90% 的汇合点时, 取出培养基, 用1毫升的 pbs 仔细清洗细胞。完全去除 pbs, 用50μl 的 1x sds-page 加载缓冲液裂解细胞。将电池裂解液从24孔板转移到 1.5 ml 离心管, 并在100°c 下将样品煮沸10分钟。
- 在稳定电压为 80 v 的情况下, 在10% 的十二烷基硫酸钠 (sds) 凝胶上运行样品 15分钟, 然后在 120 v 下运行1小时。
- 在 4 0 0 ma 的恒流下, 以 4 0 0 ma 的恒流将蛋白质转移到聚偏氟乙烯 (pvdf) 膜, 持续2小时。
- 使用抗 flag 抗体测试不同克隆中的 dr3 表达, 使用野生类型 ht29 细胞作为阴性对照 (图 1)。将原代抗体稀释 5, 000, 在5% 的脱脂牛奶中溶解在 tbst (含有 0.1% tween-20 的特里-缓冲盐水) 中。在4°c 条件下用 flag 抗体对膜进行隔夜培育。
- 在 rpm 的200转/分的情况下, 用 tbst 将膜摇匀, 每5分钟刷新一次 tbst, 总共清洗时间为15分钟。
- 在4°c 下, 用抗小鼠二级抗体在5°c 的脱脂牛奶中稀释 10, 000倍, 以5-6 的速度对膜进行培育。
- 如步骤2.5 中所述, 再次清洗膜。
- 使用西方增强化学发光 (ecl) 基板检测 flag 表达, 并用凝胶文档系统对膜进行成像 (见材料表)。识别表示 dr3 为正克隆的克隆。
- 将与 b 板中的阳性克隆相对应的 a 板中的克隆转移到6孔板上, 并继续放大细胞, 直到在10厘米的盘子中生长。使从阳性克隆中生长的细胞的冷冻库存, 并将其储存在-80°c, 供将来使用。
3. 细胞对抗肿瘤药物凋亡反应的评估
注: 地唑酰胺是一种新型的海洋天然产物, 具有显著的抑制癌细胞生长的活性, 反映了其他管状破坏稳定的因素21。然而, 其行动方式仍不清楚。为检测细胞对抗肿瘤药物的反应, 采用紫杉醇和重氮酰胺治疗野生 ht29 型细胞和 ht29-dr3 细胞。这些药物被溶解在二甲基亚硫酸 (dmso) 中, 以生产 10 mm 库存, 然后进一步稀释到不同的浓度:30 nm、100 nm、300 nm、1, 000 nm、3, 000 nm 和 10, 000 nm 在 dmso 中。
- 通过胰蛋白酶收集 ht29 和 ht29-dr3 细胞。使用自动单元计数器测量细胞密度。然后, 在 dmem 中, 以每口 3 x10 4个细胞的密度将细胞播种在 dmem 中的12孔板中。第二天, 添加 10 nm 二氮酰胺, 并使用 1% dmso 作为负对照。经过48小时的治疗后, 以10倍的放大倍率将细胞成像在显微镜下 (图 2)。
- 种子 ht29 和 ht29-dr3 细胞在96孔板在 dmem 以 3 x10 3 细胞的密度每口井, 并允许他们在37°c 下过夜生长。然后, 在每口井中加入剂量升级的重氮酰胺浓度 0.3 nm、1 nm、3 nm、10 nm、30 nm 和 100 nm, 使用 1% dmso 作为负对照。
- 经过48小时的治疗后, 使用基于发光的细胞活力检测试剂盒, 根据制造商的手册测量细胞的活力。
- 从孵化器中取出96孔板, 让它在 rt 站大约30分钟。然后, 在每口井中加入50μl 的检测试剂, 在 rt 上摇匀2分钟的检测试剂, 在 rt 孵育片 10分钟, 用微板读取器确定每口井的发光 (图 3)。
注: 细胞活力代表每口井与使用 1% dmso 处理良好的对照的相对发光强度。
- 从孵化器中取出96孔板, 让它在 rt 站大约30分钟。然后, 在每口井中加入50μl 的检测试剂, 在 rt 上摇匀2分钟的检测试剂, 在 rt 孵育片 10分钟, 用微板读取器确定每口井的发光 (图 3)。
- 使用6周大的雌性 balb2 裸鼠进行体内研究14。
注: 小鼠在特定的无病原体条件下保持。- 胰蛋白酶 ht29 和 ht29-dr3 细胞, 然后, 停止胰蛋白酶化使用 dmem 预热在37°c。在 rpm 中, 在50毫升管中收集细胞悬浮液, 并以 1, 000 rpm 离心细胞 10分钟. 丢弃上清液, 在没有 fbs 的 dmem 介质中重新悬浮细胞颗粒。再次离心细胞, 并重新悬浮细胞颗粒在 pbs。
- 使用自动细胞计数器对细胞进行计数, 并使用 pbs 将细胞稀释到 2.5 x10 7 细胞的浓度。通过皮下注射200μl 的 ht29 或 ht29-0.3 细胞悬浮液在每个小鼠 (5 x10 6 细胞/小鼠)的右侧产生肿瘤22。
- 移植后每2秒用卡钳测量一次肿瘤体积 (电视)。使用以下公式计算电视: tv = 半长 x w x w (此处, w: 肿瘤宽度, l: 肿瘤长度)。当平均肿瘤体积达到约100毫米3时, 随机将小鼠分为对照组或治疗组 (n = 6/组), 并启动治疗。
- 准备紫杉醇溶液, 如下所示。首先, 以总体积的5% 完全溶解紫杉醇, 然后加入5% 的聚氧基35氢化柠檬油。最后, 用 d5w (水中5% 葡萄糖, ph 7.4) 构成剩余的90% 体积。
- 以每周 20 mg/kg 的剂量静脉注射紫杉醇, 为期两周。测量肿瘤体积和体重每周3倍14。如果体重减少20% 或肿瘤体积达到约 2, 000 毫米 3, 则终止实验并对动物实施安乐死.
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Representative Results
图 1显示了稳定表达 dr3 的 ht29 细胞的特性。克隆表达不同程度的 dr3, 而野生类型细胞, 作为一个负面的控制, 不显示外源基因表达。在这里, 我们只显示五个克隆, 其中克隆1和5表示 dr3 的最高级别。我们选择克隆1和克隆5进行以下实验。
在图 2中, 用倒置显微镜在10倍放大倍率下观察了二氮酰胺给药后 ht29 和 ht29-3 细胞的形貌。用 10 nm 二氮酰胺48小时治疗后, ht29-dr3 显示细胞凋亡明显, 细胞膜和细胞碎片 (底板) 破裂。然而, ht29 只显示有丝分裂停止与完整的细胞表现出一个圆形细胞形状 (顶部面板)。
用二氮酰胺治疗后 ht29 和 ht29-dr3 细胞的细胞活力如图 3所示。用 3 nm 二氮酰胺治疗48小时后, ht29-dr3 细胞 (红色曲线) 中发现80% 以上的细胞死亡。然而, 父母 ht29 细胞只表现出轻微的反应, 重氮酰胺的形式有丝分裂逮捕 (蓝色曲线)。因此, dr3 的过度表达重组了地氮胺诱导的凋亡途径在这些细胞中。
体内肿瘤异种移植实验的结果已在前一篇论文14中显示。ht29 和 ht29-dr3 肿瘤植入术的成功率均为100%。异种移植肿瘤在车辆控制中进展相似;然而, ht29-dr3 异种移植比 ht29 异种移植物在以 20 mg/kg 的剂量使用紫杉醇治疗时表现出更快的肿瘤回归。我们观察 ht29-dr3 肿瘤对紫杉醇的反应优于体内 ht29 肿瘤的反应, 进一步证实 dr3 的异位表达使肿瘤细胞对抗肿瘤更加敏感。
图 1: 不同克隆体中 dr3 表达的分析.采用西方印迹 (顶部板) 和抗β-肌动蛋白抗体 (底部面板, 作为内部控制) 对 dr3 表达水平进行了分析。父母 ht29 细胞被用作阴性对照。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 二氮酰胺治疗后 ht29 和 ht29-dr3 细胞的形态分析.ht29 (顶板) 和 ht29-dr3 (下面板) 用 10 nm 二氮酰胺处理48小时。刻度柱 = 100μm。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: ht29 和 ht29-dr3 细胞对重氮胺的剂量响应曲线.用连续浓度的重氮酰胺治疗48小时后测量细胞活力。误差条 = 实验三重奏的标准偏差 (sd)。da = 二氮酰胺。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在这篇手稿中, 我们描述了一种方法, 以生成 ht29-dr3 稳定的细胞系。ht29-dr3 细胞为研究 dr3 促进抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡的分子机制提供了一个模型。这种方法是通用和可重复的。为确保该程序的成功, 需要考虑议定书的四个关键步骤。首先, 为了产生足够高的病毒滴度, 建议在 plat-a 细胞达到 80%-90% 汇合时进行 dna 转染。其次, 病毒悬浮液应在4°c 下储存不超过 2周, 从光线下覆盖。第三, 当将受感染的细胞分成150毫米的盘子时, 建议进行连续稀释, 以获得良好的分离菌落, 因为不同细胞的感染效率不同。最后, 当拾取单个菌落时, 不应该对周围的菌落造成任何污染。
这种协议适用于大多数细胞系, 但对于不倾向于形成单一菌落的细胞来说, 可能会很困难。在这种情况下, 将需要其他细胞分选技术, 如抗生素与荧光活化细胞分选 (facs) 相结合。
稳定转染包括病毒和非病毒方法。在这个协议中, 我们使用逆转录病毒感染产生的细胞过度表达 dr3, 理由是物理方法, 如电穿孔, 对细胞23毒性更大, 化学方法, 如脂质介导的 dna 转染, 具有较低的在许多细胞类型中的效率, 并具有潜在的非目标效应24,25,26。
异位表达是阐明基因功能的一种直接有效的方法。因此, 该协议可用于研究其他目标分子。此外, 基因敲除在功能研究中也很重要, 该协议有可能适应基因敲除系统。与其他基因敲入和敲除方法 (如 crispr-cas9) 相比, 这里介绍的协议易于应用, 所有实验室都能负担得起。
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Disclosures
提交人没有什么可申报的。
Acknowledgments
这项工作得到了清华大学 531000117 (致 g. w.) 和 043222019 (至 x. w.) 赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | C11965500BT | Supplemented with 10% FBS and 1% Penicilin/Streptomycin |
| Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| pMXs-IRES-Blasicidin | Cell Biolabs | RTV-016 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| PBS | Invitrogen | C14190500BT | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Invitrogen | 25200056 | |
| 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide | Santa Cruz | sc-134220 | |
| Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| Anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmumoResearch | 115-035-166 | |
| anti-Flag antibody | Sigma | F-3165 | |
| HT29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| plat-A cell line | Cell Biolabs | RV-102 | |
| PVDF Immobilon-P | Millipore | IPVH00010 | |
| Cloning Cylinder | Sigma | C1059 | |
| Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | BTCYT3MV | |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 12-well cell culture plates | Nest | 712001 | |
| 60 mm cell culture plates | Nest | 705001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Nest | 601052 | |
| 0.22 μm steril filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5810000327 | |
| 96 Well White Polystyrene Microplate | Corning | 3903 | |
| Western ECL Substrate | BIO-RAD | 1705060 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | |
| Decoloring Shaker | HINOTECH | TS-2000A | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| Automated cell counter | BIO-RAD | TC 20 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985070 |
References
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