Summary
В этой статье сообщается, что добавление Y-27632 к среде TIVA может значительно увеличить урожайность меланоцитов из тканей взрослой кожи.
Abstract
Изоляция и культура первичных меланоцитов из тканей кожи очень важна для биологических исследований и широко используется для клинического применения. Изоляция первичных меланоцитов из тканей кожи обычным методом обычно занимает от 3 до 4 недель, чтобы пройти достаточно. Что еще более важно, ткани, используемые, как правило, новорожденных крайней плоти, и это все еще вызов, чтобы эффективно изолировать первичные меланоциты из взрослых тканей. Недавно мы разработали новый метод изоляции меланоцитов, который добавляет Y-27632, ингибитор орокиназы, к исходной среде культуры на 48 ч. По сравнению с обычным протоколом, этот новый метод резко увеличивает урожайность меланоцитов и сокращает время, необходимое для изоляции меланоцитов из тканей форечкина. Теперь мы подробно описываем этот новый метод с использованием эпидермиса для эффективной культуры первичных меланоцитов. Важно отметить, что мы показываем, что меланоциты, полученные из взрослых тканей, приготовленные этим новым методом, могут нормально функционировать. Этот новый протокол будет значительно пользу исследования дефектов пигментации и меланомы с использованием первичных меланоцитов, подготовленных из легко доступны взрослых тканей кожи.
Introduction
Целью данного исследования была разработка простого и эффективного протокола по изоляции меланоцитов от эпидермиса взрослой кожи для биологических исследований и клинических применений. Меланоциты, которые расположены в базальном эпидермисе кожи и волосяных фолликулов, играют важную роль в пигментации кожи и волос, производя меланин1. В результате пигментации кожи от эпидермальных меланоцитов действует как ультрафиолетовый фильтр излучения, который уменьшает / предотвращает повреждение ДНК для основных клеток в коже2. Аномальное распространение меланоцитов в коже довольно часто, например, при формировании доброкачественных неви (кротов), в которых меланоциты потенциально трансформируются в онкогенный рост с последующим клеточным сенесценцией3.
С 1957 года изоляция и последующая культура первичных меланоцитов человека была возможна4, но только с 1982 года существует эффективный метод, который может воспроизводить культуры человеческих меланоцитов из эпидермиса5. Обычный метод изоляции первичных меланоцитов от эпидермиса включает в себя двухступенчатое ферментативное пищеварение. Короче говоря, кожа первоначально усваивается с диспазом, чтобы отделить эпидермис от дермы, после чего эпидермис усваивается с трипсином для производства суспензий, содержащих меланоциты и кератиноциты, которые затем могут быть выборочно выращены в различных средствах массовой информации. В настоящее время начальная культура обычно занимает от 3 до 4 недель для меланоцитов для достижения слияния с использованием обычного метода, который, вероятно, из-за низкой эффективности их изоляции. Таким образом, увеличение первоначального производства меланоцитов из тканей взрослой кожи было бы весьма полезным как для лабораторных исследований и клинических применений.
Многие факторы роста, большинство из которых, как было показано, выделяются кератиноцитами (например, З-МЗ, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF и SCF)5-8, регулируют дифференциацию и распространение мелких меланоцитов млекопитающих. При отсутствии фидерных слоев, отсутствие этих факторов роста приводит к снижению пролиферации меланоцитов и их повышенного апоптоза9. Сокультура кератиноцитов в качестве фидерных клеток и меланоцитов может привести к ускорению пролиферации меланоцитов и снижению апоптоза. Тем не менее, метод совместной культуры не только требует больше тканей кожи для подготовки кератиноцитов, что не практично, но и не может работать эффективно, потому что культурные условия, требуемые меланоцитов не способствует росту кератиноцитов, и наоборот.
Предыдущие исследования сообщали, что добавление Y-27632, ингибитора ROCK, в среду роста может повысить выход первичных эпидермальных клеток человека из тканей кожи10-14. Поэтому было бы интересно проверить, выиграет ли изоляция первичных меланоцитов человека от присутствия Y-27632. Действительно, добавление Y-27632 в прививку TIVA среды15, которая содержит TPA, IBMX, Na3VO4 и dbcAMP, значительно увеличил урожайность первичных меланоцитов, изолированных от тканей предпышной кожи в начальных культурах16. По сравнению с обычным протоколом, этот новый протокол значительно более эффективен в увеличении урожайности меланоцитов16. Таким образом, этот протокол описывает новый метод подробно с использованием тканей кожи взрослых на основе предыдущего исследования16 в целях содействия его применению в основных и прикладных биологических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование тканей взрослой плоти в этом протоколе было одобрено Комитетом по этике человека (No.2015120401, дата: 12 мая 2015 г.).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие процедуры в стерильной среде для предотвращения загрязнения клеток и культур.
1. Подготовка
- Соберите свежие ткани плоти взрослого человека из операций обрезания в 15 мЛ труб, содержащих 10 мл фосфатного буферного солевого раствора (PBS) и храните в 4 кк.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отделите ткани, как подробно ниже в течение 24 ч после их иссечения. - Подготовка реагентов и культуры среды.
- Подготовка 3% P / S (пенициллин / стрептомицин) в качестве стирального раствора. Смешайте 50 мЛ PBS с 1,5 мл пенициллина (100 U/mL) и стрептомицином (100 мг/л) (P/S).
- Подготовьте решение о прекращении (решение для нейтрализации) для нейтрализации ферментативного пищеварения. Дополнение 1% P/S, 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) в DMEM-среду.
- Подготовка TIVA средних культур меланоцитов: ветчина F12; 10% FBS; 1x П'С'глутамин; 50 нг/мЛ 12-О-тетрадеканилфор-13-ацетат (ТПА); 1 х 10-4 M 3-изобутил-1-метил ксантин (IBMX); 1 МКМ Na3VO4; 1 х 10-3 М N-6,2"-О-дибутиладенозин-3", 5-циклический монофосфат (dbcAMP).
2. Обычный метод
- Предлечение тканей кожи
- Промыть каждый взрослый крайней ткани крайней плоти один раз с 10 мл 75% этанола (алкоголь) в течение 30 с, а затем промыть дважды с 10 мЛ стирального раствора (3% P/ S), в течение 5 мин каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вымойте ткани плоти с 10 мл PBS в начале, если есть много крови. Все моет готовятся в 100 мм клеточной культуры блюда. - Очистите каждую хинтическую ткань хирургическим лезвием для удаления подкожных жировых тканей и рыхлых соединительной ткани на крышке 100-мм клеточной культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте скальпель, чтобы очистить жировые слои прочь, пока только тонкий эпидермис и плотная дерма остаются. - Перенесите каждую взрослую форескину в другое блюдо культуры 100 мм с дермой вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разрежьте каждую взрослую ткань плоти на 3-4 мм широкими полосками с помощью лезвия скальпеля, чтобы сделать диспасе работать более эффективно. - Добавьте 2,5 мг/мл диспазу к каждому блюду культуры 100 мм со взрослыми тканями крайней плоти и инкубировать в течение 16-20 ч при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый грамм ткани усваивается 10 мл раствора диспаспе.
- Промыть каждый взрослый крайней ткани крайней плоти один раз с 10 мл 75% этанола (алкоголь) в течение 30 с, а затем промыть дважды с 10 мЛ стирального раствора (3% P/ S), в течение 5 мин каждый.
- Отделение эпидермиса от ткани взрослой плоти
- После пищеварения на 16 до 20 ч, отделить эпидермис от дермы с помощью пинцета. Возьмите одну сторону дермального края ткани одним пинцетом и соответствующим положением эпидермальной части другим пинцетом и аккуратно снимите эпидермис.
- Вымойте эпидермис 3x с стиральным раствором (3% P/S), а затем перенесите эпидермис в трубку.
- Погрузите эпидермис, добавив 5 мл 0,05% трипсина в трубку и инкубировать в водяной бане в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхните трубку, чтобы убедиться, что эпидермис полностью погружен до инкубации.
- Сбор и культура первичных клеток
- Добавить равный объем решения прекращения (10% FBS, 1% P / S в DMEM), чтобы нейтрализовать трипсина и пипетки раствор вверх и вниз 10-15 раз, чтобы отделить эпидермальные клетки.
- Передайте суспензию ячейки в новую трубку 50 мл через фильтр сетки 100 мкм для удаления мусора.
- Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и добавить 10 мл прививки TIVA среды для повторного регулирования клеток.
- Семя резвиированных клеток в 100 мм культуры блюдо.
- Культура в инкубаторе с 5% CO2.
- Меняйте среду каждые 2 дня.
- Проход клетки, когда они достигают 80% слияния.
3. Новый метод
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура подготовки тканей и пищеварения в новом методе такая же, как описано выше для обычного метода, с той лишь разницей, что изолированные свежие клетки резуспенились в 10 мл среды TIVA, содержащей 10 М Y-27632.
- Через два дня после посева замените носитель обычным средством TIVA без Y-27632. После этого культурные условия одинаковы между новыми и традиционными методами.
4. Прохождение клеток
- Удалите среднюю TIVA и промойте каждое блюдо культуры дважды с PBS.
- Добавьте 2 мл 0,05% трипсина на блюдо культуры клеток на 100 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхните блюдо, чтобы обеспечить адекватный контакт между пищеварительными ферментами и нижней частью блюда. - Дайджест в инкубаторе 37 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
- Используйте микроскоп, чтобы проверить клетки, и убедитесь, что большинство клеток отмежевались от клеточной культуры блюдо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно коснитесь блюда, чтобы освободить клетки, чтобы округлить и плавать в растворе. Продлить время пищеварения, если большинство клеток не приостанавливают после постукивания, но не более 5 мин. - Перенесите меланоциты в трубку 15 мЛ после нейтрализации активности трипсина, добавив 2 мЛ раствора прекращения. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин.
- Resuspend каждой клетки гранулы с 10 мЛ TIVA среды после медленно удаления супернатанта, а затем подсчитать количество меланоцитов.
- Плита около 1 х 106 меланоцитов в 10 мл TIVA среднего на 100 мм клеточной культуры блюдо.
- Обновить среду клеточной культуры каждые 48 ч.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана схематическая диаграмма, сравнивающая обычные и новые методы. Процедура подготовки тканей и пищеварения с помощью нового метода такая же, как и процедура обычного метода, с той лишь разницей, что изолированные клетки резуснулись в 10 мл среды TIVA в присутствии 10 М Y-27632. Через два дня после посева замените носитель обычным средством TIVA без Y-27632. Обычный метод изоляции первичных меланоцитов из тканей кожи обычно требует около 3 до 4 недель для меланоцитов расти в достаточном количестве для прохождения, но что более важно, ткани обычно приходят от новорожденных детей, и это очень трудно изолировать первичных меланоцитов из тканей взрослой кожи. Однако, используя новый метод, меланоциты из тканей взрослых наблюдаются в значительно большем количестве, чем меланоциты, изолированные с помощью обычного метода. Микроскопические взгляды были приняты в дни 3, 6 и 8 при изоляции меланоцитов от ткани кожи взрослого человека с использованием обычного метода и нового метода (Рисунок 2A). В этих микроскопических взглядов, новый метод значительно увеличил урожайность меланоцитов в дни 6 и 8. Затем число меланоцитов было количественно подсчитано, считая по крайней мере 10 различных микроскопических полей в дни 3, 6 и 8. Результаты показали, что количество меланоцитов, изолированных с помощью нового метода, намного выше, чем количество меланоцитов, изолированных с использованием обычного метода в дни 6 и 8(рисунок 2B). После 8 дней культуры, меланоциты были собраны с использованием трипсина, а затем подсчитаны с автоматизированной счетчик клеток в каждом отдельном 100 мм блюдо, которое показало, что новый метод увеличил урожайность меланоцитов примерно в пять раз (Рисунок 2C). Микроскопические взгляды, принятые в день 9, на следующий день после прохождения, показали, что проходные меланоциты размножаются нормально (Рисунок 2D), который был подтвержден Ki67 окрашивания (Рисунок 2E).
Повышенный выход меланоцитов по Y-27632 во время начальной культуры после изоляции было показано через регулирование кератиноцитов в предыдущей публикации16. Как показано на рисунке 3, Y-27632 не увеличить рост и распространение проходных меланоцитов(рисунок 3A-B) и не ингибирует апоптоз меланоцитов (Рисунок 3C-D). Тем не менее, Y-27632 значительно увеличилось кератиноцитов вложения (Рисунок 3E-H), а также способствовало его выживания (Рисунок 3I) в меланоцит-культуры TIVA средств массовой информации. Либо совместное культуры с кератиноцитов в присутствии Y-27632 или условных средств, полученных из Y-27632 лечение кератиноцитов может значительно повысить рост меланоцитов (Рисунок 3J).
Для дальнейшего характеристики меланоцитов, изолированных с помощью нового метода, MITF, специфический маркер меланоцитов, был проанализирован с помощью иммунофлуоресценции (IF) окрашивания, чтобы проверить чистоту меланоцитов после первоначального пропуска. Рисунок 4A показывает, что процент клеток, выражающих MITF при прохождении 1, был почти 100%, что указывает на то, что чистые меланоциты были получены после первого прохождения новым методом, который похож на обычный метод. Чтобы проверить, могут ли меланоциты, изолированные с помощью нового метода, нормально функционировать, их лечили форсколином (ФСК) в течение 2 дней в пробирке, что индуцировало уровень пигментации меланоцитов(рисунок 4B). Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что меланоциты, изолированные с помощью нового метода, могут нормально функционировать и могут производить пигмент.
Рисунок 1: Сравнение нового метода и обычного метода. Эта схема показывает сравнение обычного метода с новым методом изоляции. Разница лишь в том, что изолированные свежие клетки повторно используются в 10 мл среды TIVA в присутствии 10 м Y-27632. Через два дня после посева среда заменяется обычной средой TIVA без Y-27632. Новый метод обычно достигает плотности меланоцитов подходит для прохождения около дня 8, в то время как обычный метод обычно занимает около 20 дней, чтобы вырастить достаточное количество меланоцитов для прохождения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Новый метод изоляции увеличивает выработку первичных меланоцитов. (A) Репрезентативные изображения меланоцитов, подготовленные обычным методом (верхний ряд) и новым методом (нижний ряд) в дни 3, 6 и 8 после первоначальной прививки. (B) Количественная оценка числа меланоцитов, подготовленных с использованием обычного метода и нового метода, подсчитывая числа меланоцитов по крайней мере в 10 различных микроскопических полей (номер клетки/ зрение) в дни 3, 6 и 8. Все эксперименты проводились в трипликате и результаты выражаются как среднее количество клеток на микроскопическое поле. (C) После культуры в течение 8 дней, меланоциты были собраны с использованием трипсина и количество меланоцитов, приготовленных с использованием обычного метода и новый метод были подсчитаны с помощью пластины подсчета клеток. Количество клеток было рассчитано из трипликатных экспериментов, и результаты показывают среднее количество клеток на 100 мм блюдо. (D) После подсчета количества меланоцитов с помощью автоматизированного счетчика клеток, меланоциты, приготовленные с использованием обычного метода или новый метод были посеяны в новых блюдах и микроскопические фотографии были сделаны в день 9. (E) Меланоциты, изолированные с помощью нового метода при прохождении 0 или при прохождении 1, были зафиксированы и окрашены антителами Ki67 (красный) и DAPI (ядра, синий). (B-C, Студенческий t-тестбыл использован для анализа различий между новым и обычным методом, - P q lt; 0.01,P q lt; 0.005. Все бары масштаба представляют 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Y-27632 усиливает рост меланоцитов путем регуляции кератиноцитов. ( A )Чистыемеланоциты (проход 3) были обработаны с 10 М Y-27632 для 12, 24, 48 и 60 ч и количество меланоцитов было проанализировано CCK-8 анализ. (B) Чистые меланоциты (проход 3) были обработаны с 10 М Y-27632 для 48h, а затем были зафиксированы для Ki67 окрашивания. Количественная оценка процента положительных клеток Ki67 среди общего числа живых клеток, указанных с ядерным окрашиванием DAPI. (C-D) Чистые меланоциты (проход 3) лечились 10 мл Y-27632 на 48 ч, а затем были либо окрашены для апоптотических клеток с annexin V-FITC и пропидий йодид следуют АНАЛИЗ FACS(C) или фиксированной для TUNEL анализа. (E) Изолированный эпидермис после трипсин пищеварения был покрыт TIVA среды с или без Y-27632 (10 мМ) и 2 дня спустя иммунофлуоресценции анализ кератиноцитов был выполнен с пан-цитокеракатин антитела (пан-ck). (F) Количественная оценка кератиноцитов в Y-27632-обработанных и контрольных блюд из (E) в процентах от кератиноцитов в общей сложности 500 клеток насчитали. (G) Чистый проход 3 кератиноцитов были посеяны в среде TIVA с или без Y-27632 (10 мМ). Изображения эпидермальных клеток отображаются в один день после посева. (H) Количественная оценка прикрепленных кератиноцитов в Y-27632-обработанных и контрольных блюд из(G)в качестве процента прикрепленных клеток в общей сложности 5000 клеток, посеянных. (I) Чистый проход 3 кератиноцитов были покрыты TIVA среды в присутствии или отсутствии Y-27632. Микроскопические изображения были получены на 24 h. (J) Левая панель: Равные номера чистого прохода 3 меланоцитов были покрыты TIVA среды в 4 группы с добавлением (ы) как указано: 1) Y-27632 (10 ) М) только (Y на графике), 2) проход 3 кератиноцитов в одиночку, 3) кератиноциты и Y-27632 (10 МКМ) (КЗЗ), и 4) никакого добавления (отрицательный контроль, con). Относительные складки в пролиферации меланоцитов по сравнению с отрицательным контролем были определены путем подсчета количества меланоцитов на 24 ч и 48 ч после покрытия. Правая панель: Условные средства TIVA были получены от 4 групп прохода 3 культур меланоцитов в (левой панели) на 48 ч после покрытия. Затем, равное количество прохода 3 меланоцитов были покрыты в 4 группы, каждая из которых обусловлена средств массовой информации. Относительные складки в пролиферации меланоцитов по сравнению с отрицательным контролем были определены путем подсчета количества меланоцитов на 24 ч и 48 ч после покрытия. (A-J) Все эксперименты повторялись в течение 3 раз,р-л.л.;0,05, р-л;0,01,pр-л;0,005.p Все бары на изображениях представляют 100 мкм. Цифра была изменена с Mi et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Характеристика меланоцитов, изолированных с помощью нового метода. () Представительизображения иммунофлуоресценции окрашивания MITF (красный) в меланоцитах, подготовленных с использованием нового или обычного метода. DAPI пятна ядер (синий). (B) Клеточные гранулы были собраны из меланоцитов, приготовленных по новому методу и лечились в течение 2 дней с форсколином (ФСК) или DMSO транспортным средством в качестве контроля (кон). Все бары масштаба представляют 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, был основан на недавней публикации16. Особое внимание следует уделить следующим важнейшим шагам для достижения наилучших результатов с помощью нового метода. Во-первых, успешное разделение эпидермиса и дермы имеет решающее значение. Разрежьте ткани взрослой плоти на полоски шириной 3-4 мм с помощью скальпеля, чтобы сделать диспазу работать более тщательно и легко, чтобы отделить эпидермис от дермы. Во-вторых, при разделении этих двух слоев, загрязнение дермы следует избегать, так как дермальные фибробласты могут также расти в среде культуры меланоцитов. В-третьих, шаг пищеварения трипсина должен быть менее 30 мин; в противном случае это значительно снизит жизнеспособность изолированных клеток.
Этот новый метод значительно сокращает время, необходимое для изоляции меланоцитов. Человеческие эпидермальные меланоциты вырабатыват меланин, который защищает кожу от солнечного облучения. Eisinger и Марко предложил первый практический метод для культуры человеческих меланоцитов из эпидермиса5. Самое главное, ткани, используемые обычно приходят от новорожденных детей, и это очень трудно изолировать первичных меланоцитов из взрослых тканей кожи. Ингибитор протеиновой киназы Y-27632 значительно повышает эффективность эпидермальной изоляции стволовых клеток11-13. Кроме того, мы также сообщили о методе изоляции первичных эпидермальных клеток человека из тканей кожи в присутствии Y-2763210,11. В этом протоколе было показано, что Y-27632 эффективно повышает урожайность первичных меланоцитов. Использование обычного метода имеет низкий уровень восстановления клеток и требует около 3 до 4 недель культуры для меланоцитов расти в достаточном количестве для прохождения. Этот новый метод, в котором Y-27632 добавляется в среду роста TIVA, увеличение урожайности меланоцитов примерно в пять раз, и полученные меланоциты могут размножаться нормально. Мы также протестировали новый метод с использованием коммерческой среды и нашли аналогичные результаты. Что касается механизма, недавнее исследование показало, что эффект Y-27632 для повышения эффективности изоляции меланоцитов происходит в основном через кератиноциты16.
Важно отметить, что мы получили чистые меланоциты с нормальной функцией с помощью нового метода. Проход 1 (P1) меланоциты были почти все окрашенные для MITF выражение, указывающее на то, что чистые меланоциты получены после первого прохода. Первичные меланоциты с высоким потенциалом роста очень важны для биологических исследований и клинических применений. Меланоциты, выделенные с помощью нового метода, могут быть вызваны пигментом после лечения форсколином, активатором аденилата циклазы, который повышает циклические уровни АМП, что указывает на то, что эти меланоциты могут нормально функционировать, что будет полезно для изучения дефектов пигментации и меланомы14.
Таким образом, был успешно создан высокоэффективный метод изоляции первичных меланоцитов из тканей взрослой кожи. Этот усовершенствованный метод может способствовать обеспечению достаточного количества меланоцитов в быстрой манере для биологических исследований и для клинического применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии интереса к конфликту.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальной программой исследований и разработок Китая (2017YFA01016604), Общей программой Национального фонда естественных наук Китая (81772093), Проектом военно-логистических исследований (AWS17J005), Ключевой программой Фонда естественных наук провинции Шаньдун (ЗР2019 ) и Основные программы исследований и развития провинции Шаньдун (2019GSF108107) для X.W. Гуандун Основные и прикладные основные исследования фонда (2019A1515110833) и фундаментальные исследовательские фонды Шаньдунского университета (2019GN043) для J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P.
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
