Summary
هذه الورقة تفيد بأن إضافة Y-27632 إلى تيفا المتوسطة يمكن أن تزيد بشكل كبير من العائد من الخلايا الصباغية من أنسجة الجلد الكبار.
Abstract
إن عزل وثقافة الخلايا الصباغية الأولية من أنسجة الجلد مهمة جداً للبحوث البيولوجية وقد استخدمت على نطاق واسع للتطبيقات السريرية. عزل الخلايا الصباغية الأولية من أنسجة الجلد عن طريق الطريقة التقليدية عادة ما يستغرق حوالي 3 إلى 4 أسابيع لتمرير ما يكفي. والأهم من ذلك، فإن الأنسجة المستخدمة عادة ما تكون من قبل الوليد، ولا يزال يشكل تحدياً لعزل الخلايا الصباغية الأولية بكفاءة عن الأنسجة البالغة. لقد طورنا مؤخرًا طريقة عزل جديدة للميلانوسيات تضيف Y-27632، وهو مثبط Rho kinase، إلى متوسط الثقافة الأولي لمدة 48 ساعة. نحن الآن وصف هذه الطريقة الجديدة بمزيد من التفصيل باستخدام البشرة الكبار لثقافة بكفاءة الخلايا الصباغية الأولية. الأهم من ذلك، ونحن نظهر أن الخلايا الصباغية التي تم الحصول عليها من أنسجة البالغين التي أعدتها هذه الطريقة الجديدة يمكن أن تعمل بشكل طبيعي. هذا البروتوكول الجديد سوف تستفيد بشكل كبير دراسات عيوب التصبغ والميلانوما باستخدام الخلايا الميلانوسية الأولية التي أعدت من أنسجة الجلد الكبار الوصول إليها بسهولة.
Introduction
كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير بروتوكول بسيط وفعال لعزل الخلايا الصباغية عن البشرة من الجلد للبالغين للأبحاث البيولوجية والتطبيقات السريرية. الصباغيات، التي تقع في البشرة القاعدية من الجلد وفي بصيلات الشعر، تلعب دورا هاما في تصبغ الجلد والشعر من خلال إنتاج الميلانين1. إن تصبغ الجلد الناتج من الخلايا الصباغية الجلدية يعمل كمصفاة للأشعة فوق البنفسجية التي تقلل / تمنع تلف الحمض النووي للخلايا الكامنة في الجلد2. انتشار غير طبيعي من الخلايا الصباغية في الجلد أمر شائع جدا، كما هو الحال في تشكيل نيفي حميدة (الشامات) التي الخلايا الصباغية يحتمل أن تتحول إلى نمو oncogenic تليها الشيخوخة الخلوية3.
منذ عام 1957، كانت العزلة والثقافة اللاحقة للميلانوسيات الأولية البشرية ممكنة4، ولكن فقط منذ عام 1982 كان هناك طريقة فعالة يمكن أن تنشئ ثقافات الخلايا الميلانوسية البشرية من البشرة5. الطريقة التقليدية لعزل الخلايا الصباغية الأولية من البشرة ينطوي على هضم الأنزيمية على خطوتين. باختصار ، يتم هضم الجلد في البداية مع عدم السيك مع فصل البشرة عن الأدمة ، وبعد ذلك يتم هضم البشرة مع التربسين لإنتاج تعليق يحتوي على الخلايا الصباغية والكيرتينوسيات ، والتي يمكن بعد ذلك أن تزرع بشكل انتقائي في وسائل الإعلام المختلفة. حاليا، والثقافة الأولية عادة ما يستغرق حوالي 3 إلى 4 أسابيع للميلانوسيات للوصول إلى التقاء باستخدام الطريقة التقليدية، والتي من المرجح أن يرجع ذلك إلى انخفاض كفاءة عزلتهم. لذلك، فإن زيادة الإنتاج الأولي للميلانوسيات من أنسجة الجلد البالغة تكون مفيدة جداً لكل من البحوث المختبرية والتطبيقات السريرية.
العديد من عوامل النمو, وقد ثبت أن معظمها تفرز بواسطة keratinocytes (على سبيل المثال, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF و SCF)5-8-8, تنظيم تمايز وانتشار الميلانوسيات الثدييات. في غياب طبقات التغذية، وعدم وجود تلك العوامل النمو يؤدي إلى انخفاض انتشار الخلايا الصباغية وزيادة المبرمج9. يمكن أن تؤدي الثقافة المشتركة للكيراتينوسيات كخلايا مغذيات والخلايا الصباغية إلى انتشار الصباغي المتسارع وتقليل المبرمج. ومع ذلك، فإن طريقة الثقافة المشتركة لا تتطلب فقط المزيد من أنسجة الجلد لإعداد الكيراتينوسيات، وهو أمر غير عملي، ولكن أيضا لا يمكن أن تعمل بكفاءة لأن ظروف الثقافة المطلوبة من قبل الخلايا الصباغية لا تفضل نمو الكيراتينوسيت، والعكس بالعكس.
وقد ذكرت الدراسات السابقة أن إضافة Y-27632، وهو المانع روك، في وسط النمو يمكن أن تعزز من العائد من خلايا البشرة الأولية البشرية من أنسجة الجلد10-14-14. ولذلك، سيكون من المثير للاهتمام لاختبار ما إذا كان عزل الخلايا الصباغية الأولية البشرية سوف تستفيد من وجود Y-27632. في الواقع، إضافة Y-27632 في التفا المتوسطة15، الذي يحتوي على TPA، IBMX،نا 3VO4 و dbcAMP، زادت بشكل كبير من العائد من الخلايا الصباغية الأولية المعزولة من أنسجة الدبلين في الثقافات الأولية16. بالمقارنة مع البروتوكول التقليدي، هذا البروتوكول الجديد هو أكثر كفاءة في زيادة العائد من الخلايا الصباغية16. لذلك، يصف هذا البروتوكول الطريقة الجديدة بالتفصيل باستخدام أنسجة الجلد للبالغين على أساس دراسة سابقة16 من أجل تعزيز تطبيقها في البحوث البيولوجية الأساسية والتطبيقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت لجنة أخلاقيات البحوث البشرية على استخدام أنسجة قلفة البالغين في هذا البروتوكول (رقم 2015120401، التاريخ: 12 مايو 2015).
ملاحظة: تنفيذ كافة الإجراءات التالية في بيئة معقمة لمنع تلوث الخلايا والثقافات.
1- الأعمال التحضيرية
- جمع أنسجة قلفة الكبار الطازجة من عمليات الختان الجراحية في أنابيب 15 مل تحتوي على 10 مل من الفوسفات المالحة العازلة (PBS) وتخزينها في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: فصل الأنسجة على النحو المفصل أدناه في غضون 24 ساعة بعد الختان. - إعداد الكواشف والثقافة المتوسطة.
- إعداد 3٪ P / S (البنسلين / ستريبتوميسين) كحل الغسيل. مزيج 50 مل من برنامج تلفزيوني مع 1.5 مل من البنسلين (100 U /mL) وstreptomycin (100 ملغ / لتر) (P / S).
- إعداد حل الإنهاء (حل تحييد) لتحييد الهضم الأنزيمي. ملحق 1٪ P / S، 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) في المتوسط DMEM.
- إعداد تيفا المتوسطة إلى الخلايا الصباغية الثقافة: لحم الخنزير F12; 10٪ FBS؛ 1x P/S/S Glutamine; 50 نانوغرام/مل 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-خلات (TPA)؛ 1 x 10-4 M 3-isobutyl-1-ميثيل زانتين (IBMX); 1 μMNa 3VO4؛ 1 × 10-3 M N-6,2′-O-ديبوتيريلدينوزين-3′, 5′-دوري أحادي الفوسفات (dbcAMP).
2. الطريقة التقليدية
- المعالجة المسبقة للأنسجة الجلدية
- شطف كل قلفة الكبار مرة واحدة مع 10 مل من 75٪ الإيثانول (الكحول) لمدة 30 s، ثم شطف مرتين مع 10 مل من محلول الغسيل (3٪ P / S)، لمدة 5 دقائق لكل من.
ملاحظة: غسل الأنسجة قبل الظهر مع 10 مل من برنامج تلفزيوني في البداية إذا كان هناك الكثير من الدم. يتم إعداد جميع الغسلات في أطباق ثقافة الخلايا 100 ملم. - كشط كل نسيج من الأنسجة مع شفرة الجراحية لإزالة الأنسجة الدهنية تحت الجلد والأنسجة الضامة فضفاضة في غلاف طبق ثقافة خلية 100 ملم.
ملاحظة: استخدم مشرطًا لكشط طبقات الدهون حتى يبقى البشرة الرقيقة والأدمة الكثيفة فقط. - نقل كل قبلة الكبار في آخر 100 مم طبق الثقافة مع الجانب الأدمة إلى أسفل.
ملاحظة: قطع كل أنسجة قلفة الكبار إلى 3-4 ملم شرائط واسعة باستخدام شفرة مشرط لجعل عمل dispase أكثر كفاءة. - إضافة 2.5 ملغ / مل dispase إلى كل 100 ملم طبق الثقافة مع أنسجة قلفة الكبار واحتضان لمدة 16 إلى 20 ساعة في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم هضم كل غرام من الأنسجة مع 10 مل من محلول الخلع.
- شطف كل قلفة الكبار مرة واحدة مع 10 مل من 75٪ الإيثانول (الكحول) لمدة 30 s، ثم شطف مرتين مع 10 مل من محلول الغسيل (3٪ P / S)، لمدة 5 دقائق لكل من.
- فصل البشرة عن أنسجة اللزجة البالغة
- بعد الهضم لمدة 16 إلى 20 ساعة، افصل البشرة عن الأدمة باستخدام الملاقط. الاستيلاء على جانب واحد من حافة الجلد من الأنسجة مع ملاقط واحد والموقف المقابل للجزء البشرة مع آخر مع ملاقط وقشر بلطف قبالة البشرة.
- اغسل البشرة 3x بمحلول الغسيل (3% P/S)، ثم قم بنقل البشرة إلى أنبوب.
- غمر البشرة عن طريق إضافة 5 مل من 0.05٪ التربسين في أنبوب واحتضان في حمام مائي لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: هز الأنبوب لضمان غمر البشرة بالكامل قبل الحضانة.
- جمع الخلايا الأساسية وثقافتها
- إضافة حجم مساو من حل الإنهاء (10٪ FBS، 1٪ P / S في DMEM) لتحييد التربسين والماصات الحل صعودا وهبوطا 10-15 مرات لفصل خلايا البشرة.
- مرر تعليق الخلية إلى أنبوب جديد 50 مل من خلال مرشح شبكة 100 ميكرومتر لإزالة الحطام.
- جهاز طرد مركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
- إزالة فائقة وإضافة 10 مل من التطعيم تيفا المتوسطة لإعادة تعليق الخلايا.
- بذور الخلايا resuspended في طبق ثقافة 100 ملم.
- الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- تغيير الوسط كل 2 أيام.
- مرور الخلايا عندما تصل إلى التقاء 80٪.
3. الطريقة الجديدة
ملاحظة: الإجراء لإعداد الأنسجة والهضم في طريقة جديدة هو نفسه كما هو موضح أعلاه للأسلوب التقليدي، والفرق الوحيد هو أن الخلايا الطازجة المعزولة هي resuspended في 10 مل من تيفا المتوسطة التي تحتوي على 10 μM Y-27632.
- بعد يومين من البذر، استبدل الوسائط بوسيلة تيفا العادية بدون Y-27632. بعد ذلك، شروط الثقافة هي نفسها بين الأساليب الجديدة والتقليدية.
4. تمرير الخلية
- إزالة المتوسطة تيفا وشطف كل طبق الثقافة مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة 2 مل من 0.05٪ التربسين لكل 100 ملم طبق ثقافة الخلية.
ملاحظة: هز الطبق لضمان الاتصال الكافي بين الإنزيمات الهضمية والجزء السفلي من الطبق. - جسّد في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- استخدام المجهر للتحقق من الخلايا، وتأكد من أن معظم الخلايا قد فصلت من طبق ثقافة الخلية.
ملاحظة: اضغط بلطف على الطبق لتحرير الخلايا لتجميعها وتعويمها في المحلل. إطالة وقت الهضم إذا لم تعلق معظم الخلايا بعد النقر ، ولكن لا يزيد عن 5 دقائق أكثر. - نقل الخلايا الصباغية في أنبوب 15 مل بعد تحييد نشاط التربسين بإضافة 2 مل من حل الإنهاء. جهاز طرد مركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
- Resuspend كل بيليه الخلية مع 10 مل من تيفا المتوسطة بعد إزالة ببطء supernatant، ومن ثم عد عدد الخلايا الصباغية.
- لوحة حول 1 × 106 الخلايا الصباغية في 10 مل من تيفا المتوسطة لكل 100 ملم طبق ثقافة الخلية.
- تجديد خلية ثقافة المتوسطة كل 48 ح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر الشكل 1 رسم تخطيطي يقارن بين الأساليب التقليدية والجديدة. الإجراء لإعداد الأنسجة والهضم مع طريقة جديدة هو نفس الإجراء للأسلوب التقليدي، والفرق الوحيد هو أن الخلايا المعزولة هي إعادة تعليق في 10 مل من تيفا المتوسطة في وجود 10 μM Y-27632. بعد يومين من البذر، استبدل الوسائط بوسيلة تيفا العادية بدون Y-27632. الطريقة التقليدية لعزل الخلايا الصباغية الأولية من أنسجة الجلد عادة ما يتطلب حوالي 3 إلى 4 أسابيع للميلانوسيات لتنمو بأعداد كافية للمرور، ولكن الأهم من ذلك، والأنسجة عادة ما تأتي من الأطفال حديثي الولادة وأنه من الصعب جدا لعزل الخلايا الصباغية الأولية من أنسجة الجلد الكبار. ومع ذلك، باستخدام طريقة جديدة، ويلاحظ الخلايا الصباغية من الأنسجة الكبار في أعداد أكبر بكثير من الخلايا الصباغية المعزولة باستخدام الطريقة التقليدية. واتخذت وجهات النظر المجهرية في أيام 3 و 6 و 8 عند عزل الخلايا الصباغية من أنسجة الجلد الكبار باستخدام الطريقة التقليدية وطريقة جديدة (الشكل 2A). في هذه الآراء المجهرية، زادت الطريقة الجديدة بشكل كبير من غلة الخلايا الصباغية في أيام 6 و 8. ثم تم تحديد أرقام الصباغية كمياً من خلال حساب ما لا يقل عن 10 حقول مجهرية مختلفة في الأيام 3 و 6 و 8. وأظهرت النتائج أن عدد الخلايا الصباغية المعزولة باستخدام طريقة جديدة هو أعلى بكثير من عدد الخلايا الصباغية معزولة باستخدام الطريقة التقليدية في أيام 6 و 8 (الشكل 2B). بعد 8 أيام من الثقافة، تم حصاد الخلايا الصباغية باستخدام التربسين ومن ثم عدها مع عداد الخلايا الآلي في كل طبق واحد 100 مم، والتي كشفت أن الطريقة الجديدة زادت من العائد الصباغي بنحو خمس مرات(الشكل 2C). وأظهرت وجهات النظر المجهرية التي اتخذت في اليوم 9، بعد يوم واحد passaging، أن الخلايا الصباغية مرور انتشرت عادة(الشكل 2D)،والتي أكدت من قبل تلطيخ Ki67 (الشكل 2E).
وقد أظهرت الغلة المعززة من الخلايا الصباغية من قبل Y-27632 خلال الثقافة الأولية بعد العزلة من خلال تنظيم keratinocytes في منشور سابق16. كما هو مبين في الشكل 3، Y - 27632 لم تزيد من نمو وانتشار الخلايا الصباغية العابرة (الشكل 3A -B) ولم تمنع المبرمج من الخلايا الصباغية (الشكل 3C -D). ومع ذلك، Y-27632 زيادة كبيرة في مرفق keratinocyte(الشكل 3E-H)وروّج أيضا على قيد الحياة(الشكل 3I)في وسائل الإعلام TIVA ثقافة الصباغية. إما أن تشارك في الثقافة مع keratinocytes في وجود Y-27632 أو المتوسطة مكيفة المستمدة من Y-27632 كيرتينوسيتس المعالجة يمكن أن تعزز بشكل كبير من نمو الخلايا الصباغية(الشكل 3J).
لمزيد من وصف الخلايا الصباغية المعزولة باستخدام الطريقة الجديدة ، تم تحليل MITF ، وهي علامة صباغة صباغية محددة ، باستخدام تلطيخ الفلورس (IF) للتحقق من نقاء الخلايا الصباغية بعد التمرن الأولي. ويبين الشكل 4A أن النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن MITF في مرور 1 كانت تقريبا 100٪، مما يدل على أن الخلايا الصباغية النقية تم الحصول عليها بعد مرور الأول من الطريقة الجديدة، وهو مشابه للأسلوب التقليدي. لاختبار ما إذا كان الخلايا الصباغية المعزولة باستخدام طريقة جديدة يمكن أن تعمل بشكل طبيعي، تم التعامل مع forskolin (FSK) لمدة 2 أيام في المختبر، مما تسبب في مستويات تصبغ الخلايا الصباغية (الشكل 4B). معا، هذه البيانات تشير إلى أن الخلايا الصباغية معزولة باستخدام طريقة جديدة يمكن أن تعمل بشكل طبيعي ويمكن أن تنتج الصباغ.
الشكل 1: مقارنة الطريقة الجديدة والطريقة التقليدية. يعرض هذا النظام مقارنة الأسلوب الاصطلاحي مع أسلوب العزل الجديد. والفرق الوحيد هو أن الخلايا الطازجة المعزولة يتم إعادة تثبيتها في 10 مل من تيفا المتوسطة في وجود 10 μM Y-27632. بعد يومين من البذر، يتم استبدال الوسيطة بوسيلة تيفا العادية بدون Y-27632. الطريقة الجديدة عادة ما يحقق كثافة الخلايا الصباغية مناسبة ل passaging في حوالي اليوم 8، في حين أن الطريقة التقليدية عادة ما يستغرق حوالي 20 يوما لتنمو أعدادا كافية من الخلايا الصباغية لالتمر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تزيد طريقة العزل الجديدة من إنتاج الخلايا الصباغية الأولية. (أ)صور تمثيلية للميلانوسيات التي أعدتها الطريقة التقليدية (الصف العلوي) والطريقة الجديدة (الصف السفلي) في أيام 3 و 6 و 8 بعد التلقيح الأولي. (ب)القياس الكمي لأعداد الصباغي المعدة باستخدام الطريقة التقليدية والطريقة الجديدة عن طريق عد أرقام الصباغية في ما لا يقل عن 10 حقول مجهرية مختلفة (رقم الخلية / الرؤية) في الأيام 3 و 6 و 8. وقد أجريت جميع التجارب في ثلاث ية ويتم التعبير عن النتائج على أنها متوسط عدد الخلايا لكل حقل مجهري. (ج)بعد الثقافة لمدة 8 أيام، تم حصاد الخلايا الصباغية باستخدام التربسين وعدد الخلايا الصباغية المعدة باستخدام الطريقة التقليدية وتم احتساب الطريقة الجديدة باستخدام لوحة العد الخلية. تم حساب عدد الخلايا من التجارب ثلاثية الليكات، وتظهر النتائج متوسط عدد الخلايا لكل طبق 100 ملم. (D) بعد عد عدد الخلايا الصباغية باستخدام عداد الخلايا الآلي، أعدت الخلايا الصباغية باستخدام الطريقة التقليدية أو تم بذر طريقة جديدة في أطباق جديدة واتخذت الصور المجهرية في اليوم 9. (E) الصباغيات المعزولة باستخدام طريقة جديدة في مرور 0 أو في مرور 1 كانت ثابتة وملطخة مع الأجسام المضادة Ki67 (الأحمر) وDAPI (نوى، أزرق). (B-C، تم استخدام اختبار tللطالب لتحليل الاختلافات بين الأسلوب الجديد والأسلوب التقليدي ، ** P < 0.01 ، ***P < 0.005. جميع أشرطة مقياس تمثل 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: Y-27632 يعزز نمو الخلايا الصباغية من خلال تنظيم الخلايا الكيراتينية. (أ)تم علاج الخلايا الصباغية النقية (الممر 3) بـ 10 ميكرومتر Y-27632 لـ 12 و24 و48 و60 ساعة وتم تحليل عدد الخلايا الصباغية بواسطة مقايسة CCK-8. (B) تم علاج الخلايا الصباغية النقية (المقطع 3) بـ 10 ميكرومتر Y-27632 لـ 48h ثم تم إصلاحها لـ Ki67 تلطيخ. القياس الكمي للنسبة المئوية للخلايا الإيجابية Ki67 بين الخلايا الحية الإجمالية المشار إليها مع التلطيخ النووي DAPI. (C-D) تم التعامل مع الخلايا الصباغية النقية (الممر 3) بـ 10 ميكرومتر Y-27632 لـ 48 ساعة ثم كانت إما ملطخة بالخلايا المبرمجة مع Annexin V-FITC وأوديد البرودينيوم متبوعاً بتحليل FACS (C) أو ثابتة لمقايسة TUNEL. (E) تم مطلي البشرة المعزولة بعد هضم التربسين مع المتوسطة تيفا مع أو بدون Y-27632 (10 μM) وبعد 2 أيام تم إجراء تحليل المناعة من keratinocytes مع الأجسام المضادة عموم السيتوكيراتين (عموم ck). (F) كمي من الكيراتينوسيات في Y-27632-تعامل وأطباق التحكم من (E) كنسبة مئوية من keratinocytes في ما مجموعه 500 الخلايا التي تم عدها. (G) تم زرع 3 keratinocytes ممر نقي في المتوسطة تيفا مع أو بدون Y-27632 (10 μM). تظهر صور الخلايا الجلدية في يوم واحد بعد البذر. (H) كمي من الكيراتينوسيات المرفقة في Y-27632-تعامل وأطباق التحكم من (G) كنسبة من الخلايا المرفقة في ما مجموعه 5000 الخلايا المصنفة. (I) تم مطلية بـ 3 keratinocytes ممر نقي مع المتوسطة تيفا في وجود أو غياب Y - 27632. تم الحصول على الصور المجهرية في 24 ح (J) لوحة اليسار: أعداد متساوية من مرور نقي 3 مطلية الصباغية مع المتوسطة تيفا في 4 مجموعات مع إضافة (ق) كما هو مبين: 1) Y-27632 (10 μM) وحدها (Y في الرسم البياني)، 2) مرور 3 keratinocytes وحدها ، 3) keratinocytes وY - 27632 (10 μM) (K + Y) ، و 4) لا إضافة (التحكم السلبي ، يخدع). تم تحديد التغيرات النسبية أضعاف في انتشار الصباغية بالمقارنة مع السيطرة السلبية من خلال عد عدد الخلايا الصباغية في 24 ساعة و 48 ساعة بعد الطلاء. اللوحة اليمنى: تم الحصول على وسائل الإعلام المشروطة تيفا من 4 مجموعات من مرور 3 الثقافات الصباغية في (لوحة اليسار) في 48 ساعة بعد الطلاء. ثم، كانت مطلية أعداد متساوية من مرور 3 الصباغية في 4 مجموعات، مع كل واحدة من وسائل الإعلام مكيفة. تم تحديد التغيرات النسبية أضعاف في انتشار الصباغية بالمقارنة مع السيطرة السلبية من خلال عد عدد الخلايا الصباغية في 24 ساعة و 48 ساعة بعد الطلاء. (أ-ي) تم تكرار كافة التجارب لمدة 3 مرات، *p<0.05, **p<0.01, ***p< 0.005. جميع الحانات في الصور تمثل 100 ميكرومتر. وقد تم تعديل الرقم من Mi et al.16. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توصيف الخلايا الصباغية المعزولة باستخدام طريقة جديدة. (أ)صور تمثيلية من صبغ المناعة من MITF (أحمر) في الخلايا الميلانوية المعدة باستخدام طريقة جديدة أو التقليدية. DAPI البقع النوى (الأزرق). (B)تم جمع كريات الخلية من الخلايا الصباغية المعدة باستخدام طريقة جديدة، وتمت معالجتها لمدة 2 أيام مع فورسكولين (FSK) أو DMSO مركبة كتحكم (يخدع). جميع أشرطة مقياس تمثل 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واستند البروتوكول الموصوف هنا إلى منشور صدر مؤخراً16. وينبغي إيلاء بعض الاهتمام للخطوات الحاسمة التالية لتحقيق أفضل النتائج باستخدام الأسلوب الجديد. أولاً، الفصل الناجح بين البشرة والأدمة أمر بالغ الأهمية. قطع أنسجة قلفة الكبار إلى شرائط واسعة 3-4 مم باستخدام شفرة مشرط لجعل العمل dispase أكثر دقة وسهولة لفصل البشرة من الأدمة. ثانيا، عند فصل هاتين الطبقتين، ينبغي تجنب تلوث الأدمة منذ الخلايا الليفية الجلدية يمكن أن تنمو أيضا في المتوسطة ثقافة الصباغية. ثالثا, وينبغي أن تكون خطوة هضم التربسين أقل من 30 دقيقة; وإلا، فإنه سوف يقلل بشكل كبير من صلاحية الخلايا المعزولة.
هذه الطريقة الجديدة بشكل كبير يقصر الوقت اللازم لعزل الصباغ. تنتج الخلايا الميلانيوية للبشرة الميلانين، الذي يحمي البشرة من أضرار التشعيع الشمسي. اقترح Eisinger وماركو الطريقة العملية الأولى لثقافة الخلايا الصباغية البشرية من البشرة5. والأهم من ذلك، أن الأنسجة المستخدمة تأتي عادة من الأطفال حديثي الولادة، ومن الصعب جداً عزل الخلايا الصباغية الأولية عن أنسجة الجلد البالغة. إن مثبط البروتين المرتبط بالرهو Y-27632 يحسن بشكل كبير كفاءة عزل الخلايا الجذعية البشرة11-13. بالإضافة إلى ذلك، أبلغنا أيضا عن طريقة لعزل خلايا البشرة الأولية البشرية من أنسجة الجلد في وجود Y-2763210،11. في هذا البروتوكول، تبين أن Y-27632 تزيد بكفاءة من غلة الخلايا الصباغية الأولية. باستخدام الطريقة التقليدية لديه انخفاض معدل استعادة الخلايا ويحتاج حوالي 3 إلى 4 أسابيع من الثقافة للميلانوسيات لتنمو بأعداد كافية للمرور. هذه الطريقة الجديدة, التي يتم إضافة Y-27632 إلى متوسطة النمو تيفا, زيادة الغلة الصباغية بنحو خمس مرات, ويمكن أن تتكاثر الخلايا الصباغية التي تم الحصول عليها بشكل طبيعي. كما اختبرنا الطريقة الجديدة باستخدام وسيلة تجارية ووجدنا نتائج مماثلة. فيما يتعلق الآلية المعنية، أظهرت دراسة حديثة أن تأثير Y-27632 لتعزيز كفاءة عزل الصباغي يحدث بشكل رئيسي من خلال الخلايا الكيراتينوسيت16.
الأهم من ذلك، حصلنا على الخلايا الصباغية النقية مع وظيفة عادية باستخدام طريقة جديدة. الممر 1 (P1) كانت الصباغية تقريبا جميع الملطخة للتعبير MITF مما يدل على أن يتم الحصول على الخلايا الصباغية النقية بعد مرور الأول. الصباغيات الأولية مع إمكانات النمو العالية مهمة جدا للبحوث البيولوجية والتطبيقات السريرية. يمكن أن يتم تحريض الخلايا الصباغية المعزولة باستخدام الطريقة الجديدة على الصباغ بعد العلاج مع فورسكولين ، وهو منشط من الزرق الدنثالين الذي يزيد من مستويات AMP دوري ، مما يشير إلى هذه الخلايا الميلانيات يمكن أن تعمل بشكل طبيعي ، والتي ستكون مفيدة لدراسة عيوب التصبغ والميلانوما14.
باختصار، تم بنجاح إنشاء طريقة فعالة للغاية لعزل الخلايا الصباغية الأولية عن أنسجة الجلد البالغة. ويمكن لهذه الطريقة المحسنة أن تسهم في توفير أعداد كافية من الخلايا الصباغية بطريقة سريعة للبحوث البيولوجية والتطبيقات السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن جميع المؤلفين عدم وجود أي اهتمام بالتضارب.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2017YFA0104604)، والبرنامج العام للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81772093)، ومشروع البحوث اللوجستية العسكرية (AWS17J005)، والبرنامج الرئيسي لمؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة شاندونغ (ZR2019ZD36) ) وبرنامج البحث والتطوير الرئيسي لمقاطعة شاندونغ (2019GSF108107) إلى مؤسسة X.W. Guangdong الأساسية والتطبيقية للأبحاث الأساسية (2019A151510833) وصناديق البحوث الأساسية لجامعة شاندونغ (2019GN043) إلى J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P.
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
