Summary
Este artigo relata que a adição de Y-27632 ao meio TIVA pode aumentar significativamente o rendimento de melanócitos de tecidos de pele adultos.
Abstract
O isolamento e a cultura dos melanócitos primários dos tecidos da pele é muito importante para a pesquisa biológica e tem sido amplamente utilizado para aplicações clínicas. Isolar melanócitos primários dos tecidos da pele pelo método convencional geralmente leva cerca de 3 a 4 semanas para passar o suficiente. Mais importante, os tecidos utilizados geralmente são prepúcios recém-nascidos e ainda é um desafio isolar eficientemente os melanócitos primários de tecidos adultos. Recentemente desenvolvemos um novo método de isolamento para melanócitos que adiciona Y-27632, um inibidor de Rho quinase, ao meio de cultura inicial por 48 h. Em comparação com o protocolo convencional, este novo método aumenta drasticamente o rendimento dos melanócitos e encurta o tempo necessário para isolar melanócitos de tecidos foreskin. Descrevemos agora este novo método com mais detalhes usando epiderme adulta para cultivar de forma eficiente melanócitos primários. É importante ressaltar que os melanócitos obtidos a partir de tecidos adultos preparados por este novo método podem funcionar normalmente. Este novo protocolo beneficiará significativamente os estudos de defeitos de pigmentação e melanomas usando melanócitos primários preparados a partir de tecidos de pele adultos de fácil acesso.
Introduction
O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo simples e eficaz para isolar melanócitos da epiderme da pele adulta para pesquisa biológica e aplicações clínicas. Os melanócitos, localizados na epiderme basal da pele e nos folículos capilares, desempenham um papel importante na pigmentação da pele e do cabelo, produzindo melanina1. A pigmentação da pele resultante dos melanócitos epidérmicos atua como um filtro de radiação ultravioleta que reduz/previne danos ao DNA às células subjacentes na pele2. A proliferação anormal de melanócitos na pele é bastante comum, como na formação de nevi benigno (mols) em que os melanócitos potencialmente se transformam em crescimento oncogênico seguido pela senescência celular3.
Desde 1957, o isolamento e a cultura subsequente dos melanócitos primários humanos são possíveis4, mas somente desde 1982 existe um método eficiente que pode estabelecer de forma reproduzivelmente culturas de melanócitos humanos a partir da epiderme5. O método convencional para isolar melanócitos primários da epiderme envolve uma digestão enzimática de duas etapas. Resumidamente, a pele é inicialmente digerida com despase para separar a epiderme da derme, após a qual a epiderme é digerida com trippsina para produzir suspensões contendo melanócitos e queratinócitos, que podem então ser cultivados seletivamente em diferentes mídias. Atualmente, a cultura inicial geralmente leva cerca de 3 a 4 semanas para que os melanócitos atinjam a confluência usando o método convencional, o que é provável devido à baixa eficiência de seu isolamento. Portanto, aumentar a produção inicial de melanócitos a partir de tecidos de pele adultos seria bastante útil tanto para pesquisas laboratoriais quanto para aplicações clínicas.
Muitos fatores de crescimento, a maioria dos quais têm se mostrado secretados por queratinócitos (por exemplo, α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF e SCF)5-8, regulam a diferenciação e proliferação de melanócitos mamíferos. Na ausência de camadas alimentadores, a falta desses fatores de crescimento leva à diminuição da proliferação de melanócitos e ao aumento da apoptose9. A co-cultura dos queratinócitos como células alimentadoras e melanócitos poderia levar à acelerada proliferação de melanócitos e à redução da apoptose. No entanto, o método de cocultura não só exige mais tecidos da pele para preparar queratinócitos, o que não é prático, mas também não poderia funcionar de forma eficiente porque as condições culturais exigidas pelos melanócitos não favorecem o crescimento do queratinócito, e vice-versa.
Estudos anteriores relataram que a adição do Y-27632, um inibidor de ROCHA, no meio de crescimento pode aumentar o rendimento das células epidérmicas primárias humanas dos tecidos da pele10-14. Portanto, seria interessante testar se o isolamento dos melanócitos primários humanos beneficiaria da presença de Y-27632. De fato, a adição de Y-27632 no meio TIVA de inoculação15, que contém TPA, IBMX, Na3VO4 e dbcAMP, aumentou significativamente o rendimento de melanócitos primários isolados dos tecidos prepúcios nas culturas iniciais16. Em comparação com o protocolo convencional, este novo protocolo é significativamente mais eficiente no aumento do rendimento dos melanócitos16. Portanto, este protocolo descreve o novo método em detalhes utilizando tecidos de pele adultos com base em um estudo anterior16, a fim de promover sua aplicação em pesquisas biológicas básicas e aplicadas.
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Protocol
O uso de tecidos de prepúcio adulto neste protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana (nº 2015120401, data: 12 de maio de 2015).
NOTA: Realize todos os seguintes procedimentos em um ambiente estéril para evitar contaminações de células e culturas.
1. Preparativos
- Reúna tecidos de prepúcio adulto frescos de cirurgias de circuncisão em tubos de 15 mL contendo 10 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) e armazene em 4 °C.
NOTA: Separe os tecidos conforme detalhado abaixo dentro de 24 horas após sua excisão. - Prepare reagentes e meio de cultura.
- Prepare 3% P/S (penicilina/estreptomicina) como solução de lavagem. Misture 50 mL de PBS com 1,5 mL de penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 mg/L) (P/S).
- Prepare a solução de terminação (solução de neutralização) para neutralização da digestão enzimática. Suplementação 1% P/S, 10% soro bovino fetal (FBS) em meio DMEM.
- Preparar melanócitos tiva para cultura: F12 de Ham; 10% FBS; 1x P⁄S⁄glutamina; 50 ng/mL 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetato (TPA); 1 x 10-4 M 3-isobutyl-1-metil xanthine (IBMX); 1 μm na3VO4; 1 x 10-3 M N-6,2′-O-dibutyryladenosine-3′,5′-cíclico monofosfato (dbcAMP).
2. O método convencional
- Pré-tratamento do tecido da pele
- Enxágüe cada tecido prepúcio adulto uma vez com 10 mL de 75% de etanol (álcool) para 30 s, e depois enxágue duas vezes com 10 mL de solução de lavagem (3% P/S), por 5 min cada.
NOTA: Lave os tecidos de prepúcio com 10 mL de PBS no início se houver muito sangue. Todas as lavagens são preparadas em pratos de cultura celular de 100 mm. - Raspe cada tecido de prepúcio com uma lâmina cirúrgica para remover tecidos adiposos subcutâneos e tecidos conjuntivos soltos na tampa de um prato de cultura celular de 100 mm.
NOTA: Use um bisturi para raspar as camadas de gordura até que apenas a epiderme fina e a derme densa permaneçam. - Transfira cada prepúcio adulto para outro prato de cultura de 100 mm com o lado dermis para baixo.
NOTA: Corte cada tecido de prepúcio adulto em tiras de 3-4 mm de largura usando uma lâmina de bisturi para fazer o dispase funcionar de forma mais eficiente. - Adicione 2,5 mg/mL dispase a cada prato de cultura de 100 mm com tecidos de prepúcio adulto e incubar por 16 a 20 h a 4 °C.
NOTA: Cada grama de tecido é digerido com 10 mL de solução de despase.
- Enxágüe cada tecido prepúcio adulto uma vez com 10 mL de 75% de etanol (álcool) para 30 s, e depois enxágue duas vezes com 10 mL de solução de lavagem (3% P/S), por 5 min cada.
- Separação da epiderme do tecido prepúcio adulto
- Após a digestão por 16 a 20 h, separe a epiderme da derme usando pinças. Pegue um lado da borda dérmica do tecido com uma pinça e a posição correspondente da parte epidérmica com outra pinça e retire suavemente a epiderme.
- Lave a epiderme 3x com solução de lavagem (3% P/S) e, em seguida, transfira a epiderme para um tubo.
- Submergir a epiderme adicionando 5 mL de 0,05% de trippsina no tubo e incubar em um banho de água por 30 min a 37 °C.
NOTA: Agite o tubo para garantir que a epiderme esteja completamente submersa antes da incubação.
- Coleta e cultura de células primárias
- Adicione um volume igual de solução de terminação (10% FBS, 1% P/S em DMEM) para neutralizar a trippsina e pipetar a solução para cima e para baixo 10-15 vezes para separar as células epidérmicas.
- Passe a suspensão da célula em um novo tubo de 50 mL através de um filtro de malha de 100 μm para remover detritos.
- Centrifugar a 200 x g por 5 min.
- Remova o supernascimento e adicione 10 mL de meio TIVA de inoculação para resuspensar as células.
- Semear as células resuspended em um prato de cultura de 100 mm.
- Cultura em uma incubadora de 37° C com 5% de CO2.
- Troque o meio a cada 2 dias.
- Células de passagem quando atingem 80% de confluência.
3. O novo método
NOTA: O procedimento de preparação e digestão tecidual no novo método é o mesmo descrito acima para o método convencional, sendo que as únicas células frescas isoladas são resuspengiadas em 10 mL de meio TIVA contendo 10 μM Y-27632.
- Dois dias após a semeadura, substitua a mídia por um meio TIVA normal sem Y-27632. Depois disso, as condições culturais são as mesmas entre os métodos novos e convencionais.
4. Passagem celular
- Retire o meio TIVA e enxágue cada prato de cultura duas vezes com PBS.
- Adicione 2 mL de 0,05% de trippsina por prato de cultura celular de 100 mm.
NOTA: Agite o prato para garantir o contato adequado entre enzimas digestivas e o fundo do prato. - Digerir em uma incubadora de 37 °C por 2 min.
- Use um microscópio para verificar as células, e certifique-se de que a maioria das células se dissociou do prato de cultura celular.
NOTA: Toque suavemente no prato para soltar as células para arredondar e flutuar na solução. Prolongue o tempo de digestão se a maioria das células não suspender após o toque, mas não mais do que 5 minutos. - Transfira os melanócitos para um tubo de 15 mL depois de neutralizar a atividade de trippsina adicionando 2 mL de solução de rescisão. Centrifugar a 200 x g por 5 min.
- Resuspengue cada pelota celular com 10 mL de meio TIVA depois de remover lentamente o supernasce e, em seguida, contar o número de melanócitos.
- Placa cerca de 1 x 106 melanócitos em 10 mL de meio TIVA por prato de cultura celular de 100 mm.
- Renove o meio de cultura celular a cada 48 horas.
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Representative Results
A Figura 1 mostra um diagrama esquemático comparando os métodos convencionais e os novos. O procedimento de preparação e digestão tecidual com o novo método é o mesmo que o procedimento para o método convencional, sendo que a única diferença é que as células isoladas são resuspengiadas em 10 mL de meio TIVA na presença de 10 μM Y-27632. Dois dias após a semeadura, substitua a mídia por um meio TIVA normal sem Y-27632. O método convencional de isolar melanócitos primários dos tecidos da pele geralmente requer cerca de 3 a 4 semanas para que os melanócitos cresçam em número suficiente para a passagem, mas o mais importante, os tecidos geralmente vêm de recém-nascidos e é muito difícil isolar melanócitos primários de tecidos de pele adultos. No entanto, usando o novo método, melanócitos de tecidos adultos são observados em números significativamente maiores do que os melanócitos isolados usando o método convencional. As visões microscópicas foram tomadas nos dias 3, 6 e 8 ao isolar os melanócitos do tecido de pele adulto utilizando o método convencional e o novo método (Figura 2A). Nestas visões microscópicas, o novo método aumentou significativamente o rendimento dos melanócitos nos dias 6 e 8. Os números de melanócitos foram então quantificados contando pelo menos 10 diferentes campos microscópicos nos dias 3, 6 e 8. Os resultados mostraram que o número de melanócitos isolados utilizando o novo método é muito maior do que o número de melanócitos isolados utilizando o método convencional nos dias 6 e 8 (Figura 2B). Após 8 dias de cultura, os melanócitos foram colhidos usando trippsina e, em seguida, contados com um contador celular automatizado em cada prato de 100 mm, o que revelou que o novo método aumentou o rendimento do melanócito em cerca de cincovezes (Figura 2C). As visões microscópicas tiradas no dia 9, um dia após a passagem, mostraram que os melanócitos passagens proliferaram normalmente(Figura 2D),o que foi confirmado pela mancha ki67(Figura 2E).
O rendimento aprimorado dos melanócitos por Y-27632 durante a cultura inicial após o isolamento foi demonstrado através da regulação de queratinócitos em uma publicação anterior16. Como mostrado na Figura 3, Y-27632 não aumentou o crescimento e a proliferação de melanócitos passagens(Figura 3A-B) e não inibiu a apoptose dos melanócitos(Figura 3C-D). No entanto, Y-27632 aumentou significativamente o apego queratinócito (Figura 3E-H) e também promoveu sua sobrevivência (Figura 3I) na mídia TIVA da cultura melanócito. Seja a cocultura com queratinócitos na presença de Y-27632 ou o meio condicionado derivado de queratinócitos tratados Y-27632 poderiam aumentar significativamente o crescimento dos melanócitos(Figura 3J).
Para caracterizar ainda mais os melanócitos isolados utilizando o novo método, o MITF, um marcador específico de melanócitos, foi analisado utilizando-se de coloração de imunofluorescência (IF) para verificar a pureza dos melanócitos após a passagem inicial. A Figura 4A mostra que a porcentagem de células expressando MITF na passagem 1 foi de quase 100%, indicando que os melanócitos puros foram obtidos após a primeira passagem pelo novo método, que é semelhante ao método convencional. Para testar se os melanócitos isolados usando o novo método podem funcionar normalmente, foram tratados com forskolin (FSK) por 2 dias in vitro, o que induziu os níveis de pigmentação dos melanócitos(Figura 4B). Juntos, esses dados sugerem que os melanócitos isolados usando o novo método podem funcionar normalmente e podem produzir pigmento.
Figura 1: Comparação do novo método e do método convencional. Este esquema mostra uma comparação do método convencional com o novo método de isolamento. A única diferença é que as células frescas isoladas são resuspengiadas em 10 mL de meio TIVA na presença de 10 μM Y-27632. Dois dias após a semeadura, o meio é substituído por meio TIVA normal sem Y-27632. O novo método geralmente alcança uma densidade de melanócitos adequados para a passagem por volta do dia 8, enquanto o método convencional geralmente leva cerca de 20 dias para crescer um número suficiente de melanócitos para a passagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O novo método de isolamento aumenta a produção de melanócitos primários. (A) Imagens representativas de melanócitos preparados pelo método convencional (linha superior) e pelo novo método (linha inferior) nos dias 3, 6 e 8 após a inoculação inicial. (B) Quantificação dos números de melanócitos preparados utilizando o método convencional e o novo método contando números de melanócitos em pelo menos 10 diferentes campos microscópicos (número celular/visão) nos dias 3, 6 e 8. Todos os experimentos foram realizados em triplicado e os resultados são expressos como o número médio de células por campo microscópico. (C) Após a cultura durante 8 dias, os melanócitos foram colhidos utilizando tripóbicos e o número de melanócitos preparados utilizando o método convencional e o novo método foi contado utilizando uma placa de contagem de células. O número de células foi calculado a partir de experimentos triplicados, e os resultados mostram o número médio de células por prato de 100 mm. (D) Após contar o número de melanócitos usando um contador celular automatizado, melanócitos preparados utilizando o método convencional ou o novo método foram semeados em novos pratos e fotos microscópicas foram tiradas no dia 9. (E) Os melanócitos isolados utilizando o novo método na passagem 0 ou na passagem 1 foram fixados e manchados com anticorpo Ki67 (vermelho) e DAPI (núcleos, azul). (B-C), O teste tdo aluno foi utilizado para analisar diferenças entre o novo e o método convencional, ** P < 0,01, ***P < 0,005. Todas as barras de escala representam 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Y-27632 melhora o crescimento do melanócito através da regulação de queratinócitos. (A) Melanócitos puros (passagem 3) foram tratados com 10 μM Y-27632 para 12, 24, 48 e 60 h e o número de melanócitos foi analisado pelo ensaio CCK-8. (B) Os melanócitos puros (passagem 3) foram tratados com 10 μM Y-27632 por 48h e, em seguida, foram fixados para a coloração ki67. Quantificação do percentual de células positivas ki67 entre células vivas totais indicadas com coloração nuclear DAPI. (C-D) Os melanócitos puros (passagem 3) foram tratados com 10 μM Y-27632 por 48 h e, em seguida, foram manchados para células apoptóticas com anexo V-FITC e iodeto de propidium seguido de análise FACS (C) ou fixado para ensaio TUNEL. (E) A epiderme isolada após a digestão da trippsina foi emplacada com meio TIVA com ou sem Y-27632 (10 μM) e 2 dias depois a análise de imunofluorescência de queratinócitos foi realizada com um anticorpo pan-citokeratin (pan-ck). (F) Quantificação de queratinócitos nos pratos tratados e de controle Y-27632 de (E) como porcentagem de queratinócitos em um total de 500 células contadas. (G) A passagem pura 3 queratinócitos foram semeadas em meio TIVA com ou sem Y-27632 (10 μM). Imagens de células epidérmicas são mostradas um dia após a semeadura. (H) Quantificação de queratinócitos anexados nos pratos tratados e de controle Y-27632 de (G) como a porcentagem de células anexadas em um total de 5000 células semeadas. (I) A passagem pura 3 queratinócitos foram emplacados com meio TIVA na presença ou ausência de Y-27632. As imagens microscópicas foram obtidas às 24 h. (J) Painel esquerdo: Números iguais de passagem pura 3 melanócitos foram emplacados com meio TIVA em 4 grupos com adição(s) conforme indicado: 1) Y-27632 (10 μM) sozinho (Y no gráfico), 2) passagem 3 queratinócitos sozinhos , 3) queratinócitos e Y-27632 (10 μM) (K+Y) e 4) sem adição (controle negativo, con). As alterações relativas da dobra na proliferação de melanócitos em relação ao controle negativo foram determinadas contando o número de melanócitos em 24h e 48h após o revestimento. Painel direito: As mídias TIVA condicionadas foram obtidas dos 4 grupos de culturas de melanócitos de passagem 3 em (painel esquerdo) às 48h após o revestimento. Em seguida, números iguais de passagem 3 melanócitos foram emplacados em 4 grupos, cada um com um dos meios de comunicação condicionados. As alterações relativas da dobra na proliferação de melanócitos em relação ao controle negativo foram determinadas contando o número de melanócitos em 24h e 48h após o revestimento. (A-J) Todos os experimentos foram repetidos por 3 vezes, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005. Todas as barras nas imagens representam 100 μm. A figura foi modificada a partir de Mi et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Caracterização de melanócitos isolados utilizando o novo método. (A) Imagens representativas da coloração da imunofluorescência do MITF (vermelho) em melanócitos preparados utilizando o método novo ou convencional. Dapi mancha núcleos (azul). (B) As pelotas celulares foram coletadas de melanócitos preparados utilizando o novo método e foram tratadas por 2 dias com forskolin (FSK) ou veículo DMSO como controle (con). Todas as barras de escala representam 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito aqui foi baseado em uma publicação recente16. Alguma atenção deve ser dada aos seguintes passos críticos para alcançar os melhores resultados com o novo método. Em primeiro lugar, a separação bem sucedida da epiderme e da derme é crucial. Corte os tecidos de prepúcio adulto em tiras de 3-4 mm de largura usando uma lâmina de bisturi para fazer o dispase funcionar com mais profundidade e facilidade para separar a epiderme da derme. Em segundo lugar, ao separar essas duas camadas, a contaminação da dermis deve ser evitada, uma vez que os fibroblastos dérmicos também podem crescer no meio da cultura melanócito. Em terceiro lugar, o passo de digestão da trippsina deve ser inferior a 30 minutos; caso contrário, diminuirá significativamente a viabilidade das células isoladas.
Este novo método encurta significativamente o tempo necessário para o isolamento dos melanócitos. Melanócitos epidérmicos humanos produzem melanina, que protege a pele de danos à irradiação solar. Eisinger e Marko propuseram o primeiro método prático para a cultura dos melanócitos humanos a partir da epiderme5. Mais importante, os tecidos usados geralmente vêm de recém-nascidos e é muito difícil isolar melanócitos primários de tecidos de pele adultos. O inibidor de proteínas associadas a Rho Y-27632 melhora significativamente a eficiência do isolamento epidérmico de células-tronco11-13. Além disso, também relatamos um método para isolar células epidérmicas primárias humanas dos tecidos da pele na presença de Y-2763210,11. Neste protocolo, o Y-27632 mostrou-se para aumentar eficientemente o rendimento dos melanócitos primários. O uso do método convencional tem uma baixa taxa de recuperação celular e precisa de cerca de 3 a 4 semanas de cultura para que os melanócitos cresçam em número suficiente para a passagem. Este novo método, no qual o Y-27632 é adicionado ao meio de crescimento TIVA, aumentou o rendimento do melanócito em cerca de cinco vezes, e os melanócitos obtidos podem proliferar normalmente. Também testamos o novo método usando um meio comercial e encontramos resultados semelhantes. Em relação ao mecanismo envolvido, um estudo recente demonstrou que o efeito do Y-27632 para aumentar a eficiência do isolamento dos melanócitos ocorre principalmente através de queratinócitos16.
É importante ressaltar que obtivemos melanócitos puros com função normal usando o novo método. Os melanócitos da Passagem 1 (P1) estavam quase todos manchados para a expressão MITF indicando que melanócitos puros são obtidos após a primeira passagem. Melanócitos primários com alto potencial de crescimento são muito importantes para pesquisas biológicas e aplicações clínicas. Os melanócitos isolados usando o novo método podem ser induzidos ao pigmento após o tratamento com forskolina, um ativador de ciclamato adenílato que aumenta os níveis cíclicos de AMP, indicando que esses melanócitos podem funcionar normalmente, o que será útil para estudar defeitos de pigmentação e melanoma14.
Em resumo, um método altamente eficiente foi estabelecido com sucesso para isolar melanócitos primários de tecidos de pele adultos. Esse método aprimorado poderia contribuir para fornecer um número suficiente de melanócitos de forma rápida para a pesquisa biológica e para aplicações clínicas.
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Disclosures
Todos os autores não declaram interesse de conflito.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2017YFA0104604), O Programa Geral da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (81772093), Projeto de Pesquisa Logística Militar (AWS17J005), o Programa Chave da Fundação de Ciências Naturais da Província de Shandong (ZR2019ZD36) e o Programa de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da Província de Shandong (2019GSF108107) para x.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A151510833) e Os Fundos Fundamentais de Pesquisa da Universidade de Shandong (2019GN043) para J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
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