Summary
De fluorescentielekkagetest is een eenvoudige methode die het onderzoek van peptide / membraaninteracties mogelijk maakt om hun betrokkenheid bij verschillende biologische processen te begrijpen en vooral het vermogen van cel-penetrerende peptiden om fosfolipiden bilayers te verstoren tijdens een direct cellulair translocatieproces.
Abstract
Cel-penetrerende peptiden (CPP's) worden gedefinieerd als dragers die in staat zijn om het plasmamembraan te passeren en een lading in cellen over te brengen. Een van de belangrijkste gemeenschappelijke kenmerken die nodig zijn voor deze activiteit was het gevolg van de interacties van CPP's met het plasmamembraan (lipiden) en meer in het bijzonder met componenten van de extracellulaire matrix van het membraan zelf (heparansulfaat). Inderdaad, onafhankelijk van de directe translocatie of de endocytose-afhankelijke internalisatie, zijn lipide bilayers betrokken bij het internalisatieproces, zowel op het niveau van het plasmamembraan als op het niveau van intracellulair verkeer (endosomale blaasjes). In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol dat de verschillende stappen beschrijft van een formulering, zuivering, karakterisering en toepassing in fluorescentielekkagetest om mogelijke CPP-membraan destabilisatie / interactie te detecteren en hun rol in het internalisatiemechanisme aan te pakken. LUVs met een lipidesamenstelling die het plasmamembraangehalte weerspiegelt, worden gegenereerd om zowel een fluorescerende kleurstof als een quencher in te kapselen. De toevoeging van peptiden in het extravesiculaire medium en de inductie van peptide-membraaninteracties op de LUVs kunnen dus op een dosisafhankelijke manier een significante toename van fluorescentie veroorzaken die een lekkage onthult. Voorbeelden worden hier gegeven met de recent ontwikkelde tryptofaan (W) - en arginine (R) -rijke amphipathische peptiden (WRAPs), die een snelle en efficiënte siRNA-afgifte in verschillende cellijnen vertoonden. Ten slotte worden de aard van deze interacties en de affiniteit voor lipiden besproken om de membraantranslocatie en / of de endosomale ontsnapping te begrijpen en te verbeteren.
Introduction
Na hun ontdekking in de jaren negentig werden cel-penetrerende peptiden (CPP's) ontwikkeld om een efficiënte cellulaire levering van ladingen door het plasmamembraan te bevorderen1,2. CPP's zijn meestal korte peptiden, over het algemeen 8 tot 30 aminozuren, met een grote verscheidenheid aan oorsprongen. Ze werden voor het eerst gedefinieerd als "direct-translocerende" dragers, wat betekent dat ze in staat waren om het plasmamembraan te passeren en een lading over te brengen in cellen onafhankelijk van een endocytotische route, noch energiebehoefte noch receptorbetrokkenheid. Verder onderzoek bracht echter aan het licht dat deze eerste waarnemingen voornamelijk afkomstig waren van fluorescentieoverschatting als gevolg van het experimentele artefact en /of fixatieprotocollen met methanol3. Tegenwoordig is het algemeen aanvaard dat CPP-opname plaatsvindt door zowel endocytose als energie-onafhankelijke translocatie4,5,6,7, afhankelijk van verschillende parameters zoals de aard van de lading, de gebruikte link tussen CPP en lading, de bestudeerde cellijn, enz.
CPP's kunnen worden gebruikt als transfectionerende middelen volgens twee strategieën, hetzij met een chemische link (covalente strategie) of elektrostatische / hydrofobe interacties (niet-covalente strategie) tussen de CPP en zijn lading8,9,10,11. Hoewel beide strategieën hun efficiëntie hebben aangetoond in de celoverdracht van verschillende ladingen, is het begrip van het mechanisme van internalisatie door CPP's nog steeds controversieel en is de balans tussen endocytoseroutes of directe penetratie nog steeds moeilijk te meten12,13. Hoewel er een reeks experimentele hulpmiddelen en strategieën beschikbaar zijn om de betrokkenheid van endocytische processen duidelijk aan te pakken, lijkt de directe translocatie echter moeilijker te karakteriseren omdat het meer discrete interacties met plasmamembraancomponenten impliceert. Biologische membranen zijn meestal samengesteld uit talrijke componenten, van fosfolipiden tot membraaneiwitten, die kunnen variëren afhankelijk van het cellulaire type en / of de omgeving (stressomstandigheden, celdeling, enz.). Deze diversiteit van samenstelling, en bijgevolg de afwezigheid van een universeel cellulair membraanmodel, maakt studies op geen enkele manier mogelijk. Om deze beperkingen te omzeilen werden echter stapsgewijze benaderingen ontwikkeld met kunstmatige membraan- of membraanextracten. Van kleine unilamellaire blaasjes tot monolaagbenaderingen, elk model was duidelijk relevant om specifieke vragen14,15te beantwoorden. Onder hen vormen grote unilamellaire blaasjes (LUV's) een geschikt membraanimmickmodel om peptide / membraaninteracties te bestuderen als een belangrijk punt in het internalisatieproces.
In deze context beschrijft het volgende protocol het onderzoek naar de effecten van peptiden en peptide/membraaninteracties op de integriteit van LUVs door de monitoring van zowel een anionische fluorescerende kleurstof als de bijbehorende poly-kationische quencher ingekapseld in liposomen. Deze tool wordt gebruikt om CPP/membraaninteracties te bestuderen om te begrijpen of ze in staat zijn om een directe membraantranslocatie uit te voeren. Hoewel deze LUV-fluorescentielekkagetest meestal wordt toegepast om verschillende membraan-interagerende peptiden te vergelijken, kan deze LUV-fluorescentielekkagetest ook worden gebruikt voor het onderzoeken van zowel CPPs-ladingconjugaten (covalente strategie) als CPP:cargo-complexen (niet-covalente strategie).
Het huidige protocol zal daarom voor het eerst worden geïllustreerd met de recent ontwikkelde tryptofaan (W) - en arginine (R) -rijke amphipathische peptiden (WRAP)16. WRAP is in staat om op peptiden gebaseerde nanodeeltjes te vormen om snel en efficiënt klein storend RNA (siRNA) in verschillende cellijnen af te leveren16. De fluorescentielekkage-eigenschappen van WRAP-peptide alleen of siRNA-geladen WRAP-gebaseerde nanodeeltjes werden gecontroleerd om hun mechanisme van cellulaire internalisatie te karakteriseren. We toonden aan dat hun mechanisme van internalisatie voornamelijk directe translocatiebetrof 7. In een tweede voorbeeld werd het WRAP-peptide covalent geconjugeerd aan het eiwit/ eiwitinterfererende peptide iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 en het vermogen om membranen te destabiliseren werd in een fluorescentielekkagetest vergeleken met iCAL36 gekoppeld aan Penetratine18 (Penetratin-iCAL36), een andere CPP.
Tot slot zullen de voor- en nadelen van de methode worden besproken, zowel vanuit technologisch oogpunt als met betrekking tot biologische relevantie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van grote unilamellaire blaasjes (GAV's)
- Bereid LUVs voor op hun gebruik als celmembraan nabootst voor fluorescentielekkage assay.
- Meng met een Hamilton glazen spuit fosfatidylcholine (DOPC, 786,11 g/mol), sfingomyeline (SM, 760,22 g/mol) en Cholesterol (Chol, 386,65 g/mol) in de molaire verhouding 4:4:2. De lipideoplossing wordt verkregen uit een stamoplossing van elk lipide opgelost in een methanol/chloroform (3/1; volume/volume) oplosmiddel bij 25 mg/ml in een glazen kolf met ronde bodem van 25 ml. Op basis van 4 μmol DOPC, 4 μmol SM en 2 μmol Chol wordt de lipideoplossing verkregen uit stamoplossing door respectievelijk 126 μL, 117 μL en 31 μL te mengen.
LET OP: Methanol is een giftig en ontvlambaar oplosmiddel en chloroform is giftig en kankerverwekkend. Beide moeten worden behandeld met de juiste bescherming onder een motorkap. - Verdamp methanol/chloroform met behulp van een roterende verdamper onder vacuüm gedurende 45-60 minuten bij 60 °C tot de vorming van een gedroogde lipidenfilm.
- Bereid twee voorraad HEPES-bufferoplossingen voor. Bereid HEPES-buffer 1 door 20 mM HEPES (238,3 g/mol) en 75 mM NaCl (58,44 g/mol) te mengen en de pH in te stellen op 7,4. Bereid HEPES-buffer 2 voor door 20 mM HEPES en 145 mM NaCl te mengen en de pH in te stellen op 7,4. HEPES buffers kunnen gedurende 1 maand bewaard worden bij 4 °C.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de osmolariteit van de buffers te controleren met behulp van een osmometer. - Bereid lipidehydratatieoplossing door membraan ondoordringbaar fluorescerend kleurstof-quencher-paar, 8-aminonaftaleen-1, 3, 6-trisulfonzuur, disodiumzout op 12,5 mM (ANTS, 427,33 g / mol) en p-xyleen-bispyridiniumbromide bij 45 mM (DPX, 422,16 g / mol) in HEPES-bufferoplossing op te lossen. Het mengen van ANTS met DPX leidt tot een geelgekleurde oplossing. Om de concentraties van 12,5 mM ANTS en 45 mM DPX te bereiken, lost u respectievelijk 21,4 mg en 76 mg op in 4 ml HEPES-buffer 1.
OPMERKING: Lipide hydratatie-oplossing kan 2 weken bij 4 °C worden bewaard door de buis in te pakken met aluminiumfolie. - Reconstitueer multilamellaire blaasjes (MLV) door de gedroogde lipidenfilm opnieuw op te suspenderen met 1 ml van de lipidehydratatieoplossing en door vortexing totdat de gedroogde lipidenfilm is opgelost. Zorg ervoor dat de oplossing volledig is oplost, omdat kleine lipideaggregaten een negatieve invloed hebben op de voorgaande stappen. Controleer ook de wand van de glazen kolf met ronde bodem om er zeker van te zijn dat er geen lipidefilm overblijft.
OPMERKING: De oplossing zal opaalachtig en lichtgeel lijken na de oplosbaarheid. - Onderwerp de blaasjes aan vijf vries-/dooicycli om unilamellaire blaasjes te verkrijgen. Voer elke cyclus uit door de glazen kolf met ronde bodem gedurende 30 s in vloeibare stikstof te plaatsen voor de vriesstap en vervolgens 2 minuten in een waterbad te laten voor het ontdooien.
OPMERKING: De temperatuur van het badwater moet 5-10 °C hoger zijn dan de smelttemperatuur van de lipiden. - Bereid lipide-extruder voor door twee filtersteunen in te brengen die vooraf bevochtigd zijn met HEPES-buffer in elk polytetrafluorethyleen (PTFE) extruderstuk dat in de metalen extruderbus wordt geplaatst.
- Plaats een HEPES bevochtigd polycarbonaatmembraan (poriegrootte van 0,1 μm, diameter van 25 mm) op de bovenkant van één filtersteun.
- Monteer de twee metalen extruderbussen en schroef ze vast.
- Plaats de geassembleerde extruder in de houder en plaats een spuit van 1 ml in het juiste gat aan het uiteinde van elk stuk polytetrafluorethyleen extruder. Extrusie komt overeen met de passage van de geteste vloeistof van de ene spuit naar de andere door het polycarbonaatmembraan.
- Test de extruder met 1 ml HEPES-buffer geladen in een van de spuiten van 1 ml om er zeker van te zijn dat er geen lekken of problemen zijn.
- Vervang de HEPES-buffer van 1 ml door het MLV-monster.
- Voer extrusie uit door het MLV-monster ten minste 21 keer van de ene spuit naar de andere door het polycarbonaatmembraan te laten lopen om uniforme GVV's van dezelfde grootte te verkrijgen.
OPMERKING: Extrusie moet worden uitgevoerd bij een temperatuur die hoger is dan de smelttemperatuur van het lipidenmengsel.
2. Zuivering van luv's
- Bereid een kolomzuivering voor om niet-ingekapselde ANTS en DPX-overtollige te verwijderen.
- Introduceer cross-linked dextran gel (G-50) geresuspendeerd in waterig medium met 0,01% NaN3 (65 g/mol) in een vloeistofchromatografiekolom (Luer Lock, Non-jacketed, 1,0 cm x 20 cm, bedvolume 16 ml) tot 1 cm onder de bovenkant van het kleurloze deel van de kolom.
- Open de kraan en laat de vloeistof stromen om de verknoopte dextran-gel te laten bezinken.
- Was de kolom door te eluteren met 20 ml HEPES-buffer 2 en gooi de uitvoerstroom van de kolom weg.
- Sluit de kraan zodra het dode volume oplosmiddel boven de kolom is geminimaliseerd (<100 μL), maar voldoende om droging van de verknoopte dextran-gel te voorkomen.
- Plaats de vers geëxtrudeerde LUVs (geel) op de kolom en laat ze in de verknoopte dextran-gel komen.
- Voeg continu HEPES-buffer 2 toe aan de kolom om de LUV-zuivering uit te voeren.
- Eluteer ongeveer 2 ml HEPES-buffer 2 (vergeet niet om regelmatig de bovenkant van de kolom te vullen om te voorkomen dat de verknoopte dextran-gel wordt gedroogd): de vrije gele ANTS- en DPX-oplossing migreert langzamer dan de liposomen.
- Begin met het verzamelen van gezuiverde GV's in buizen (1,5 ml).
- Observeer de druppels eluent uit de kolom en wanneer ze opaalachtig worden, bevatten ze liposomen. Vervang de buis om de LUV-bevattende fractie terug te winnen.
- Elute totdat de druppels niet langer opaalachtig zijn (~ 1 ml). Eluteer daarna nog eens 0,5 ml in een aparte fractie en stop dan met eluteren.
OPMERKING: Normen zijn nu beschikbaar in een breed scala aan molecuulgewichten, als kits of individuele molecuulgewichten om het elutievolume van de LUVs te kalibreren. - Wikkel de buizen met de LUVs in aluminiumfolie om bleken van de fluorescentiekleurstof te voorkomen.
- Was de kolom met 20 ml HEPES buffer 2.
- De GAV's kunnen vervolgens een week bewaard worden bij 4 °C.
OPMERKING: Aangezien de stabiliteit van LUV afhankelijk kan zijn van de LUV-concentratie en -samenstelling, evenals van de ionische sterkte, moet de grootte van de GAV's worden geregeld met behulp van een DLS-instrument (Dynamic Light Scattering) (zie rubriek 4). Karakterisering van LUV-grootte en homogeniteit) vóór elke test.
3. Kwantificering van de concentratie van LUV's
- Schat de LUV-concentratie door een fosfolipidekwantificeringskit, die de evaluatie van cholineconcentratie mogelijk maakt19. Deze test kan worden toegepast wanneer fosfolipiden met choline bevattende polaire kop substantieel is (>50% van de GAV's).
- Bereid het kleurreagens door 18 mg chromogeen substraat op te lossen in 3 ml meegeleverde buffer.
- Laad een polystyreen cuvette, 10 x 10 x 45 mm, met 3 ml kleurreagens.
- Gebruik het zuivere kleurreagens als lege toestand (Leeg). Voeg 20 μL LUV-monster (test) of 20 μl standaardoplossing met bekende cholineconcentratie (standaard) toe.
- Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C alle omstandigheden (Blank, Test en Standard).
- Meet de absorptie (optische dichtheid, OD) van het testmonster en de standaardoplossing met de blanco-oplossing als controle bij 600 nm met een spectrofotometer.
- Controleer de OD-waarden die het mogelijk maken om de lipidenconcentratie van de GEV's, C [LUV], in choline-equivalent te schatten in vergelijking met de standaard van de bekende concentratie.
- Voer de berekening uit met behulp van de volgende vergelijking:
C[LUV] (mol / l) = (OD Sample / OD Standard) x C[Standard] (mol / l)
OPMERKING: De fosfolipide kwantificeringskit leverde een cholinechloride (139,6 mg / l) standaardoplossing bij 54 mg / dL overeenkomend met molaire concentratie van C [Standaard] = 3,87 mmol / L. OD-monster en OD-standaard zijn de absorpties gemeten bij 600 nm voor respectievelijk de LUV- en Choline-oplossingen.
4. Karakterisering van LUV-grootte en homogeniteit
- Voer een meting uit met behulp van een DLS-instrument om de LUV-grootte (in nm) en polydispersiteitsindex (PdI) te bepalen.
- Programmeer de toegeëigende "standaardbewerkingsprocedure" (SOP) door de viscositeit van het oplosmiddel/de buffer en het gebruikte cuvet aan te geven.
- Plaats 500 μL van de LUV-oplossing in een polystyreen semi-micro cuvette.
- Plaats het polystyreen semi-micro cuvet in een DLS-instrument.
- Meet bij kamertemperatuur de grootteverdeling in termen van gemiddelde grootte (Z-gemiddelde) van de deeltjesverdeling en homogeniteit (polydispersiteitsindex, PdI).
- Alle resultaten worden verkregen uit twee onafhankelijke metingen die elk in drie repetitieve cycli worden uitgevoerd.
OPMERKING: Standaardwaarden voor GAV's zijn een gemiddelde grootte van 137 ± 7 nm met een PdI van 0,149 ± 0,041.
5. Peptide-oplossingen bereiden
- Bereid een voorraadoplossing van het peptide, die moet worden geanalyseerd voor de lektest.
- Los peptidepoeder (>95% zuiverheid) op in zuiver water (bijv. 1 mg peptide in zuiver water van 500 μL).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om peptiden in zuiver water te verdunnen en om oplosbaarheid van dimethylsulfoxide (DMSO) te vermijden, wat artefacten zou kunnen veroorzaken (bijv. membraanpermeabilisatie20). - Vortex de peptide oplossing voor 5 s.
- Soniceer de peptide-oplossing gedurende 5 minuten in een watersontsoonapparaatbad en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 12.225 x g. Verzamel het supernatant voor concentratiebepaling.
- Meet de absorptie bij 280 nm van drie onafhankelijke peptideverdunningen en bereken vervolgens de peptideconcentratie met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt ε (afhankelijk van tryptofaan en tyrosinegehalte in de peptidesequentie) en beer-lambert regel.
OPMERKING: Als het peptide tryptofaan en tyrosine bevat, wordt de molaire extinctiecoëfficiënt ε berekend op basis van tryptofaan ε = 5.690 M-1cm-1 en Tyrosine ε = 1.280 M-1cm-1. Als de peptidesequentie geen tryptofaan of tyrosine bevat, kan een andere colorimetrische test worden uitgevoerd om de concentratie te meten (bijv. BCA of Bradford). - Verdun de peptide-oplossing in zuiver water tot een eindoplossing van 100 μM en bewaar bij 4 °C.
OPMERKING: In zuiver water treedt geen peptideafbraak op tijdens de opslag bij 4 °C. De peptideconcentratie moet echter om de 2 weken worden gemeten om ervoor te zorgen dat er geen waterverdamping optreedt.
6. Fluorescentielekkagetest
- Fluorescentielekkagetest wordt gemeten op een spectrofluorometer bij kamertemperatuur. Excitatie en emissiegolflengte zijn vastgesteld op Ex = 360 nm ± 3 nm en Em = respectievelijk 530 nm ± 5 nm.
- Verdun GVV's in 1 ml HEPES-buffer 2 tot een eindconcentratie van 100 μM in een kwartsfluorescentiesyvet. Voeg een magneetroerder toe om de oplossing tijdens het experiment te homogeniseren.
- Meet de LUVs alleen tijdens de eerste 100 s, tussen t = 0 s en t = 99 s om toegang te krijgen tot de achtergrondfluorescentie.
OPMERKING: LUVs alleen kunnen ook worden gemeten tijdens het hele experiment (15 min) om toegang te krijgen tot achtergrondfluorescentie en potentiële lekken. - Meet daarna lekkage als een toename van de fluorescentie-intensiteit bij toevoeging van aliquots van peptide-oplossing voor de volgende 900 s (15 min). Dit protocol wordt uitgevoerd voor elke geteste concentratie peptide van 0,1 μM tot 2,5 μM.
- Ten slotte werd 100% fluorescentie bereikt door de LUVs op te laden door toevoeging van 1 μL Triton X-100 (0,1%, v/v), wat resulteerde in de volledig onuitblusbare sonde tussen t = 1.000 s en t = 1.100 s.
7. Kwantificering van de lekkage
- Onderdruk waarden verkregen na t = 1.090 s om hetzelfde aantal punten te behouden voor elke geteste toestand.
- Bereken de minimale fluorescentie, Fmin, door het gemiddelde van 50 punten tussen t = 0 s en t = 49 s (alleen GAV's) te maken.
- Bereken de maximale fluorescentie, Fmax, door het gemiddelde van 50 punten tussen t = 1.041 s en t = 1.090 s te maken (GAV's met Triton X-100).
- Bereken het lekkagepercentage (%Lek) op elk tijdstip (t = x), volgens de volgende vergelijking:
%Lek(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100 - Bereken het gemiddelde en de standaarddeviatie voor waarden verkregen met verschillende LUV-preparaten (n ≥ 2) voor dezelfde voorwaarde.
- Plot het lekpercentage, %Lek(t=x), in functie van tijd(en).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het principe van de fluorescentielekkagetest is weergegeven in figuur 1. In detail worden grote unilamellaire blaasjes (LUV's) die een fluorescerende kleurstof en een quencher (geen fluorescentiesignaal) inkapselen, behandeld met het biomolecuul van belang. Door de interactie van het peptide met lipidemembranen, wat membraandoorlaatbaarheid, reorganisatie of zelfs breuk zou kunnen impliceren, komen de fluorescentiekleurstof en de quencher vrij uit de LUVs. Daaropvolgende verdunningen in de buffer resulteren in een verhoogd fluorescentiesignaal.
Hoewel dit schema een test met vrije peptiden weergeeft, ligt het voordeel van het systeem in de mogelijkheid om ook lading-geconjugeerde peptiden, op peptiden gebaseerde nanodeeltjes of andere biopolymeren te testen, waarvan wordt vermoed dat ze lipidemembranen destabiliseren. Hoewel een voorlopige optimalisatie van het protocol, vooral met betrekking tot de geteste moleculen, vereist is, kan deze fluorescentielekkagetest worden uitgebreid naar een enorme verscheidenheid aan membraan-interagerende componenten. In dit protocol tonen we enkele resultaten verkregen met de CPP's en hun gecomplexeerde (niet-covalente strategie) of geconjugeerde (covalente strategie) vormen. De volgende voorbeelden impliceren WRAP alleen, evenals siRNA-geladen WRAP-gebaseerde nanodeeltjes en twee verschillende peptide-conjugaten (WRAP-iCAL3617 en Penetratin-iCAL36).
Met betrekking tot de niet-covalente strategie wordt in figuur 2de fluorescentielekkagetest met peptiden en met hun overeenkomstige siRNA-geladen nanodeeltjes in aanwezigheid van LUVs weergegeven. De blaasjes zijn samengesteld uit een mengsel van DOPC/SM/Chol (4:4:2) dat het plasmamembraan reflecteert zoals beschreven in Konate et al.21 en worden meestal gebruikt om de mogelijkheid van lipide bilayer interactie en/of transductie-eigenschappen van vrije WRAP en WRAP-gebaseerde nanodeeltjes direct te evalueren7. Bij afwezigheid van peptiden wordt geen lekkage waargenomen (baseline tijdens de eerste 100 s). Toevoeging van vrije WRAP op de LUVs induceert een significante toename van fluorescentie, wat een belangrijke LUV-lekkage en ANTS-afgifte onthult. Na 15 min wordt een lekkage van 67,8% ± 0,4% ten opzichte van de Triton conditie (positieve controle) verkregen bij de gebruikte concentratie (2,5 μM) WRAP peptide. Hierbij moet worden opgemerkt dat verschillende concentraties ook zijn getest en een dosisafhankelijke fluorescentieverhoging hebben aangetoond, overeenkomend met een dosisafhankelijkeLUV-lekkage 7. Wanneer WRAP daarentegen in dezelfde concentratie met siRNA wordt geassembleerd om op peptiden gebaseerde nanodeeltjes te vormen, is de lekkage 1,5 keer zwakker (40,5% ± 0,5%) in vergelijking met het vrije peptide(figuur 2). Vergelijkbare lekkagewaarden zijn gemeld voor het RICK-peptide (60%) of de RICK:siRNA-nanodeeltjes (28%)22. Het verschil in waarden tussen vrije peptiden in vergelijking met nanodeeltjes kan worden verklaard door het feit dat, wanneer het betrokken is bij de nanodeeltjes, een aanzienlijk deel van het peptide betrokken is bij directe interacties met het siRNA, waardoor de beschikbaarheid van peptiden voor interacties met lipiden wordt verminderd.
Wat de covalente strategie betreft, zijn fluorescentielekkagetests met CPP-conjugaten in aanwezigheid van GAV's weergegeven in figuur 3. Met dezelfde LUV-samenstelling [DOPC/SM/Chol (4:4:2)] worden twee geconjugeerde peptiden toegepast: WRAP-iCAL36 en Penetratin-iCAL36. Zoals eerder opgemerkt, wordt er geen lekkage waargenomen in afwezigheid van peptiden. 15 min na injectie van 2,5 μM Penetratin-iCAL36 wordt geen significante fluorescentietoename gedetecteerd (2,3% ± 0,7%), terwijl een toevoeging van 2,5 μM WRAP-iCAL36 een nettolekkage induceert die wordt gekenmerkt door een zeer sterk fluorescentiesignaal (85,8% ± 11,1%)17. Deze observaties geven aan dat voor sommige peptiden, of conjugaten, geen fluorescentielekkage kan optreden, wat suggereert dat er geen peptide / membraaninteracties of geen lipide bilayer verstoring zijn. Dit is in overeenstemming met eerder gepubliceerde resultaten waaruit blijkt dat Penetratin en Tat niet in staat waren om membranen23,24,25te destabiliseren. Er moet worden benadrukt dat de membraanstabilisatie-eigenschappen van een CPP kunnen veranderen afhankelijk van de gekoppelde lading26.
Bovendien, hoewel WRAP-iCAL36 een sterke lekkage veroorzaakte, onthullen aanvullende studies geen specifieke cellulaire internalisatie, wat aangeeft dat deze conjugaten in de lipiden bilaag van het plasmamembraanbleven 17. In tegenstelling tot het WRAP nanodeeltje veronderstellen we dat het WRAP-cargo conjugaat in staat is om het LUV-membraan te destabiliseren door tussen de lipideketens te plakken of door poriën te vormen.
Deze resultaten geven aan dat de fluorescentielekkagetest het vermogen van sommige CPP's kan onthullen om peptide / membraaninteracties te ontwikkelen, wat zou kunnen leiden tot een min of meer uitgesproken membraandoorlaatbaarheid. Bovendien kunnen deze interacties plaatsvinden ongeacht de strategie van ladingafgifte (nanodeeltjes versus conjugaten). Omgekeerd maakt deze methode geen onderscheid of een CPP, die geen fluorescentielekkage induceert, nog steeds kan interageren met het dubbellaagse of biologische membraan van de lipiden. Dit soort gedrag vereist aanvullende benaderingen zoals zeta-potentiaalmetingen, FRET tussen peptide en membraan, of tryptofaan fluorescentie-experimenten om maar een paar voorbeelden te noemen.
Figuur 1: Principe van de fluorescentielekkagetest. LUVs werden geladen met een fluorescerende kleurstof (ANTS) in wit en de bijbehorende quencher (DPX) in grijs. Bij afwezigheid van peptiden (in rood) werd geen fluorescentiesignaal waargenomen omdat ANTS-fluorescentie werd geblust door DPX. Toevoeging van peptiden op de LUVs veroorzaakte membraandoorlaatbaarheid en de daaropvolgende afgifte van zowel ANTS als DPX, wat resulteerde in een significante toename van ANTS-fluorescentie (geel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Fluorescentielekkagetest met vrije WRAP en WRAP:siRNA nanodeeltjes. Peptide alleen en siRNA-geladen nanodeeltjes werden aangebracht op LUVs met de peptideconcentratie van 2,5 μM. WRAP-gebaseerde nanodeeltjes werden geformuleerd met een peptide: siRNA molaire verhouding van 20 (R 20) zoals beschreven in Konate et al.7,16. Zwarte pijlen tonen injecties van respectievelijk peptide (nanodeeltje) en Triton X-100. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Fluorescentielekkagetest met WRAP-iCAL36 en Penetratin-iCAL36-conjugaten. Conjugaten werden aangebracht op LUVs in de concentratie van 2,5 μM. Zwarte pijlen tonen injecties van respectievelijk peptide en Triton X-100. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gepresenteerde fluorescentielekkagetest is een eenvoudige en snelle methode om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide aan te pakken. Het is gemakkelijk te doen en maakt ook een indirecte vergelijking mogelijk tussen verschillende membraan-interagerende peptiden of andere membraan-interagerende moleculen. Met betrekking tot kritieke stappen van het protocol, aangezien deze test relatieve waarden oplevert tussen de uitgangswaarde (alleen LUVs) en maximale fluorescentieafgifte (Triton-toestand), evalueren we meestal de concentratie van LUVs met behulp van de fosfolipide kwantificeringskit, die alleen de cholinebijdrage van de LUVs schat. Het is echter ook mogelijk om een nauwkeurigere meting van de LUV-concentratie op te nemen door het totale fosforgehalte te bepalen door zure vertering zoals beschreven door Rouser en collega's27 of door Bartlett28 of door colorimetrische methode met behulp van ammoniumferrocyanaatcomplexering fosfolipiden29. In onze handen heeft het geen invloed op de relatieve kwantificering van lekkage en op de vergelijking tussen membraan-interagerende peptiden.
Met betrekking tot het gebruik van LUVs moet men ook het belang opmerken om de toestand van de uitgangswaarde van LUV alleen te controleren om te controleren of ze bruikbaar zijn en of ze al lekken vertonen (gekenmerkt door een voortdurende toename van fluorescentie). Op dezelfde manier is het belangrijk om de maximale fluorescentieafgifte na elke peptide-incubatie te meten om ervoor te zorgen dat er geen vals-negatieve resultaten werden geregistreerd als gevolg van een ongewenst blusproces (bijv. peptide / kleurstof quenching).
Over het algemeen zijn LUVs volgens DLS-karakterisatie vrij stabiel gedurende 1 week en mogen ze geen te hoge fluorescentieachtergrond vertonen. In deze context is de zuivering van ANTS/DPX-geladen liposomen door gelfiltratie ook een belangrijk punt, omdat de vorming van LUVs mogelijk is zonder resterende fluorescentie die kan bijdragen aan de achtergrond of fluorescentieoverschatting kan veroorzaken. Daarnaast wordt sterk aanbevolen om het protocol te kalibreren door een specifieke positieve controle op te geven die altijd hetzelfde lekkagepercentage kan geven. Dit vormt een interne controle door de verschillende metingen, die de karakterisering van de LUVs voor elke test kunnen versterken en de statistieken kunnen verhogen.
Hoewel de fluorescentielekkagetest een snelle vergelijking kan bieden in membraanstabilisatie door CPP's, is deze echter beperkt in de interpretatie van peptide-membraaninteracties, omdat sommige peptiden in staat zijn om te interageren met lipide bilayer zonder enige membraanverstoring of lekkage te veroorzaken. Voor deze peptiden wordt het ten zeerste aanbevolen om aanvullende experimenten te gebruiken met specifieke fluorescentiemarkers die FRET30mogelijk maken.
Er moet ook worden opgemerkt dat andere fluorescentiekleurstof / quencher-paren (bijv. Tb3 +/ DPA31) kunnen worden gebruikt. Beide methoden hebben hun ongemakken: Terbium (III) is niet erg oplosbaar in water en kan niet worden gebruikt in aanwezigheid van fosfaat, terwijl het blussen van ANTS geen lineaire functie is van de DPX-concentratie. Bovendien kunnen andere zelfdovende materialen zoals 70 mM Calcein-oplossing32 of dextran-PTS33 worden behandeld, afhankelijk van de membraandefecten veroorzaakt door het geanalyseerde peptide of de geanalyseerde verbinding.
Ten slotte is het belangrijkste voordeel van deze fluorescentielekkagetest de mogelijkheid om een groot aantal potentiële membraan interagerende moleculen en verschillende membraansamenstellingen te testen, zoals endosomale membraanmimics [bijv. Dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) / dioleoyl-fosfa-tidylethanolamine (DOPE) / fosfatidylinositol uit sojabonen (PI) / bis (monooleoylglycero) fosfaat (LBPA) bij een molaire verhouding van 5: 2: 1: 2]34 , mitochondriaal membraan bootst na [bijv. 46,5% DOPC, 28,5% fosfatidylethanolamine (PE), 9% fosfatidylinositol (PI), 9% fosfatidylserine (PS) en 7% cardiolipine (CL)35 of een andere gewenste lipide bilayer samenstelling. Men zal echter eerst moeten zorgen voor stabiliteit van de blaasjes (geen LUV-fusie, aggregatie of precipitatie, geen lipide die uit de suspensie valt, geen negatieve membraankromming, enz.) met een constante gemiddelde grootte van bijna 100 nm tijdens experiment en opslag.
Bovendien is het voordeel van deze methode in vergelijking met geëxtraheerde membranen (rode bloedcellen, mitochondriën, enz.) het gebruik van gezuiverde goed gekarakteriseerde lipiden in afwezigheid van eiwitten. De controle van de lipide bilayer samenstelling (plasma, endosomale of mitochondriale membraan) maakt ook het inbrengen van specifieke membraaneiwitten (protonpomp) mogelijk. Bovendien maakt de mogelijkheid om zowel interne als externe omgevingen van LUVs te regelen een duidelijke interpretatie van membraanverstoring / -lekkage mogelijk. Vergeleken met zwart-lipide membraanexperimenten36, die ook membraanpermeabilisatiegebeurtenissen kunnen visualiseren, biedt dit lekprotocol een eenvoudigere screeningsmethode van membraanactieve peptiden.
Kortom, deze eenvoudige methode bevordert een snelle identificatie van sterke peptide / membraaninteracties die leiden tot membraanstabilisatie. Het kan worden toegepast om het mechanisme van internalisatie van CPP's te onderzoeken en in een meer algemene benadering van "membraanactieve peptiden" zoals fusiogene of antimicrobiële peptiden.
Over het algemeen is de karakterisering van de hoofdroute die door CPP's wordt gebruikt om het cytoplasma te bereiken zeer complex en vereist het verschillende benaderingen, van biofysica tot cellulaire biologie. Het onderzoek naar WRAP-internalisatie onthulde bijvoorbeeld een evenwicht tussen verschillende mechanismen om de cellen binnen te gaan (endocytose versus directe translocatie) en de fluorescentielekkagetest, geassocieerd met andere methoden, heeft bijgedragen aan het ondersteunen van een direct penetratieproces7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
De auteurs willen Emilie Josse bedanken voor de kritische beoordeling van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de stichting "La Ligue contre le Cancer", de "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" en het "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
References
- Langel, U. Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , CRC Press. (2006).
- Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).
- Richard, J., et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. The Journal of Biological Chemistry. , (2003).
- Jones, A., Sayers, E. Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).
- Tünnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
- Jiao, C. -Y., et al. Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization. Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).
- Deshayes, S., et al. Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252 (2020).
- Konate, K., et al. Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide. International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).
- Lehto, T., et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).
- Hoyer, J., Neundorf, I. Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids. Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).
- Milletti, F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
- Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).
- Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs. Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).
- Maget-Dana, R. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).
- Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).
- Konate, K., et al. Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently "Wrap 'n Roll" siRNA into cells. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).
- Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).
- Notman, R., Noro, M., O'Malley, B., Anwar, J. Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).
- Konate, K., et al. Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).
- Vaissière, A., et al. A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34 (2017).
- Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, Ü, Divita, G., Deshayes, S. Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).
- Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).
- Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation. FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).
- Mishra, A., et al. Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).
- Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).
- Bartlett, G. R.
- Stewart, J. C. M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).
- Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571 (2012).
- Wimley, W. C. Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity. Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).
- Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo. FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).
- van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism. PloS One. 5 (12), 14292 (2010).
- Hassane, F. S., et al. Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).
- Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291 (2012).
- Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. Electrophysiological characterization of membrane transport proteins. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).
