Summary
Le test de fuite de fluorescence est une méthode simple qui permet d’enquêter sur les interactions peptide/membrane afin de comprendre leur implication dans plusieurs processus biologiques et en particulier la capacité des peptides pénétrants dans les cellules à perturber les bicouches de phospholipides lors d’un processus de translocation cellulaire directe.
Abstract
Les peptides pénétrant dans les cellules (CPP) sont définis comme des transporteurs capables de traverser la membrane plasmique et de transférer une cargaison dans les cellules. L’une des principales caractéristiques communes requises pour cette activité résultait des interactions des CPP avec la membrane plasmique (lipides) et plus particulièrement avec les composants de la matrice extracellulaire de la membrane elle-même (sulfate d’héparane). En effet, indépendamment de la translocation directe ou de l’internalisation dépendante de l’endocytose, les bicouches lipidiques sont impliquées dans le processus d’internalisation tant au niveau de la membrane plasmique qu’au niveau du trafic intracellulaire (vésicules endosomales). Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé décrivant les différentes étapes de la formulation, de la purification, de la caractérisation et de l’application d’une grande vésicule unilamellaire (LV) dans le test de fuite de fluorescence afin de détecter une éventuelle déstabilisation/interaction CPP-membrane et d’aborder leur rôle dans le mécanisme d’internalisation. Des LV avec une composition lipidique reflétant la teneur en membrane plasmique sont générés afin d’encapsuler à la fois un colorant fluorescent et un quencher. L’ajout de peptides dans le milieu extravésiculaire et l’induction d’interactions peptide-membrane sur les LV pourraient ainsi induire de manière dose-dépendante une augmentation significative de la fluorescence révélant une fuite. Des exemples sont fournis ici avec les peptides amphipathiques (W) riches en tryptophane (W) et en arginine (R) récemment développés, qui ont montré une administration rapide et efficace de siRNA dans diverses lignées cellulaires. Enfin, la nature de ces interactions et l’affinité pour les lipides sont discutées pour comprendre et améliorer la translocation membranaire et/ou l’échappement endosomal.
Introduction
Après leur découverte dans les années quatre-vingt-dix, des peptides pénétrant dans les cellules (CPP) ont été développés pour favoriser une livraison cellulaire efficace des cargaisons à travers la membraneplasmique 1,2. Les CPP sont généralement des peptides courts, généralement de 8 à 30 acides aminés, ayant une grande variété d’origines. Ils ont d’abord été définis comme des porteurs « à translocation directe », ce qui signifie qu’ils étaient capables de traverser la membrane plasmique et de transférer une cargaison dans les cellules indépendamment de toute voie endocytotique, ni besoin en énergie ni implication des récepteurs. Cependant, d’autres investigations ont révélé que ces premières observations provenaient principalement d’une surestimation de la fluorescence due à l’artefact expérimental et/ou à des protocoles de fixation utilisant du méthanol3. De nos jours, il est largement admis que l’absorption du RPC se fait à la fois par endocytose et par translocation indépendante de l’énergie4,5,6,7 en fonction de différents paramètres tels que la nature de la cargaison, le lien utilisé entre le CPP et la cargaison, la lignée cellulaire étudiée, etc.
Les CPP peuvent être utilisés comme agents de transfection selon deux stratégies, impliquant soit un lien chimique (stratégie covalente), soit des interactions électrostatiques/hydrophobes (stratégie non covalente) entre le CPP et sa cargaison8,9,10,11. Bien que les deux stratégies aient montré leur efficacité dans le transfert cellulaire de plusieurs cargaisons, la compréhension du mécanisme d’internalisation par les CPP est encore controversée et l’équilibre entre les voies d’endocytose ou la pénétration directe est encore difficile à mesurer12,13. Bien qu’un ensemble d’outils et de stratégies expérimentaux soient disponibles pour aborder clairement l’implication des processus endocytaires, la translocation directe semble toutefois plus difficile à caractériser car elle implique des interactions plus discrètes avec les composants de la membrane plasmique. Les membranes biologiques sont généralement composées de nombreux composants, des phospholipides aux protéines membranaires, qui peuvent varier selon le type cellulaire et/ou l’environnement (conditions de stress, division cellulaire, etc.). Cette diversité de composition, et par conséquent l’absence d’un modèle universel de membrane cellulaire ne permet pas des études d’une seule manière. Cependant, pour contourner ces limitations, des approches étape par étape ont été développées avec des membranes artificielles ou des extraits de membrane. Des petites vésicules unilamellaires aux approches monocouches, chaque modèle était clairement pertinent pour répondre à des questions spécifiques14,15. Parmi eux, les grandes vésicules unilamellaires (LV) constituent un modèle membranaire approprié pour étudier les interactions peptide/membrane comme étant un point clé du processus d’internalisation.
Dans ce contexte, le protocole suivant décrit l’étude des effets des peptides et des interactions peptide/membrane sur l’intégrité des LV grâce à la surveillance d’un colorant fluorescent anionique et de son quencher poly-cationique correspondant encapsulé dans des liposomes. Cet outil est utilisé pour étudier les interactions CPP/membrane afin de comprendre s’ils sont capables d’effectuer une translocation membranaire directe. Bien qu’il soit généralement appliqué pour comparer différents peptides interagissant avec la membrane, ce test de fuite de fluorescence LUV pourrait également être utilisé pour étudier à la fois les conjugués CPP-cargo (stratégie covalente) et les complexes CPP:cargo (stratégie non covalente).
Le présent protocole sera donc d’abord illustré avec les peptides amphipathiques riches en tryptophane (W) et en arginine (R) récemment développés16. WRAP est capable de former des nanoparticules à base de peptides pour délivrer rapidement et efficacement de petits ARN interférents (siRNA) dans plusieurs lignées cellulaires16. Les propriétés de fuite de fluorescence du peptide WRAP seul ou des nanoparticules à base de WRAP chargées de siRNA ont été surveillées pour caractériser leur mécanisme d’internalisation cellulaire. Nous avons montré que leur mécanisme d’internalisation impliquait principalement une translocation directe7. Dans un deuxième exemple, le peptide WRAP a été conjugué de manière covalente au peptide interférent protéine/protéine iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 et sa capacité à déstabiliser les membranes a été comparée dans un test de fuite de fluorescence à iCAL36 couplé à Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), un autre CPP.
Enfin, les avantages et les limites de la méthode seront discutés à la fois d’un point de vue technologique et en ce qui concerne la pertinence biologique.
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Protocol
1. Préparation de grandes vésicules unilamellaires (LV)
- Préparez les LV pour leur utilisation comme imitations de membrane cellulaire pour le test de fuite de fluorescence.
- Mélanger avec une seringue en verre Hamilton phosphatidylcholine (DOPC, 786,11 g/mol), sphingomyéline (SM, 760,22 g/mol) et cholestérol (Chol, 386,65 g/mol) au rapport molaire 4:4:2. La solution lipidique est obtenue à partir d’une solution type de chaque lipide solubilisé dans un solvant méthanol/chloroforme (3/1; volume/volume) à 25 mg/mL dans une fiole à fond rond en verre de 25 mL. Sur la base de 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM et 2 μmol de Chol, la solution lipidique est obtenue à partir d’une solution stock en mélangeant respectivement 126 μL, 117 μL et 31 μL.
ATTENTION : Le méthanol est un solvant toxique et inflammable et le chloroforme est toxique et cancérigène. Les deux doivent être manipulés avec la protection appropriée sous une hotte. - Évaporer le méthanol/chloroforme à l’aide d’un évaporateur rotatif sous vide pendant 45 à 60 min à 60 °C jusqu’à la formation d’un film lipidique séché.
- Préparez deux solutions tampons HEPES en stock. Préparer le tampon HEPES 1 en mélangeant 20 mM hePES (238,3 g/mol) et 75 mM de NaCl (58,44 g/mol) et ajuster le pH à 7,4. Préparer le tampon HEPES 2 en mélangeant 20 mM HEPES et 145 mM naCl et ajuster le pH à 7,4. Les tampons HEPES peuvent être conservés à 4 °C pendant 1 mois.
REMARQUE: Il est recommandé de vérifier l’osmolarité des tampons à l’aide d’un osmomètre. - Préparer la solution d’hydratation lipidique en dissolvant le couple colorant-quencher fluorescent imperméable à membrane, l’acide 8-aminonaphtalène-1, 3, 6-trisulfonique, le sel disodique à 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) et le bromure de p-xylène-bispyridinium à 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) dans une solution tampon HEPES. Le mélange d’ANTS avec DPX conduit à une solution de couleur jaune. Pour atteindre les concentrations de 12,5 mM d’ANTS et de 45 mM de DPX, dissoudre respectivement 21,4 mg et 76 mg dans 4 mL de tampon HEPES 1.
REMARQUE: La solution d’hydratation lipidique peut être conservée pendant 2 semaines à 4 ° C en enveloppant le tube avec du papier d’aluminium. - Reconstituer les vésicules multilamellaires (MLV) en resusmettant le film lipidique séché avec 1 mL de la solution d’hydratation lipidique et en vortexant jusqu’à dissolution du film lipidique séché. Assurez-vous que la solution est complètement solubilisée car de petits agrégats lipidiques auront un impact négatif sur les étapes précédentes. Vérifiez également la paroi de la fiole à fond rond en verre pour vous assurer qu’il ne reste pas de film lipidique.
REMARQUE: La solution apparaîtra opalescente et jaune clair après la solubilisation. - Soumettre les vésicules à cinq cycles de congélation/dégel pour obtenir des vésicules unilamellaires. Effectuez chaque cycle en mettant la fiole à fond rond en verre pendant 30 s dans de l’azote liquide pour l’étape de congélation, puis en la laissant au bain-marie pendant 2 min pour l’étape de décongélation.
REMARQUE: La température de l’eau du bain doit être supérieure de 5 à 10 ° C à la température de fusion des lipides. - Préparez l’extrudeuse lipidique en insérant deux supports filtrants préliminaires humidifiés avec un tampon HEPES dans chaque pièce d’extrudeuse en polytétrafluoroéthylène (PTFE) placée dans la cartouche de l’extrudeuse métallique.
- Placez une membrane en polycarbonate humidifié HEPES (taille des pores de 0,1 μm, diamètre de 25 mm) sur le dessus d’un support de filtre.
- Assemblez les deux bidons d’extrudeuse métallique et vissez-les.
- Placez l’extrudeuse assemblée dans le support et introduisez une seringue de 1 mL dans le trou approprié à l’extrémité de chaque pièce d’extrudeuse en polytétrafluoroéthylène. L’extrusion correspond au passage du liquide testé d’une seringue à l’autre à travers la membrane en polycarbonate.
- Testez l’extrudeuse avec 1 mL de tampon HEPES chargé dans l’une des seringues de 1 mL pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuites ou de problèmes.
- Remplacez le tampon HEPES de 1 mL par l’échantillon MLV.
- Effectuer l’extrusion en faisant passer l’échantillon de MLV d’une seringue à l’autre à travers la membrane en polycarbonate au moins 21 fois pour obtenir des LV uniformes de même taille.
REMARQUE: L’extrusion doit être effectuée à une température supérieure à la température de fusion du mélange lipidique.
2. Purification des LV
- Préparez une purification de colonne pour éliminer l’excès d’ANTS et de DPX non encapsulés.
- Introduire le gel de dextran réticulé (G-50) mis enssais en milieu aqueux avec 0,01 % de NaN3 (65 g/mol) dans une colonne de chromatographie liquide (Luer Lock, non gainé, 1,0 cm x 20 cm, volume du lit 16 mL) jusqu’à 1 cm sous le haut de la partie incolore de la colonne.
- Ouvrez le robinet et laissez le liquide s’écouler pour déposer le gel de dextran réticulé.
- Lavez la colonne en éluant avec 20 mL de tampon HEPES 2 et éliminez le débit de sortie de la colonne.
- Fermez le robinet une fois que le volume mort de solvant au-dessus de la colonne est minimisé (<100 μL) mais suffisant pour éviter tout séchage du gel de dextran réticulé.
- Placez les LLU fraîchement extrudés (jaunes) sur la colonne et laissez-les entrer dans le gel de dextran réticulé.
- Ajoutez continuellement le tampon HEPES 2 à la colonne pour effectuer la purification LUV.
- Éluez environ 2 mL de tampon HEPES 2 (n’oubliez pas de remplir régulièrement le haut de la colonne pour éviter de sécher le gel de dextran réticulé) : la solution jaune libre d’ANTS et de DPX migre plus lentement que les liposomes.
- Commencez à collecter les LV purifiés dans des tubes (1,5 mL).
- Observez les gouttes d’éluant de la colonne et lorsqu’elles deviennent opalescentes, elles contiennent des liposomes. Changez le tube pour récupérer la fraction contenant du LUV.
- Éluez jusqu’à ce que les gouttes ne soient plus opalescentes (~1 mL). Ensuite, éluez encore 0,5 mL dans une fraction séparée, puis arrêtez d’éluer.
REMARQUE: Les étalons sont maintenant disponibles dans une large gamme de poids moléculaires, sous forme de kits ou de poids moléculaires individuels pour calibrer le volume d’élution des LV. - Enveloppez les tubes avec les LUN dans du papier d’aluminium pour éviter le blanchiment du colorant de fluorescence.
- Lavez la colonne avec un tampon HEPES de 20 mL 2.
- Les LV peuvent ensuite être conservés pendant une semaine à 4 °C.
REMARQUE: Comme la stabilité du LUV peut dépendre de la concentration et de la composition du LUV, ainsi que de la force ionique, la taille des LUV doit être contrôlée à l’aide d’un instrument de diffusion dynamique de la lumière (DLS) (voir rubrique 4. Caractérisation de la taille et de l’homogénéité des LUV) avant chaque essai.
3. Quantifier la concentration de LV
- Estimer la concentration de LUV à l’au moyen d’un kit de quantification des phospholipides, ce qui permet d’évaluer la concentration de choline19. Ce test peut être appliqué lorsque les phospholipides contenant de la choline contiennent de la tête polaire sont substantiels (>50% des LV).
- Préparer le réactif colorant en dissolvant 18 mg de substrat chromogène dans 3 mL de tampon fourni.
- Chargez une cuvette en polystyrène, 10 x 10 x 45 mm, avec 3 mL de réactif de couleur.
- Utilisez le réactif de couleur pure comme condition vide (blank). Ajouter 20 μL d’échantillon de LUV (essai) ou 20 μL de solution étalon de concentration connue de choline (étalon).
- Bien mélanger et incuber pendant 5 min à 37 °C dans toutes les conditions (Blank, Test et Standard).
- Mesurer l’absorbance (densité optique, OD) de l’échantillon d’essai et de la solution étalon avec la solution vierge comme témoin à 600 nm avec un spectrophotomètre.
- Vérifiez les valeurs OD qui permettent d’estimer la concentration lipidique des LV, C[LUV], en équivalent choline par rapport à la norme de concentration connue.
- Effectuez le calcul à l’aide de l’équation suivante :
C[LUV] (mol / l) = (OD Sample / OD Standard) x C[Standard] (mol / l)
REMARQUE: Le kit de quantification des phospholipides a fourni une solution étalon de chlorure de choline (139,6 mg / l) à 54 mg / dL correspondant à la concentration molaire de C [Standard] = 3,87 mmol / L. OD Sample et OD Standard sont les absorbances mesurées à 600 nm pour les solutions LUV et Choline, respectivement.
4. Caractérisation de la taille et de l’homogénéité des LUV
- Effectuez une mesure à l’aide d’un instrument DLS afin de déterminer la taille du LUV (en nm) et l’indice de polydispersité (PdI).
- Programmer la « procédure de fonctionnement standard » (SOP) appropriée en indiquant la viscosité du solvant/tampon et de la cuvette utilisée.
- Placer 500 μL de la solution de LUV dans une cuvette semi-micro en polystyrène.
- Insérez la cuvette semi-micro en polystyrène dans un instrument DLS.
- À température ambiante, mesurer la distribution granulométrique en termes de taille moyenne (moyenne Z) de la distribution des particules et d’homogénéité (indice de polydispersité, PdI).
- Tous les résultats sont obtenus à partir de deux mesures indépendantes effectuées chacune en trois cycles répétitifs.
REMARQUE: Les valeurs standard pour les LGV seront d’une taille moyenne de 137 ± 7 nm avec un PdI de 0,149 ± 0,041.
5. Préparation de solutions peptidiques
- Préparez une solution stock du peptide, qui doit être analysée pour le test de fuite.
- Dissoudre la poudre peptidique (pureté >95 %) dans de l’eau pure (p. ex., 1 mg de peptide dans de l’eau pure de 500 μL).
REMARQUE: Il est recommandé de diluer les peptides dans de l’eau pure et d’éviter la solubilisation au diméthylsulfoxyde (DMSO), qui pourrait induire des artefacts (par exemple, la perméabilisation membranaire20). - Vortex la solution peptidique pendant 5 s.
- Sonicate la solution peptidique dans un bain de sonication à l’eau pendant 5 min puis centrifuger pendant 5 min à 12 225 x g. Recueillir le surnageant pour la détermination de la concentration.
- Mesurez l’absorbance à 280 nm de trois dilutions peptidiques indépendantes, puis calculez la concentration peptidique en utilisant son coefficient d’extinction molaire ε (en fonction de la teneur en tryptophane et en tyrosine dans la séquence peptidique) et la règle de Beer-Lambert.
REMARQUE: Si le peptide contient du tryptophane et de la tyrosine, le coefficient d’extinction molaire ε est calculé sur la base de tryptophane ε = 5 690 M-1cm-1 et Tyrosine ε = 1 280 M-1cm-1. Si la séquence peptidique ne contient pas de tryptophane ou de tyrosine, un autre test colorimétrique pourrait être effectué pour mesurer la concentration (par exemple, BCA ou Bradford). - Diluer la solution peptidique dans de l’eau pure jusqu’à une solution finale de 100 μM et conserver à 4 °C.
REMARQUE: Dans l’eau pure, aucune dégradation peptidique ne se produit pendant le stockage à 4 °C. Cependant, la concentration en peptides doit être mesurée toutes les 2 semaines pour s’assurer qu’aucune évaporation de l’eau ne se produit.
6. Essai de fuite de fluorescence
- Le test de fuite de fluorescence est mesuré sur un spectrofluoromètre à température ambiante. La longueur d’onde d’excitation et d’émission est fixée à Ex = 360 nm ± 3 nm et Em = 530 nm ± 5 nm, respectivement.
- Diluer les LV dans un tampon HEPES 2 de 1 mL jusqu’à une concentration finale de 100 μM dans une cuvette à fluorescence de quartz. Ajouter un agitateur magnétique pour homogénéiser la solution pendant l’expérience.
- Mesurez les LV seuls pendant les 100 premières s, entre t = 0 s et t = 99 s afin d’accéder à la fluorescence de fond.
REMARQUE: Les LV seuls ont également pu être mesurés pendant toute l’expérience (15 min) afin d’accéder à la fluorescence de fond et aux fuites potentielles. - Par la suite, mesurez la fuite comme une augmentation de l’intensité de fluorescence lors de l’ajout d’aliquotes de solution peptidique pendant les 900 prochaines s (15 min). Ce protocole est réalisé pour chaque concentration de peptide testée de 0,1 μM à 2,5 μM.
- Enfin, une fluorescence de 100 % a été obtenue en solubilisant les LV par addition de 1 μL de Triton X-100 (0,1 %, v/v), ce qui a donné la sonde complètement non inextinguée entre t = 1 000 s et t = 1 100 s.
7. Quantification de la fuite
- Supprimer les valeurs obtenues après t = 1 090 s afin de conserver le même nombre de points pour chaque condition testée.
- Calculer la fluorescence minimale, Fmin, en faisant la moyenne de 50 points entre t = 0 s et t = 49 s (LGV seuls).
- Calculer la fluorescence maximale, Fmax, en faisant la moyenne de 50 points entre t = 1 041 s et t = 1 090 s (LV avec Triton X-100).
- Calculez le pourcentage de fuite (%Fuite) à chaque point temporel (t = x), selon l’équation suivante :
%Fuite(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100 - Calculer la moyenne et l’écart-type pour les valeurs obtenues avec différentes préparations LUV (n ≥ 2) pour la même condition.
- Tracez le pourcentage de fuite, %Fuite(t=x),en fonction du ou des temps(s).
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Representative Results
Le principe du test de fuite de fluorescence est illustré à la figure 1. Dans le détail, de grandes vésicules unilamellaires (LV) encapsulant un colorant fluorescent et un quencher (pas de signal de fluorescence) sont traitées avec la biomolécule d’intérêt. En raison de l’interaction du peptide avec les membranes lipidiques, ce qui pourrait impliquer la perméabilité de la membrane, la réorganisation ou même la rupture, le colorant de fluorescence et le quencher sont libérés des LV. Les dilutions ultérieures dans le tampon entraînent une augmentation du signal de fluorescence.
Bien que ce schéma affiche un test avec des peptides libres, l’avantage du système réside dans la possibilité de tester également des peptides conjugués à la cargaison, des nanoparticules à base de peptides ou d’autres biopolymères, qui sont soupçonnés de déstabiliser les membranes lipidiques. Bien qu’une optimisation préliminaire du protocole, en particulier en ce qui concerne les molécules testées, soit nécessaire, ce test de fuite de fluorescence pourrait être étendu à une grande variété de composants interagissant avec la membrane. Dans le présent protocole, nous montrons quelques résultats obtenus avec les CPP et leurs formes complexes (stratégie non covalente) ou conjuguées (stratégie covalente). Les exemples suivants impliquent WRAP seul ainsi que des nanoparticules à base de WRAP chargées en siRNA et deux conjugués peptidiques différents (WRAP-iCAL3617 et Penetratin-iCAL36).
En ce qui concerne la stratégie non covalente, les essais de fuite de fluorescence avec des peptides et avec leurs nanoparticules chargées de siRNA correspondantes en présence de LV sont présentés à la figure 2. Les vésicules sont composées d’un mélange de DOPC/SM/Chol (4:4:2) réfléchissant la membrane plasmique comme décrit dans Konate et al.21 et sont généralement utilisées pour évaluer directement la possibilité d’interaction bicouche lipidique et/ou les propriétés de transduction des nanoparticules libres WRAP et WRAP7. En l’absence de peptides, aucune fuite n’est observée (ligne de base pendant les 100 premières s). L’ajout de WRAP libre sur les LUV induit une augmentation significative de la fluorescence révélant une fuite importante de LUV et une libération d’ANTS. Après 15 min, une fuite de 67,8% ± 0,4% par rapport à la condition Triton (contrôle positif) est obtenue à la concentration utilisée (2,5 μM) de peptide WRAP. Il convient de noter ici que plusieurs concentrations différentes ont également été testées et ont révélé une augmentation de fluorescence dose-dépendante, correspondant à une fuite LUV dose-dépendante7. En revanche, lorsque WRAP est assemblé à la même concentration avec du siRNA pour former des nanoparticules à base de peptides, la fuite est 1,5 fois plus faible (40,5% ± 0,5%) par rapport au peptide libre(Figure 2). Des valeurs de fuite similaires ont été rapportées pour le peptide RICK (60%) ou les nanoparticules RICK:siRNA (28%)22. La différence de valeurs entre le peptide libre par rapport aux nanoparticules pourrait s’expliquer par le fait que, lorsqu’il est engagé dans les nanoparticules, une partie substantielle du peptide est impliquée dans des interactions directes avec le siRNA, réduisant la disponibilité du peptide pour les interactions avec les lipides.
En ce qui concerne la stratégie covalente, les essais de fuite de fluorescence avec des conjugués CPP en présence de LV sont illustrés à la figure 3. Avec la même composition LUV [DOPC/SM/Chol (4:4:2)], deux peptides conjugués sont appliqués : WRAP-iCAL36 et Penetratin-iCAL36. Comme indiqué précédemment, aucune fuite n’est observée en l’absence de peptides. 15 min après injection de 2,5 μM de Penetratin-iCAL36, aucune augmentation significative de fluorescence n’est détectée (2,3 % ± 0,7 %), alors qu’un ajout de 2,5 μM de WRAP-iCAL36 induit une fuite nette caractérisée par un signal de fluorescence très fort (85,8 % ± 11,1 %)17. Ces observations indiquent que pour certains peptides, ou conjugués, aucune fuite de fluorescence ne pourrait se produire, ce qui suggère qu’il n’y a pas d’interactions peptide/membrane ou pas de perturbation de la bicouche lipidique. Ceci est conforme aux résultats publiés précédemment montrant que Penetratin ainsi que Tat n’étaient pas en mesure de déstabiliser les membranes23,24,25. Il convient de souligner que les propriétés de déstabilisation membranaire d’un CPP pourraient changer en fonction de la cargaison couplée26.
De plus, bien que WRAP-iCAL36 ait provoqué une forte fuite, des études supplémentaires ne révèlent pas d’internalisation cellulaire spécifique, indiquant que ces conjugués sont restés à l’intérieur de la bicouche lipidique de la membraneplasmique 17. Contrairement à la nanoparticule WRAP, nous supposons que le conjugué WRAP-cargo est capable de déstabiliser la membrane LUV en collant entre les chaînes lipidiques ou en formant des pores.
Ces résultats indiquent que le test de fuite de fluorescence pourrait révéler la capacité de certains CPP à développer des interactions peptide/membrane, ce qui pourrait conduire à une perméabilité membranaire plus ou moins prononcée. De plus, ces interactions peuvent se produire quelle que soit la stratégie de livraison des cargaisons (nanoparticules versus conjugués). Inversement, cette méthode ne permet pas de déterminer si un CPP, qui n’induit aucune fuite de fluorescence, pourrait encore interagir avec la bicouche ou la membrane biologique des lipides. Ce type de comportement nécessite des approches supplémentaires telles que les mesures du potentiel zêta, le FRET entre le peptide et la membrane, ou les expériences de fluorescence du tryptophane pour ne citer que quelques exemples.
Figure 1: Principe du test de fuite de fluorescence. Les LGV étaient chargés d’un colorant fluorescent (ANTS) en blanc et de son quencher correspondant (DPX) en gris. En l’absence de peptides (en rouge), aucun signal de fluorescence n’a été observé car la fluorescence ANTS a été éteinte par DPX. L’ajout de peptides sur les LV induit la perméabilité de la membrane et la libération ultérieure d’ANTS et de DPX entraînant une augmentation significative de la fluorescence de l’ANTS (jaune). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Essai de fuite de fluorescence avec nanoparticules libres WRAP et WRAP:siRNA. Des nanoparticules chargées de peptide seul et de siRNA ont été appliquées sur des LUT à la concentration peptidique de 2,5 μM. Les nanoparticules à base de WRAP ont été formulées à un rapport molaire peptide:siRNA de 20 (R 20) comme décrit dans Konate et al.7,16. Les flèches noires montrent des injections de peptide (nanoparticule) et de Triton X-100, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Essai de fuite de fluorescence avec les conjugués WRAP-iCAL36 et Penetratin-iCAL36. Des conjugués ont été appliqués sur des LV à la concentration de 2,5 μM. Des flèches noires montrent des injections de peptide et de Triton X-100, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le test de fuite de fluorescence présenté est une méthode simple et rapide pour traiter la déstabilisation de la membrane par un peptide pénétrant dans les cellules. Facile à faire, il permet également une comparaison indirecte entre différents peptides interagissant avec la membrane ou d’autres molécules interagissant avec la membrane. En ce qui concerne les étapes critiques du protocole, comme ce test fournit des valeurs relatives entre la valeur de référence (LV seules) et la libération maximale de fluorescence (condition de Triton), nous évaluons généralement la concentration de LV à l’aide du kit de quantification des phospholipides, qui estime uniquement la contribution de la choline des LV. Cependant, il est également possible d’inclure une mesure plus précise de la concentration en LUV en déterminant la teneur totale en phosphore par digestion acide telle que décrite par Rouser et ses collègues27 ou par Bartlett28 ou par méthode colorimétrique utilisant des phospholipides complexants au ferrothiocyanate d’ammonium29. Entre nos mains, il n’a pas d’impact sur la quantification relative des fuites et sur la comparaison entre les peptides interagissant avec la membrane.
En ce qui concerne l’utilisation des LUV, il convient également de noter l’importance de contrôler l’état de base des LUV seuls afin de vérifier s’ils sont utilisables et s’ils présentent déjà des fuites (caractérisées par une augmentation continue de la fluorescence). De la même manière, il est important de mesurer la libération maximale de fluorescence après chaque incubation peptidique pour s’assurer qu’aucun résultat faussement négatif n’a été enregistré en raison d’un processus de trempe indésirable (par exemple, trempe peptidique / colorant).
En général, selon la caractérisation DLS, les LUV sont assez stables pendant 1 semaine et ne doivent pas afficher un fond de fluorescence trop élevé. Dans ce contexte, la purification des liposomes chargés d’ANTS/DPX par filtration sur gel est également un point clé puisqu’elle permet la formation de LLU sans fluorescence résiduelle qui pourrait contribuer à l’arrière-plan ou produire une surestimation de la fluorescence. De plus, il est fortement recommandé d’étalonner le protocole en incluant un contrôle positif spécifique qui peut toujours donner le même pourcentage de fuite. Il s’agit d’un contrôle interne à travers les différentes mesures, ce qui pourrait renforcer la caractérisation des LV pour chaque test et augmenter les statistiques.
Bien que le test de fuite de fluorescence puisse fournir une comparaison rapide de la déstabilisation de la membrane par les CPP, il est cependant limité dans l’interprétation des interactions peptide-membrane puisque certains peptides sont capables d’interagir avec la bicouche lipidique sans induire de perturbation ou de fuite membranaire. Pour ces peptides, il est fortement recommandé d’utiliser des expériences supplémentaires avec des marqueurs de fluorescence spécifiques permettant FRET30.
Il convient également de noter que d’autres paires colorant de fluorescence / quencher (par exemple, Tb3 +/ DPA31) pourraient être utilisées. Les deux méthodes ont leurs inconvénients: le terbium (III) n’est pas très soluble dans l’eau et ne peut pas être utilisé en présence de phosphate, alors que la trempe ANTS n’est pas une fonction linéaire de la concentration de DPX. En outre, d’autres matériaux auto-trempants tels que la solution de calcéine32 de 70 mM ou le dextran-PTS33 pourraient être manipulés en fonction des défauts de membrane provoqués par le peptide ou le composé analysé.
Enfin, le principal avantage de ce test de fuite de fluorescence est la possibilité de tester une multitude de molécules potentielles interagissant avec la membrane ainsi que différentes compositions membranaires, telles que les imitations de membrane endosomale [par exemple, la dioléoylphosphatidylcholine (DOPC)/dioléoyl-phospha-tidyléthanolamine (DOPE)/phosphatidylinositol à partir de phosphate de soja (PI)/bis(monooloylglycéron) (LBPA) à un rapport molaire de 5:2:1:2]34 , la membrane mitochondriale imite [p. ex., 46,5 % de DOPC, 28,5 % de phosphatidyléthanolamine (PE), 9 % de phosphatidylinositol (PI), 9 % de phosphatidylsérine (PS) et 7 % de cardiolipine (CL)35 ou toute autre composition de bicouches lipidiques souhaitée. Cependant, il faudra d’abord assurer la stabilité des vésicules (pas de fusion, d’agrégation ou de précipitation LUV, pas de chute lipidique hors de suspension, pas de courbure négative de la membrane, etc.) ayant une taille moyenne constante proche de 100 nm pendant l’expérience et le stockage.
De plus, l’avantage de cette méthode par rapport aux membranes extraites (globules rouges, mitochondries, etc.) est l’utilisation de lipides purifiés bien caractérisés en l’absence de protéines. Le contrôle de la composition de la bicouche lipidique (plasmatique, endosomale ou membrane mitochondriale) permet également l’insertion de protéines membranaires spécifiques (pompe à protons). De plus, la capacité de contrôler à la fois les environnements internes et externes des LV permet une interprétation claire de la perturbation / fuite de la membrane. Comparé aux expériences sur la membrane lipidique noire36, qui peuvent également visualiser les événements de perméabilisation membranaire, ce protocole de fuite fournit une méthode de criblage plus simple des peptides membranaires actifs.
En conclusion, cette méthode simple favorise une identification rapide des interactions fortes peptide/membrane conduisant à la déstabilisation membranaire. Il peut être appliqué pour étudier le mécanisme d’internalisation des CPP et dans une approche plus générale des « peptides membranaires actifs » tels que les peptides fusiogènes ou antimicrobiens.
En général, la caractérisation de la principale voie utilisée par les CPP pour atteindre le cytoplasme est très complexe et nécessite plusieurs approches distinctes, de la biophysique à la biologie cellulaire. Par exemple, l’étude de l’internalisation WRAP a révélé un équilibre entre différents mécanismes pour pénétrer dans les cellules (endocytose versus translocation directe) et le test de fuite de fluorescence, associé à d’autres méthodes, a contribué à soutenir un processus de pénétration directe7.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Emilie Josse pour la critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par la fondation « La Ligue contre le Cancer », la Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer et le Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
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