7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー
Summary
ここでは、CD4 を識別するためにフロー フローサイトメトリーによるプロトコルを提案+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、7 つではなく 2 つだけ螢を用いたひと末梢血単球。このアプローチでは、5 つの追加のマーカーはほとんど流れの cytometers に記録できます。
Abstract
免疫細胞の特性は、表面マーカーの発現に基づく集団を識別するためにフローサイトメトリー マルチ カラーに大きく依存します。古典的な多色パネルのセットアップには、ハイエンド機器、カスタム標識抗体、およびスペクトル重複を最小限に抑える設計を慎重に検討が必要です。主要な人間の免疫個体を識別するために役立つ multiparametric 分析を開発した (CD4+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、単球) のみ 2 つの蛍光色素を使用して 7 つの系列マーカーを組み合わせることによって末梢血。当社の戦略は系統マーカーが各細胞集団で常にユニークな組み合わせで表現されます観察に基づいています。抗体の慎重な滴定で、この情報を組み合わせることにより、ほとんど流れの cytometers の光の限界を拡大して、5 つの追加マーカーを記録する捜査官。後者はまだ比較を示した手法と古典的な「1 つの螢光色素 1 つマーカーのアプローチ」、同等の精度で末梢血の免疫細胞群の大半を特徴づけることができます。NKT 細胞・ γδ T 細胞などの個体を識別するためのより正確です。種類の蛍光色素を用いた 7 つのマーカーを組み合わせる複雑な免疫細胞群と手頃な価格の 6-10 の螢光色素の流れの cytometers とも限られた資源と地域で 2-3 螢光色素フィールド機器臨床サンプルの解析できます。ハイエンド機器のこのアプローチからより深い流れフローサイトメトリー分析を達成するために余分な蛍光色素を使用していただけます。このアプローチはまた細胞の限られた数の臨床サンプルの場合いくつかの細胞集団をスクリーニングに適しています非常によくです。
Introduction
フローサイトメトリーは、1秒あたりのイベント数千の速度で単一の粒子に複数のパラメーターを分析するために開発された手法です。フローサイトメトリーで分析した試料の例などが、セル、ビーズ、細菌、小胞および染色体に限定されません。流体システムは、各パーティクルのパスと交差する 1 つ以上のレーザーさらに分析に複数のパラメーターが記録されます尋問時点で粒子を指示します。純粋なレーザ光の散乱によって生成された前方および側面分散はターゲット人口を識別し、それぞれの相対的なサイズおよび粒子の内部複雑さ/粒度に関する情報を取得に使用されます。すべて他のパラメーター、フローサイトメトリー解析データの大部分を占める、蛍光標識プローブを認識し興味の粒子に特定のターゲットをバインドによって派生します。
フローサイトメトリーは、識別し、特徴付ける細胞集団を免疫学的研究のための主要なツールです。免疫システムの複雑さを分析するには、多色パネルは同時にセル人口1の深い診療の記録のマーカーの数を拡大して常に進化してください。最近のハイエンドの流れの cytometers 20 蛍光パラメーターを超えるとより可能な器械と、蛍光色素の開発につながるためです。これは、結果、螢光色素のスペクトルの重なりによる複雑な研究デザインとカスタム抗体ラベル、熟練したオペレーターに関連付けられているコストが高くつきます。いくつかのインスタンスの異なる細胞集団のマーカーの別のパネルを使用して、複雑さとコストを削減することが。このアプローチは、エラーを起こしやすいは、各パネルの情報を削減し、細胞の限られた数のサンプルに適用することは困難。また、マーカーの数を増やすと、蛍光パラメーターを少なく楽器の深い診療ができなくなります。我々 は以前主要な人間の免疫の人口を識別する汚損のプロトコルを開発した (CD4+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、単球) を使用して 7 つの系列マーカーを組み合わせることによって末梢血単核球 (PBMCs) で7 つではなく 2 つだけ螢は、伝統的な「1 つの螢光色素 1 つマーカー」アプローチ (www.hcdm.org)2,3を使用して必要です。私たちの最初の報告は、探検し、深い診療の種類の蛍光色素で 7 マーカーを組み合わせることの概念を検証します。本報告では実用的な面に焦点を当て、汚損の成功を達成するために手順をトラブルシューティングの特定末梢血細胞を染色しステップバイ ステップ プロトコルを提案します。
このプロトコルは、系統マーカーが細胞表面に定数式をあることおよび各細胞集団が系統マーカーの排他的な組み合わせの観察に基づいています。PBMCs、CD3 式は 2 つの主要カテゴリに免疫細胞を細分化: CD3 陽性 T リンパ球と CD3 陰性細胞。CD4 CD3 陽性サブグループ+、CD8+ γδ T 細胞は CD4、CD8、γδ 受容体をもっぱら対象とする抗体を使用して分けることができます。CD3 陰性サブグループ内の同等の方法で B 細胞、NK 細胞、単球識別できます CD19、CD56 と、CD14 抗体をそれぞれ使用しています。標準的な 1 つの螢光色素 1 つマーカー アプローチで抗 CD3-CD4,-CD8、CD14、-7 つの異なる蛍光色素で CD19 の CD56 と TCR の γδ 抗体が検出されました。我々 のアプローチを組み合わせた抗 CD3-CD56、および 1 つの螢光色素 (利便性螢光色素 A のラベル付き) と抗 CD4, TCR γδ 抗体-CD8、CD14 と – 別の螢光色素 (螢光色素 B) CD19 抗体。これは差動抗原の発現と抗体価の組み合わせで可能です。CD4+および CD8+ T 細胞は螢光色素 B アドホックの滴定で、CD8 の間に CD4 信号を配置しながら CD8 信号の表現を最大化することで分離することができますが、螢光色素に抗 CD3 抗体陽性とCD3 陽性 cd4 陽性/陰性 CD8 陰性細胞。Γδ T 細胞は CD4、CD8 より高いレベルの CD3 を表現、したがって CD3 高い4として識別できます。ラベリングの γδ T 細胞の CD3 低 T 細胞, CD3 高 γδ T 細胞間の分離を向上させる、抗 TCR γδ 抗体を用いた螢光色素 A がこの信号を増幅さらに。B 細胞は CD3 として識別することができます–螢光色素 A と CD19+ B. 螢光色素でB 細胞から CD3 陰性 NK 細胞を分離するには、アンチ CD56 抗体は抗 CD3 として螢光色素 A で使用されました。CD56 は5T 細胞の CD3 よりもはるかに低いレベルで NK 細胞で表されるので、これは可能です。最後に、単球は前方側方散乱プロパティおよび螢光色素 B. の CD14 の式の組み合わせで識別できます。
種類の蛍光色素を使用して最大 4 つのマーカを組み合わせるアイデアは6、7、8、前に既に正常に試みられて、そして悪性リンパ球集団9 を識別するために臨床プロトコルで使用されています.以前のレポートはまた 7 つのマーカーを組み合わせる (マーカーから異なる特異性を持つプロトコルを用いてより)10螢光色素の変化量各抗体の複雑な分類に依存して 2 つ螢、このアプローチを使用して。これは市販の抗体を使用して私たちのメソッドとは対照的し楽器構成に合わせることができる、高分子螢の新世代の利点を取ることができます。
この方法論の全体的な目標は、複雑な細胞集団を尋問できるように 5 つの追加のマーカーの記録のほとんどの流れの cytometers の光の限界を拡大することです。結果として、手頃な価格の 6-10 の螢光色素の流れの cytometers で実行できる高度な免疫学的解析と 2-3 螢光色素フィールド機器が限られた資源での分野で顕著な結果を達成できます。ハイエンド機器のこのアプローチからより深い流れフローサイトメトリー分析を達成するために、同じ時間11時いくつかの系統をターゲット フローサイト メーター パネル モジュール フローを作成する余分な蛍光色素を使用していただけます。これは潜在的モジュラー診療フローサイトメトリーで使用されるパネルの数を削減し、コスト、エラーと処理時間を削減できます。このアプローチはまた細胞の限られた数の臨床サンプルの場合適しています非常によくです。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示されたプロトコルは、非常に柔軟で染色バッファー、温度およびセル表面のマーカーを系列の高発現による末梢血細胞作製の変化に鈍感に示されています。高品質で再現性のあるデータを取得するための最も重要なステップは、抗体価は。注記のうち、抗体の滴定はフロー フローサイト メーター パネルのセットアップ中に常に実行する必要がありますのでこの手順に追加されま?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は国立関節炎研究所と筋骨格系と皮膚病によって支持された 、受賞番号 P30-AR053503;ステイブラー財団、www.stablerfoundation.org;国立研究所のアレルギー ・感染症、www.niaid.nih.gov、T32AI007247。ニーナ アイルランド プログラム肺健康 (NIPLH) の https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/。
Materials
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
| Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
| Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
| 96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |
References
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