Her presenterer vi en flyt cytometric protokoll for å identifisere CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B celler, NK celler og monocytter i perifert menneskeblod med bare to fluorochromes i stedet for syv. Med denne tilnærmingen, kan fem ekstra markører registreres på de fleste flyt cytometers.
Immun celle karakteristikk er sterkt avhengig av flerfarget flowcytometri å identifisere subpopulasjoner basert på annerledes uttrykk for overflate markører. Installasjonen av en klassisk multicolor panel krever high-end instrumenter, egendefinert merket antistoffer og nøye studie design å minimere spectral overlapping. Vi utviklet en multiparametric analyse for å identifisere store menneskelige immun populasjoner (CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B celler, NK celler og monocytter) i perifert blod ved å kombinere syv lineage markører bruker bare to fluorochromes. Vår strategi er basert på observasjon at lineage markører er stadig uttrykt i en unik kombinasjon av hver celle befolkningen. Kombinere denne informasjonen med en forsiktig titrering av antistoffer kan etterforskerne å spille fem ekstra markører, utvide optisk grensen på de fleste flyt cytometers. Head-to-Head sammenligning viste at det store flertallet av immun celle populasjoner i perifert blod kan være preget med tilsvarende nøyaktighet mellom vår metode og den klassiske “et fluorochrome-ett merke tilnærmingen”, selv om sistnevnte er fortsatt mer nøyaktig identifisere bestander som NKT celler og γδ T celler. Kombinere syv markører bruker to fluorochromes tillater analyse av komplekse immun celle populasjoner og klinisk eksempler på rimelig 6-10 fluorochrome flyt cytometers, og selv om 2-3 fluorochrome feltet instrumenter i områder med begrensede ressurser. High-end instrumenter kan også fordelen av denne tilnærmingen med ekstra fluorochromes for å oppnå dypere flyt cytometri analyse. Denne tilnærmingen er også godt egnet for screening flere celle populasjoner i klinisk prøver med begrenset antall celler.
Flowcytometri er en teknikk som ble utviklet for å analysere flere parametere på enkelt partikler med en hastighet på flere tusen av hendelser per andre1. Eksempler av analysert av flowcytometri omfatter, men er ikke begrenset til, celler, perler, bakterier, blemmer og kromosomer. Et fluidic system leder partikler i avhør punktet der hver partikkel krysser banen med én eller flere lasere, og flere parametere registreres for videre analyse. Fremover og side Scattere, generert av spredning av ren laserlys, brukes til å identifisere målgruppen og hente informasjon om den relative størrelsen og interne kompleksitet/detaljnivå av partikler, henholdsvis. Alle de andre parametrene, som står for mesteparten av dataene i en flyt cytometric analyse, er avledet av fluorochrome-merket sonder gjenkjenner og binder seg til konkrete mål på partikler av interesse.
Flowcytometri er hovedverktøy for immunologiske studier for å identifisere og karakterisere celle populasjoner. For å analysere kompleksiteten av immunsystemet, utvikling flerfarget paneler stadig for å utvide antall markører samtidig registrert for dyp immunophenotyping celle populasjoner1. Dette fører til utvikling av mer kapabel instrumenter og fluorochromes, med siste high-end flyt cytometers overstiger 20 fluorescerende parametere. Dette resulterer i komplekse studien design på grunn av fluorochrome spectral overlapping og høyere kostnader forbundet med egendefinerte antistoff merking og dyktige operatører. I flere tilfeller reduseres kompleksiteten og kostnadene med forskjellige paneler av markører for ulike celle populasjoner. Denne tilnærmingen, men er feil, reduserer informasjonen i hvert panel, og kan være vanskelig å bruke prøver med begrenset antall celler. Videre utelukker øke antall markører dyp immunophenotyping på instrumenter med færre fluorescerende parametere. Vi utviklet en fargeprotokoll for å identifisere store menneskelige immun populasjoner (CD4+ og CD8+ T celler, γδ T celler, B celler, NK celler og monocytter) i perifert blod mononukleære celler (PBMCs) ved å kombinere syv lineage markører bruker bare to fluorochromes i stedet for syv må bruke den tradisjonelle “en fluorochrome-en indikator” tilnærming (www.hcdm.org)2,3. Vår første rapport undersøkt og godkjent begrepet kombinere syv markører i to fluorochromes for dyp immunophenotyping. I denne rapporten presenterer vi en steg-for trinn protokoll for å isolere og flekken perifert blod celler, med fokus på det praktiske aspektet og feilsøkingstrinn for å oppnå en vellykket flekker.
Denne protokollen er basert på observasjon at lineage markører har et konstant uttrykk på celleoverflaten og at hver celle befolkningen har en eksklusiv kombinasjon av lineage markører. I PBMCs, CD3 uttrykk deler immunceller inn i to hovedkategorier: CD3-positive T-lymfocytter og CD3-negativ celler. I CD3 positiv undergruppen, CD4+, CD8+ og γδ T celler kan deles ved hjelp av antistoffer som er utelukkende rettet mot CD4 og CD8 γδ reseptoren. På en tilsvarende måte, innenfor CD3 negative undergruppen, kan B celler, NK celler og monocytter identifiseres med antistoffer mot CD19, CD56 og CD14, henholdsvis. I en standard en fluorochrome-en markør tilnærming, anti-CD3,-CD4,-CD8, -CD14,-CD19, – CD56 og -TCR γδ antistoffer er oppdaget med syv forskjellige fluorochromes. Vår tilnærming kombinerer anti-CD3, – CD56 og -TCR γδ antistoffer i en fluorochrome (merket for bekvemmelighet fluorochrome A) og anti-CD4,-CD8, -CD14 og – CD19 antistoffer i en annen fluorochrome (fluorochrome B). Dette er mulig ved en kombinasjon av antistoff titrering og differensial antigen uttrykk. Begge CD4+ og CD8+ T celler er positive anti-CD3 antistoffer i fluorochrome A, men de kan skilles i fluorochrome B maksimere uttrykk for CD8 signalet mens plassere, med en ad hoc titrering, CD4 signalet mellom CD8 og CD3 positive-CD4/CD8 dobbel negative cellene. Γδ T-celler uttrykker høyere nivå av CD3 enn CD4 og CD8, og derfor de kan identifiseres som CD3 høy4. Signalet er ytterligere styrket av merking γδ T celler i fluorochrome A med en anti-TCR γδ antistoffer, dermed forbedre skille mellom CD3 lav T celler og CD3 høy γδ T celler. B celler kan identifiseres som CD3– i fluorochrome A og CD19+ i fluorochrome B. Separate CD3 negative NK celler fra B-celler, ble et anti-CD56 antistoff brukt i fluorochrome A som anti-CD3. Dette er mulig fordi CD56 uttrykt på NK celle på et mye lavere nivå enn CD3 på T celler5. Til slutt, monocytter kan identifiseres via en kombinasjon av frem-side scatter egenskaper og uttrykk for CD14 i fluorochrome B.
Ideen om å kombinere opp til fire markører bruker to fluorochromes har allerede har tidligere vært forsøkt6,7,8, og har vært brukt i en klinisk protokoll for å identifisere ondartet lymfatisk bestander9 . En tidligere rapport også kombinert syv markører (med ulike spesifisitet fra markører enn vi brukt i våre protokollen) bruker to fluorochromes, men denne tilnærmingen avhengig av en sammensatt merking av hver antistoff med varierende mengde fluorochrome10. Dette er vår metode som bruker kommersielt tilgjengelige antistoffer og kan tilpasses Instrumentkonfigurasjonen og kan dra nytte av den nye generasjonen av polymer fluorochromes.
Det overordnede målet med denne metoden er å utvide optisk grensene for de fleste flyt cytometers slik at innspillingen av fem ekstra markører kan forhøre komplekse celle populasjoner. Som en konsekvens, avansert immunologiske analyse kan utføres på rimelig 6-10 fluorochrome flyt cytometers, og 2-3 fluorochrome feltet instrumenter kan oppnå bemerkelsesverdige resultater i områder med begrensede ressurser. High-end instrumenter kan også fordelen av denne tilnærmingen med ekstra fluorochromes å oppnå dypere flyt cytometri analyse og opprette modulære flyt cytometric paneler målretting flere linjene på samme tid11. Dette kan potensielt redusere antall paneler som brukes i modulære immunophenotyping flowcytometri og redusere kostnader, feil og håndtering tid. Denne tilnærmingen er også godt egnet ved klinisk prøver med begrenset antall celler.
Protokollen presenteres her har vist seg å være ganske fleksibel og ufølsom for endringer i flekker buffer, temperatur og eksterne blodlegemer forberedelse på grunn av høy uttrykk for lineage markører på cellens overflate. Det viktigste trinnet for å få høy kvalitet og reproduserbar data er antistoff titrering. Av notatet, siden Serine antistoffer skal alltid utføres under installasjonen av en flyt cytometric panel, legge dette trinnet ikke ekstra benk-tid til våre to-fluorochrome tilnærming. Titrering av an…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av nasjonalt Institutt for Arthritis Musculoskeletal og hudsykdommer, , prisen nummer P30-AR053503; Stabler stiftelsen, www.stablerfoundation.org; National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; Nina Irland Program for lunge helse (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.
CD3 | BD Biosciences | 562426 | Antibody for staining RRID: AB_11152082 |
CD56 | BD Biosciences | 562751 | Antibody for staining RRID: AB_2732054 |
TCRgd | BD Biosciences | 331217 | Antibody for staining RRID: AB_2562316 |
CD4 | BD Biosciences | 555347 | Antibody for staining RRID: AB_395752 |
CD8 | BD Biosciences | 555367 | Antibody for staining RRID: AB_395770 |
CD14 | BD Biosciences | 555398 | Antibody for staining RRID: AB_395799 |
CD19 | BD Biosciences | 555413 | Antibody for staining RRID: AB_395813 |
CD3 | BD Biosciences | 555335 | Antibody for staining RRID: AB_398591 |
CD56 | BD Biosciences | 555518 | Antibody for staining RRID: AB_398601 |
TCRgd | BD Biosciences | 331211 | Antibody for staining RRID: AB_1089215 |
CCR7 | Biolegend | 353217 | Antibody for staining RRID: AB_10913812 |
CD45RA | BD Biosciences | 560674 | Antibody for staining RRID: AB_1727497 |
CCR4 | BD Biosciences | 561034 | Antibody for staining RRID: AB_10563066 |
CCR6 | BD Biosciences | 353419 | Antibody for staining RRID: AB_11124539 |
CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | Antibody for staining RRID: AB_10894207 |
CD57 | BD Biosciences | 562488 | Antibody for staining RRID: AB_2737625 |
HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | Antibody for staining RRID: AB_2737994 |
CD16 | BD Biosciences | 563784 | Antibody for staining RRID: AB_2744293 |
Dead cells | Life technologies | L-23105 | Live/dead discrimination |
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap | BD Bioscience | 352235 | to filter cell suspension before passing though the flow cytometer |
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube | BD Bioscience | 352001 | to stain whole blood |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo fisher | 12648010 | Freezing cells |
96-well V-bottom plate | Thermo fisher | 249570 | plate for staining |
FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | Flow cytometer | |
FCS Express 6 | De Novo Software | FACS analysis | |
Graphpad Prism | GraphPad software | Data analysis |