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Biochemistry

Ensaio de vazamento fluorescente para investigar desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células

Published: December 19, 2020 doi: 10.3791/62028
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1PHYMEDEXP, INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier

Summary

O ensaio de vazamento de fluorescência é um método simples que permite a investigação de interações peptídeo/membrana a fim de entender seu envolvimento em vários processos biológicos e, especialmente, a capacidade de peptídeos penetrantes de células para perturbar bicamadas de fósforo durante um processo de translocação celular direta.

Abstract

Os peptídeos de penetração celular (CPPs) são definidos como portadores capazes de atravessar a membrana plasmática e transferir uma carga para as células. Uma das principais características comuns necessárias para esta atividade resultou das interações de CPPs com a membrana plasmática (lipídios) e mais particularmente com componentes da matriz extracelular da própria membrana (sulfato heparan). De fato, independente da translocação direta ou da internalização dependente da endócita, bicamadas lipídicas estão envolvidas no processo de internalização tanto no nível da membrana plasmática quanto no nível de tráfego intracelular (vesículas endossomais). Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo as diferentes etapas de uma grande formulação de vesículas unilamellar (LUVs) formulação, purificação, caracterização e aplicação no ensaio de vazamento de fluorescência, a fim de detectar possível desestabilização/interação da membrana CPP e abordar seu papel no mecanismo de internalização. LUVs com uma composição lipídica refletindo o teor da membrana plasmática são gerados a fim de encapsular tanto um corante fluorescente quanto um saciador. A adição de peptídeos no meio extravesicular e a indução de interações peptídeo-membrana nos LUVs podem, assim, induzir de forma dependente de dose um aumento significativo da fluorescência revelando um vazamento. Exemplos são fornecidos aqui com o recém-desenvolvido triptofano (W)- e arginina (R)-rich Amphipathic Peptídeos (WRAPs), que mostraram uma entrega rápida e eficiente de siRNA em várias linhas celulares. Finalmente, discute-se a natureza dessas interações e a afinidade com os lipídios para entender e melhorar a translocação da membrana e/ou a fuga endossomal.

Introduction

Após sua descoberta nos anos noventa, peptídeos penetrantes por células (CPPs) foram desenvolvidos para promover uma entrega celular eficiente de cargas através da membrana plasmática1,2. CpPs são geralmente peptídeos curtos, geralmente de 8 a 30 aminoácidos, tendo uma grande variedade de origens. Eles foram definidos pela primeira vez como portadores de "translocação direta", o que significa que eles foram capazes de atravessar a membrana plasmática e transferir uma carga para células independentemente de qualquer via endocítica, nem exigência de energia nem envolvimento receptor. No entanto, investigações posteriores revelaram que essas primeiras observações vieram principalmente da superestimação da fluorescência devido ao artefato experimental e/ou aos protocolos de fixação usando metanol3. Atualmente, é amplamente aceito que a captação de CPP ocorra tanto pela endocitose quanto pela translocação independente de energia4,5,6,7 dependendo de diferentes parâmetros como a natureza da carga, o elo utilizado entre CPP e carga, a linha celular estudada, etc.

As CPPs podem ser utilizadas como agentes de transfecção de acordo com duas estratégias, envolvendo uma ligação química (estratégia covalente) ou interações eletrostáticas/hidrofóbicas (estratégia não covalente) entre o CPP e sua carga8,9,10,11. Embora ambas as estratégias tenham demonstrado sua eficiência na transferência celular de várias cargas, o entendimento do mecanismo de internalização pelas CPPs ainda está sob controvérsia e o equilíbrio entre vias de endocitose ou penetração direta ainda é difícil de medir12,13. Embora um conjunto de ferramentas e estratégias experimentais estejam disponíveis para abordar claramente o envolvimento de processos endocíticos, a translocação direta parece, no entanto, mais difícil de caracterizar, pois implica interações mais discretas com componentes da membrana plasmática. As membranas biológicas são geralmente compostas de inúmeros componentes, desde fosfolipídios até proteínas de membrana, que podem variar de acordo com o tipo celular e/ou o ambiente (condições de estresse, divisão celular, etc.). Essa diversidade de composição e, consequentemente, a ausência de um modelo universal de membrana celular não permite estudos de uma única forma. No entanto, para contornar essas limitações, foram desenvolvidas abordagens passo a passo com extratos artificiais de membrana ou membrana. Desde pequenas vesículas unilamellar até abordagens de monocamadas, cada modelo era claramente pertinente para responder a perguntas específicas14,15. Entre elas, as grandes vesículas unilamellar (LUVs) constituem um modelo de imitação de membrana adequada para estudar as interações peptídeo/membrana como um ponto-chave no processo de internalização.

Neste contexto, o protocolo a seguir descreve a investigação dos efeitos dos peptídeos e interações peptídeo/membrana na integridade luvs através do monitoramento de um corante fluorescente aniônico e seu correspondente quencher poli-cártalico encapsulado em lipossomos. Esta ferramenta é usada para estudar interações CPP/membrana, a fim de entender se elas são capazes de realizar uma translocação direta de membrana. Embora geralmente aplicado para comparar diferentes peptídeos que interagem por membrana, este ensaio de vazamento de fluorescência LUV também pode ser usado para investigar tanto conjugados CPPs-carga (estratégia covalente) quanto complexos de carga CPP (estratégia não covalente).

O presente protocolo será, portanto, exemplificado pela primeira vez com o triptofano recentemente desenvolvido (W)- e arginina (R)-rich Amphipathic Peptídeos (WRAP)16. O WRAP é capaz de formar nanopartículas baseadas em peptídeos para fornecer de forma rápida e eficiente RNA (siRNA) em várias linhas celulares16. As propriedades de vazamento de fluorescência apenas do peptídeo WRAP ou nanopartículas baseadas em WRAP carregadas de siRNA foram monitoradas para caracterizar seu mecanismo de internalização celular. Mostramos que seu mecanismo de internalização envolvia principalmente a translocação direta7. Em um segundo exemplo, o peptídeo WRAP foi covalentemente conjugado ao peptídeo de interfertídeo iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 e sua capacidade de desestabilizar membranas foi comparada em um ensaio de vazamento de fluorescência ao iCAL36 acoplado à Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), outra CPP.

Por fim, serão discutidas as vantagens e limitações do método tanto do ponto de vista tecnológico quanto no que diz respeito à relevância biológica.

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Protocol

1. Preparação de Grandes Vesículas Unilamellar (LUVs)

  1. Prepare luvs para seu uso como mímica de membrana celular para ensaio de vazamento de fluorescência.
  2. Misture com uma fosfardolina de vidro Hamilton (DOPC, 786,11 g/mol), sphingomyelin (SM, 760,22 g/mol) e Colesterol (Chol, 386,65 g/mol) na razão molar 4:4:2. A solução lipídica é obtida a partir de uma solução de estoque de cada lipídio solubilizado em um solvente de fundo redondo de metanol/clorofórmio (3/1; volume/volume) a 25 mg/mL em um frasco de vidro de 25 mL de fundo redondo. Com base em 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM e 2 μmol de Chol, a solução lipídica é obtida a partir da solução de estoque misturando 126 μL, 117 μL e 31 μL, respectivamente.
    ATENÇÃO: O metanol é um solvente tóxico e inflamável e o clorofórmio é tóxico e cancerígeno. Ambos devem ser tratados com a proteção adequada sob um capô.
  3. Evaporar metanol/clorofórmio usando um evaporador rotativo sob vácuo durante 45-60 min a 60 °C até a formação de um filme lipídudo seco.
  4. Prepare duas soluções de buffer HEPES de estoque. Prepare o buffer HEPES 1 misturando HEPES de 20 mM (238,3 g/mol) e 75 mM NaCl (58,44 g/mol) e ajuste o pH para 7,4. Prepare o buffer HEPES 2 misturando HEPES de 20 mM e 145 mM NaCl e ajuste o pH para 7,4. Os buffers HEPES podem ser armazenados a 4 °C durante 1 mês.
    NOTA: Recomenda-se verificar a osmolaridade dos buffers usando um osmômetro.
  5. Prepare a solução de hidratação lipídica dissolvendo o casal fluorescente fluorescente de corante-quencher, 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfônico ácido, sal dissudium a 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) e brometo p-xileno-bispiroriano a 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) na solução tampão HEPES. Misturar ANTS com DPX leva a uma solução de cor amarela. Para alcançar as concentrações de 12,5 mM de ANTS e 45 mM de DPX, dissolva 21,4 mgs e 76 mgs, respectivamente em 4 mL de tampão HEPES 1.
    NOTA: A solução de hidratação lipídica pode ser armazenada por 2 semanas a 4 °C, enrolando o tubo com papel alumínio.
  6. Reconstituir vesículas multilamellar (MLV) reutilizando o filme lipídigo seco com 1 mL da solução de hidratação lipídica e por vórtice até a dissolução do filme lipídado seco. Certifique-se de que a solução seja completamente solubilizada, pois pequenos agregados lipíduos afetarão negativamente as etapas anteriores. Além disso, verifique a parede do frasco de fundo redondo de vidro para garantir que não haja filme lipídedo restante.
    NOTA: A solução aparecerá opalescente e amarela clara após a solubilização.
  7. Sujeitar as vesículas a cinco ciclos de congelamento/degelo para obter vesículas unilamellar. Realize cada ciclo colocando o frasco de fundo redondo de vidro por 30 s em nitrogênio líquido para congelar passo, em seguida, deixando-o em um banho de água por 2 minutos para o passo de descongelamento.
    NOTA: A temperatura da água do banho deve ser 5-10°C maior do que a temperatura de fusão dos lipídios.
  8. Prepare a extrusora lipídica inserindo dois suportes de filtro umidificados preliminarmente com tampão HEPES em cada peça extrusora de politetrafluoroetileno (PTFE) colocada no recipiente de extrusor metálico.
  9. Coloque uma membrana de policarbonato umidificado HEPES (tamanho de poros de 0,1 μm, 25 mm de diâmetro) na parte superior de um suporte de filtro.
  10. Monte os dois recipientes de extrusora de metal e enrosque-os.
  11. Coloque a extrusora montada no suporte e introduza uma seringa de 1 mL no orifício apropriado na extremidade de cada peça extrusora de politetrafluoroetileno. A extrusão corresponde à passagem do líquido testado de uma seringa para outra através da membrana de policarbonato.
  12. Teste a extrusora com 1 mL de tampão HEPES carregado em uma das seringas de 1 mL para garantir que não haja vazamentos ou problemas.
  13. Substitua o tampão HEPES de 1 mL com a amostra MLV.
  14. Realize a extrusão passando a amostra de MLV de uma seringa para outra através da membrana de policarbonato pelo menos 21 vezes para obter LUVs uniformes do mesmo tamanho.
    NOTA: A extrusão deve ser realizada a uma temperatura superior à temperatura de fusão da mistura lipídica.

2. Purificação de LUVs

  1. Prepare uma purificação de coluna para remover o excesso de ANTS e DPX não encapsulados.
  2. Introduzir gel dextran transversal (G-50) resuspendido em meio aquoso com 0,01% NaN3 (65 g/mol) em uma coluna de cromatografia líquida (Luer Lock, Sem jaqueta, 1,0 cm x 20 cm, volume de cama 16 mL) até 1 cm abaixo do topo da parte incolor da coluna.
  3. Abra a torneira e deixe o líquido fluir para liquidar o gel dextran transversal.
  4. Lave a coluna eluvando com 20 mL de buffer HEPES 2 e descarte o fluxo de saída da coluna.
  5. Feche a torneira assim que o volume morto de solvente acima da coluna for minimizado (<100 μL), mas suficiente para evitar qualquer secagem do gel de dextran transversal.
  6. Coloque os LUVs recém-extrudados (amarelo) na coluna e deixe-os entrar no gel de dextran transversalmente ligado.
  7. Adicione continuamente o buffer HEPES 2 à coluna para realizar a purificação do LUV.
  8. Elute aproximadamente 2 mL de tampão HEPES 2 (não se esqueça de encher regularmente a parte superior da coluna para evitar secar o gel dextran cross-linked): a solução amarela gratuita ANTS e DPX migra mais lentamente do que os lipossomos.
  9. Comece a coletar LUVs purificados em tubos (1,5 mL).
  10. Observe as gotas de eluent da coluna e quando elas se tornam opalescentes, contêm lipossomos. Altere o tubo para recuperar a fração que contém LUV.
  11. Elute até que as gotas não sejam mais opalescentes (~1 mL). Depois, elute mais 0,5 mL em uma fração separada e, em seguida, parar de eluia.
    NOTA: As normas estão agora disponíveis em uma ampla gama de pesos moleculares, como kits ou pesos moleculares individuais para calibrar o volume de eluição dos LUVs.
  12. Enrole os tubos com os LUVs em papel alumínio para evitar branqueamento do corante de fluorescência.
  13. Lave a coluna com 20 mL hepes tampão 2.
  14. Os LUVs podem ser armazenados por uma semana a 4 °C.
    NOTA: Como a estabilidade do LUV pode depender da concentração e composição do LUV, bem como da força iônica, o tamanho dos LUVs deve ser controlado usando um instrumento de dispersão dinâmica de luz (DLS) (ver seção 4). Caracterização do tamanho e homogeneidade do LUV) antes de cada teste.

3. Quantificando a concentração de LUVs

  1. Estime a concentração de LUV por um kit de quantificação fosfolipídida, que permite a avaliação da concentração de colina19. Este ensaio pode ser aplicado quando fosfolipídios com colina contendo cabeça polar são substanciais (>50% dos LUVs).
  2. Prepare o reagente de cor dissolvendo 18 mg de substrato de cromogênio em 3 mL de tampão fornecido.
  3. Carregue um cuvette de poliestireno, 10 x 10 x 45 mm, com 3 mL de reagente colorido.
  4. Use o reagente de cor pura como condição em branco (Em branco). Adicione 20 μL de amostra DE LUV (Teste) ou 20 μL de solução padrão de concentração de colina conhecida (Padrão).
  5. Misture bem e incubar por 5 min a 37 °C todas as condições (Branco, Teste e Padrão).
  6. Meça a absorvância (densidade óptica, OD) da amostra de ensaio e a solução padrão com a solução em branco como o controle a 600 nm com um espectrofotômetro.
  7. Verifique os valores de OD que permitem estimar a concentração lipídica dos LUVs, C[LUV], em equivalente à colina em comparação com o padrão de concentração conhecida.
  8. Realize o cálculo usando a seguinte equação:
    C[LUV] (mol / l) = (OD Sample / OD Standard) x C[Standard] (mol / l)
    NOTA: O kit de quantificação fosfolipídida forneceu uma solução padrão de Cloreto de Colina (139,6 mg/l) a 54 mg/dL correspondente à concentração molar de C[Padrão] = 3,87 mmol/L. A amostra de OD e o Padrão OD são as absorvências medidas a 600 nm para as soluções LUV e Choline, respectivamente.

4. Caracterização do tamanho e homogeneidade do LUV

  1. Realize uma medição utilizando um instrumento DLS para determinar o tamanho do LUV (em nm) e o índice de polidispersidade (IDP).
  2. Programe o "procedimento de operação padrão" (SOP) apropriado, indicando a viscosidade do solvente/tampão e da cuvette usada.
  3. Coloque 500 μL da solução LUV em um cuvette semi-micro de poliestireno.
  4. Insira o póreno semi-micro cuvette em um instrumento DLS.
  5. À temperatura ambiente, meça a distribuição de tamanho em termos de tamanho médio (Z-média) da distribuição de partículas e de homogeneidade (índice de polidispersidade, IDP).
  6. Todos os resultados são obtidos a partir de duas medidas independentes realizadas cada uma em três ciclos repetitivos.
    NOTA: Os valores padrão para LUVs serão de 137 ± 7 nm com um ID ID de 0,149 ± 0,041.

5. Preparação de soluções de peptídeos

  1. Prepare uma solução de estoque do peptídeo, que deve ser analisada para o ensaio de vazamento.
  2. Dissolver o pó de peptídeo (>95% de pureza) em água pura (por exemplo, 1 mg de peptídeo em 500 μL de água pura).
    NOTA: Recomenda-se diluir peptídeos em água pura e evitar a solubilização de sulfóxido de dimetila (DMSO), que poderia induzir artefatos (por exemplo, permeabilização da membrana20).
  3. Vórtice a solução de peptídeo para 5 s.
  4. Sonicize a solução de peptídeo em um banho de sônica de água por 5 min e, em seguida, centrífuga por 5 min a 12.225 x g. Colete o supernatante para determinação de concentração.
  5. Meça a absorvência a 280 nm de três diluições de peptídeos independentes e, em seguida, calcule a concentração de peptídeo usando seu coeficiente de extinção molar ε (dependendo do conteúdo de triptofano e tyrosine na sequência de peptídeos) e regra beer-lambert.
    NOTA: Se o peptídeo contém triptofano e tyrosina, o coeficiente de extinção molar ε é computado com base em ε triptofano = 5.690 M-1cm-1 e Tyrosine ε = 1.280 M-1cm-1. Se a sequência de peptídeos não contiver triptofano ou tiranona, outro ensaio colorimétrico poderia ser realizado para medir a concentração (por exemplo, BCA ou Bradford).
  6. Diluir a solução de peptídeo em água pura para uma solução final de 100 μM e armazenar a 4 °C.
    NOTA: Em água pura, não ocorre degradação de peptídeo durante o armazenamento de 4 °C. No entanto, a concentração de peptídeos deve ser medida a cada 2 semanas para garantir que não ocorra evaporação da água.

6. Ensaio de vazamento de fluorescência

  1. O ensaio de vazamento de fluorescência é medido em um espectrofluorômetro à temperatura ambiente. Excitação e comprimento de onda de emissão são fixados em Ex = 360 nm ± 3 nm e Em = 530 nm ± 5 nm, respectivamente.
  2. Diluir LUVs em 1 mL hepes tampão 2 a uma concentração final de 100 μM em um cuvette fluorescência de quartzo. Adicione um agitador magnético para homogeneizar a solução durante o experimento.
  3. Meça os LUVs sozinhos durante os primeiros 100 s, entre t = 0 s e t = 99 s para acessar a fluorescência de fundo.
    NOTA: Apenas luvs também poderiam ser medidos durante todo o experimento (15 min) a fim de acessar fluorescência de fundo e possíveis vazamentos.
  4. A partir daí, meça o vazamento como um aumento da intensidade da fluorescência após a adição de alíquotas de solução de peptídeo para os próximos 900 s (15 min). Este protocolo é realizado para cada concentração de peptídeo testado de 0,1 μM a 2,5 μM.
  5. Finalmente, 100% de fluorescência foi alcançado solubilizando os LUVs pela adição de 1 μL de Triton X-100 (0,1%, v/v), resultando na sonda completamente inconchada entre t = 1.000 s e t = 1.100 s.

7. Quantificação do vazamento

  1. Suprimir valores obtidos após t = 1.090 s, a fim de manter o mesmo número de pontos para cada condição testada.
  2. Calcule a fluorescência mínima, Fmin,fazendo a média de 50 pontos entre t = 0 s e t = 49 s (SOMENTE LUVs).
  3. Calcule a fluorescência máxima, Fmax,fazendo a média de 50 pontos entre t = 1.041 s e t = 1.090 s (LUVs com Triton X-100).
  4. Calcule a porcentagem de vazamento (%Vazamento) em cada ponto de tempo (t = x), de acordo com a seguinte equação:
    %Vazamento(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100
  5. Calcule o desvio médio e padrão dos valores obtidos com diferentes preparações de LUV (n ≥ 2) para a mesma condição.
  6. Plote a porcentagem de vazamento, %Leak(t=x), em função do tempo (s).

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Representative Results

O princípio do ensaio de vazamento de fluorescência é mostrado na Figura 1. Em detalhes, grandes vesículas unilamellar (LUVs) encapsulando um corante fluorescente e um quencher (sem sinal de fluorescência) são tratados com a biomolécula de interesse. Devido à interação do peptídeo com membranas lipídicas, o que pode implicar permeabilidade da membrana, reorganização ou até mesmo ruptura, o corante de fluorescência e o saciador são liberados dos LUVs. Diluições subsequentes no buffer resultam em um sinal de fluorescência aumentada.

Embora este esquema exiba um teste com peptídeos livres, a vantagem do sistema está na capacidade de testar também peptídeos conjugados por carga, nanopartículas à base de peptídeos ou outros biopolímeros, que são suspeitos de desestabilizar membranas lipídicas. Embora seja necessária uma otimização preliminar do protocolo especialmente no que diz respeito às moléculas testadas, este ensaio de vazamento de fluorescência pode ser estendido a uma enorme variedade de componentes que interagem com membranas. No presente protocolo, mostramos alguns resultados obtidos com as CPPs e suas formas complexas (não covalentes) ou conjugadas (estratégia covalente). Os exemplos a seguir implicam apenas o WRAP, bem como nanopartículas baseadas em WRAP carregadas de siRNA e dois conjugados de peptídeos diferentes (WRAP-iCAL3617 e Penetratin-iCAL36).

No que diz respeito à estratégia não covalente, o ensaio de vazamento de fluorescência com peptídeos e com suas respectivas nanopartículas carregadas de siRNA na presença de LUVs são exibidos na Figura 2. As vesículas são compostas por uma mistura de DOPC/SM/Chol (4:4:2) refletindo a membrana plasmática como descrito em Konate et al.21 e geralmente são usadas para avaliar diretamente a possibilidade de interação lipídica bicamada e/ou propriedades de transdução de nanopartículas livres envolta e WRAP7. Na ausência de peptídeos, não é observado vazamento (linha de base durante os primeiros 100 s). A adição de WRAP gratuito nos LUVs induz um aumento significativo da fluorescência revelando um importante vazamento de LUV e liberação de ANTS. Após 15 min, um vazamento de 67,8% ± 0,4% em relação à condição triton (controle positivo) é obtido na concentração utilizada (2,5 μM) de peptídeo WRAP. Deve-se notar aqui que várias concentrações diferentes também foram testadas e revelaram um aumento de fluorescência dependente de dose, correspondendo a um vazamento de LUV dependente de dose7. Em contraste, quando o WRAP é montado na mesma concentração com siRNA para formar nanopartículas à base de peptídeos, o vazamento é 1,5 vezes mais fraco (40,5% ± 0,5%) em comparação com o peptídeo livre(Figura 2). Valores de vazamento semelhantes foram relatados para o peptídeo RICK (60%) ou para as nanopartículas RICK:siRNA (28%)22. A diferença de valores entre peptídeos livres em comparação com nanopartículas pode ser explicada pelo fato de que, quando envolvido nas nanopartículas, uma parte substancial do peptídeo está envolvida em interações diretas com o siRNA, reduzindo a disponibilidade de peptídeos para interações com lipídios.

Quanto à estratégia covalente, os ensaios de vazamento de fluorescência com CPP-conjugados na presença de LUVs são mostrados na Figura 3. Com a mesma composição LUV [DOPC/SM/Chol (4:4:2)], são aplicados dois peptídeos conjugados: WRAP-iCAL36 e Penetratin-iCAL36. Como observado anteriormente, nenhum vazamento é observado na ausência de peptídeos. 15 min após a injeção de 2,5 μM de Penetratin-iCAL36, não é detectado aumento significativo da fluorescência (2,3% ± 0,7%), enquanto uma adição de 2,5 μM de WRAP-iCAL36 induz um vazamento líquido caracterizado por sinal de fluorescência muito forte (85,8% ± 11,1%)17. Estas observações indicam que para alguns peptídeos, ou conjugados, nenhum vazamento de fluorescência pode ocorrer, sugerindo nenhuma interação peptídeo/membrana ou nenhum distúrbio lipídico bicamado. Isso está de acordo com os resultados publicados anteriormente mostrando que a Penetratin, assim como Tat, não foram capazes de desestabilizar as membranas23,24,25. Deve-se ressaltar que as propriedades de desestabilização da membrana de um CPP podem mudar dependendo da carga acoplada26.

Além disso, embora o WRAP-iCAL36 tenha causado um forte vazamento, estudos adicionais não revelam internalização celular específica, indicando que esses conjugados permaneceram dentro da bicamada lipídica da membrana plasmática17. Em contraste com a nanopartícula WRAP, supomos que o conjugado WRAP-cargo é capaz de desestabilizar a membrana LUV, furando entre as cadeias lipídicas ou formando poros.

Esses resultados indicam que o ensaio de vazamento de fluorescência pode revelar a capacidade de alguns CPPs de desenvolver interações peptídeo/membrana, o que poderia levar a uma permeabilidade de membrana mais ou menos pronunciada. Além disso, essas interações podem ocorrer independentemente da estratégia de entrega de cargas (nanopartículas versus conjugados). Por outro lado, este método não discrimina se um CPP, que não induz qualquer vazamento de fluorescência, ainda pode interagir com a bicamada ou membrana biológica dos lipídios. Esse tipo de comportamento requer abordagens adicionais, como medidas com potencial de zeta, TRAS entre peptídeo e membrana, ou experimentos de fluorescência de triptofano para mencionar apenas alguns exemplos.

Figure 1
Figura 1: Princípio do ensaio de vazamento defluorescência. Os LUVs foram carregados com um corante fluorescente (ANTS) em branco e seu correspondente quencher (DPX) em cinza. Na ausência de peptídeos (em vermelho), nenhum sinal de fluorescência foi observado porque a fluorescência ants foi saciada pela DPX. A adição de peptídeos nos LUVs induziram a permeabilidade da membrana e a posterior liberação de ANTS e DPX resultando em um aumento significativo da fluorescência ants (amarelo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Ensaio de vazamento de fluorescência com nanopartículas DEVC e WRAP:siRNA grátis. Apenas as nanopartículas carregadas de peptídeo e as nanopartículas carregadas de siRNA foram aplicadas em LUVs na concentração de peptídeos de 2,5 μM. As nanopartículas baseadas em WRAP foram formuladas a uma razão molar peptídeo:siRNA molar de 20 (R 20) conforme descrito em Konate et al.7,16. As setas negras mostram injeções de peptídeo (nanopartícula) e Tritão X-100, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Ensaio de vazamento de fluorescência com conjugados WRAP-iCAL36 e Penetratin-iCAL36. Conjugados foram aplicados em LUVs na concentração de 2,5 μM. Setas negras mostram injeções de peptídeo e Triton X-100, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O ensaio de vazamento de fluorescência apresentado é um método simples e rápido para lidar com a desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células. Fácil de fazer, também permite uma comparação indireta entre diferentes peptídeos que interagem por membrana ou outras moléculas que interagem por membrana. Quanto às etapas críticas do protocolo, uma vez que este ensaio fornece valores relativos entre a linha de base (SOMENTE LUVs) e a liberação de fluorescência máxima (condição triton), geralmente avaliamos a concentração de LUVs utilizando o kit de quantificação fosfolipídid, que apenas estima a contribuição de colina dos LUVs. No entanto, também é possível incluir uma medição mais precisa da concentração de LUV, determinando o teor total de fósforo por digestão ácida, conforme descrito por Rouser e colegas27 ou por Bartlett28 ou por método colorimétrico usando ferrothiocyanato de ferrothiocyanate de amônio complexo fosfolipídios29. Em nossas mãos, não tem impacto na quantificação relativa do vazamento e na comparação entre peptídeos que interagem com membranas.

Em relação ao uso de LUVs, deve-se notar também a importância de controlar o estado da linha de base do LUV apenas para verificar se eles são utilizáveis e se já estão apresentando vazamentos (caracterizados por um aumento contínuo da fluorescência). Da mesma forma, é importante medir a liberação máxima de fluorescência após cada incubação de peptídeos para garantir que nenhum resultado falso-negativo tenha sido registrado devido a um processo de sacieciação indesejado (por exemplo, peptídeo/saciamento de corante).

Em geral, de acordo com a caracterização do DLS, os LUVs são bastante estáveis por 1 semana e não devem apresentar um fundo de fluorescência muito alto. Nesse contexto, a purificação de lipossomos carregados ants/DPX por filtragem de gel também é um ponto-chave, uma vez que permitir a formação de LUVs sem ter fluorescência residual que possa contribuir para o fundo ou produzir superestimação de fluorescência. Além disso, é fortemente recomendado calibrar o protocolo, incluindo um controle positivo específico que pode sempre dar a mesma porcentagem de vazamento. Isso constitui um controle interno através das diferentes medidas, o que pode reforçar a caracterização dos LUVs para cada teste e aumentar as estatísticas.

Embora o ensaio de vazamento de fluorescência possa fornecer uma rápida comparação na desestabilização da membrana por CPPs, no entanto é limitado na interpretação das interações peptídeo-membrana, uma vez que alguns peptídeos são capazes de interagir com bicamadas lipídicas sem induzir qualquer perturbação ou vazamento de membrana. Para estes peptídeos, é altamente recomendável usar experimentos adicionais com marcadores específicos de fluorescência que permitam o FRET30.

Deve-se notar também que outros pares de corante/quencher fluorescência (por exemplo, Tb3+/DPA31) poderiam ser usados. Ambos os métodos têm seus inconvenientes: Terbium (III) não é muito solúvel em água e não pode ser usado na presença de fosfato, enquanto o saciamento de ANTS não é uma função linear da concentração de DPX. Além disso, outros materiais auto-extintores, como a soluçãocalcein 32 ou o dextran-PTS33, poderiam ser manuseados dependendo dos defeitos de membrana provocados pelo peptídeo ou composto analisado.

Finalmente, a principal vantagem deste ensaio de vazamento de fluorescência é a capacidade de testar uma infinidade de moléculas potenciais de interação de membrana, bem como diferentes composições de membrana, como imitações de membrana endossomal [por exemplo, dioleoylphosphatidylcholine (DOPC)/dioleoyl-fospha-tidylethanolamine (DOPE)/fosphatidylinositol de soja (PI)/bis (monooleoylglicecero) fosfato (LBPA) a uma razão molar de 5:2:1:2]34 , a membrana mitocondrial imita [por exemplo, 46,5% DOPC, 28,5% fosfattidylethanolamina (PE), 9% fosfaticicylinositol (PI), 9% fosfatidylserina (PS) e 7% cardiolipina (CL)35 ou qualquer outra composição lipídica lipídica desejada. No entanto, primeiro será preciso garantir a estabilidade das vesículas (sem fusão, agregação ou precipitação do LUV, sem queda lipídica da suspensão, sem curvatura de membrana negativa, etc.) tendo um tamanho médio constante perto de 100 nm durante o experimento e armazenamento.

Além disso, a vantagem deste método em relação às membranas extraídas (glóbulos vermelhos, mitocôndrias, etc.) é o uso de lipídios bem caracterizados na ausência de proteínas. O controle da composição lipídica de bicamadas (plasma, endossomal ou membrana mitocondrial) também permite a inserção de proteínas de membrana específicas (bomba de prótons). Além disso, a capacidade de controlar ambientes internos e externos dos LUVs permite uma interpretação clara da perturbação/vazamento da membrana. Comparado aos experimentos de membrana lipídica-negra36,que também podem visualizar eventos de permeabilização da membrana, este protocolo de vazamento fornece um método de triagem mais simples de peptídeos ativos em membrana.

Em conclusão, este método simples favorece uma identificação rápida de interações fortes de peptídeo/membrana que levam à desestabilização da membrana. Pode ser aplicado para investigar o mecanismo de internalização das CPPs e em uma abordagem mais geral de "peptídeos ativos em membrana", como peptídeos fusiogênicos ou antimicrobianos.

Em geral, a caracterização da principal rota utilizada pelos CPPs para chegar ao citoplasma é muito complexa e requer várias abordagens distintas, da biofísica à biologia celular. Por exemplo, a investigação da internalização do WRAP revelou um equilíbrio entre diferentes mecanismos de entrada nas células (endocitose versus translocação direta) e o ensaio de vazamento de fluorescência, associado a outros métodos, contribuiu para apoiar um processo de penetração direta7.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Emilie Josse pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela fundação "La Ligue contre le Cancer", a "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer", e o "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mL glass round-bottom flask Pyrex
8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) Invitrogen A350 Protect from light 
Chloroform  Sigma-Aldrich 288306
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) Avanti Polar 850375P Protect from air
Extruder Avanti Polar 610000
Fluorimeter PTI Serlabo
50 µL glass syringe Hamilton 705N
HEPES Sigma-Aldrich H3375
LabAssay Phospholipid  WAKO  296-63801
liquid chromatography column Sigma-Aldrich
Methanol Carlo Erba 414902
Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) Whatman 800309
polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm Grener Bio-One 614101
polystyrene semi-micro cuvette, DLS Fisher Scientific FB55924
p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) Invitrogen X1525 Protect from light 
quartz fluorescence cuvette Hellma 109.004F-QS
rotavapor system  Heidolph Z334898
Sephadex G-50 resin Amersham 17-0042-01
Sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich S2002
Sodium chlorid (NaCl) Sigma-Aldrich S5886
Sonicator bath USC300T VWR 142-6001
Sphingomyelin Avanti Polar 860062P Protect from air
Triton X-100  Eromedex 2000-B
Zetaziser NanoZS  Malvern ZEN3500

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