형광 누설 분석법은 펩타이드/멤브레인 상호작용의 조사를 가능하게 하는 간단한 방법으로, 여러 생물학적 과정에 대한 그들의 관여, 특히 세포 관통 펩타이드의 능력을 이해하기 위해 직접 세포 전좌 과정 동안 인지질을 방해한다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 관통 펩티드(CpP)는 플라즈마 멤브레인을 교차하고 화물을 세포로 이송할 수 있는 운반체로 정의됩니다. 이 활동에 필요한 주요 일반적인 특징 중 하나는 플라즈마 멤브레인 (지질)과 CPP의 상호 작용및 특히 막 자체의 세포 외 매트릭스 (heparan sulphate)의 구성 요소에서 비롯되었습니다. 실제로, 직접적인 전좌 또는 내분비에 의존하는 내재화와는 별개로, 지질 이중층은 혈장 막의 수준과 세포내 교통(내외 소포)의 수준에서 모두 내화 공정에 관여한다. 이 문서에서는 가능한 CPP 멤브레인 불안정화/상호 작용을 감지하고 내부화 메커니즘에서 자신의 역할을 해결하기 위해 형광 누설 분석에서 큰 단음제 소포(LUV) 제제, 정제, 특성화 및 응용 프로그램의 다른 단계를 설명하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 혈장 막 함량을 반영하는 지질 조성물을 가진 루프는 형광염과 담수를 모두 캡슐화하기 위해 생성된다. 루프염증에 대한 펩티드-멤브레인 상호작용의 외과 배지에 펩타이드를 첨가하고 따라서 투여량 의존적 방식으로 유도하여 누설을 드러내는 형광의 현저한 증가를 유도할 수 있다. 최근에 개발된 트립토판(W)과 아르기닌(R)이 풍부한 수륙양용 펩타이드(WRAPP)와 함께 다양한 세포주에서 신속하고 효율적인 siRNA 전달을 보여 준 사례가 여기에 제공된다. 마지막으로, 이러한 상호 작용의 본질과 지질에 대한 친화력은 막 전좌 및/또는 내인성 탈출을 이해하고 개선하기 위해 논의됩니다.
서론
90년대에 발견된 후, 세포 관통 펩티드(CpP)는 혈장 막1,2를통해 화물의 효율적인 세포 전달을 촉진하기 위해 개발되었다. CpPs는 일반적으로 짧은 펩티드, 일반적으로 8 ~ 30 아미노산, 기원의 다양 한 데. 그(것)들은 처음에 "직접 배분하는" 운반체로 정의되었습니다, 그(것)들이 플라즈마 막을 교차하고 에너지 요구 사항도 수용체 관여도 없는 어떤 내분 통로와 독립적으로 세포로 화물을 전송할 수 있었다는 것을 의미합니다. 그러나, 추가 조사는 이러한 첫 번째 관찰이 주로 실험 동맥 및 /또는 메탄올3을사용하여 고정 프로토콜에 형광 과대 평가에서 온 것으로 나타났다. 요즘CPP 섭취량은 내분세포증과 에너지 독립적인 전좌4,5,6,7 이에 따라 화물의 특성, CPP와 화물 간의 사용 링크, 연구된 세포주 등과 같은 다른 파라미터에 따라 이루어지는 것으로 널리 받아들여지고 있다.
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프로토콜
1. 대형 유니라멜라 소포 준비 (LUV)
- 형광 누출 분석에 대 한 모방 세포 막으로 그들의 사용에 대 한 LUV를 준비.
- 해밀턴 유리 주사기 인스파디딜콜린(DOPC, 786.11 g/mol), 스핑크고미엘린(SM, 760.22 g/mol) 및 콜레스테롤(철, 386.65 g/mol)과 함께 4:4:2의 어금니비와 섞는다. 지질용 액액은 메탄올/클로로폼(3/1; 부피/부피)에서 25mL 유리 원형 플라스크에서 25 mg/mL의 용매로 용해된 각 지질의 스톡 용액으로부터 얻어진다. DOPC의 4μmol, SM의 4 μmol, 2 μmol, 철의 2 μmol를 기준으로, 지질 용액은 각각 126 μL, 117 μL 및 31 μL을 혼합하여 스톡 용액에서 얻어진다.
주의: 메탄올은 독성 및 인화성 용매이며 클로로폼은 독성및 발암성입니다. 둘 다 후드 아래에서 적절한 보호 기능을 처리해야 합니다. - 건조지질막이 형성될 때까지 60°C에서 45-60분 동안 진공 하에서 회전 증발기하에서 메탄올/클로로포형을 증발시킵니다.
- 두 개의 주식 HEPES 버퍼 솔루션을 준비합니다. 20m HEPES(238.3g/mol)와 75m MM NaCl(58.44g/mol)을 혼합하여 HEPES 버퍼 1을 준비하고 pH를 7.4로 조정합니다. 20....
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결과
형광 누설 분석의 원리는 도 1에도시된다. 구체적으로, 형광염과 담수(형광 신호 없음)를 캡슐화하는 대형 유니라멜라 소포(LUV)는 관심있는 생체 분자로 처리된다. 막 투과성, 재구성 또는 파열을 암시할 수 있는 지질 막과의 펩타이드의 상호 작용으로 인해 형광염과 담종은 LUV에서 방출됩니다. 버퍼의 후속 희석으로 인해 형광 신호가 증가합니다.
이 계획은 무료 펩타이드로 테스트를 표시하지만, 시스템의 장점은 또한 지질 막을 불안정하게 하는 것으로 의심되는 화물-공주 펩티드 펩티드, 펩티드 기반 나노 입자 또는 기타 바이오 폴리머를 테스트할 수 있는 능력에 있다. 특히 테스트된 분자와 관련하여 프로토콜의 예비 최적화가 필요하지만, 이 형광 누설 분석은 막 상호 작용 성분의 거대한 다양성으로 확장될 수 있습니다. .......
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토론
제시된 형광 누설 분석법은 세포 관통 펩타이드에 의한 막 불안정화를 해결하는 간단하고 빠른 방법입니다. 쉽게 할 수 있으며, 또한 다른 멤브레인 상호 작용 펩티드 또는 다른 멤브레인 상호 작용 분자 사이의 간접적인 비교를 가능하게합니다. 이 분석이 기준선(LUV 단독으로)과 최대 형광 방출(Triton 조건) 사이의 상대적 값을 제공하기 때문에 프로토콜의 중요한 단계에 대해서는 일반적으로 LUV의 콜린 기여도를 추정하는 인지질 정량화 키트를 사용하여 LUV의 농도를 평가합니다. 그러나, 루우저 및동료(27)에 의해 설명된 산성 소화에 의한 총 인 함량을 결정하거나 바틀렛(28)에 의해 또는 암모늄 ferrothiocyanate 복합인인지질(29)을 이용한 색인식 방법에 의해 LUV 농도의 보다 정확한 측정을 포함할 수도 있다. 우리의 손에, 그것은 누출의 상대적 정량화와 멤브레인 상호 작용 펩티드 사.......
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공개 사항
저자는 이해상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 원고의 비판적 검토에 대한 에밀리 호세에게 감사드립니다. 이 작품은 재단 "라 리그 콘트레 르 암", "퐁디아크 부어 라 레체쉬 쉬르 르 암", 그리고 "센터 국립 드 라 레체쉬 사이엔티피크"(CNRS)에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 25 mL 유리 라운드-바텀 플라스크 | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | 빛으로부터 보호 |
| 클로로포름 | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| 콜레스테롤 | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC(디올레올오일포스파티딜콜린) | Avanti Polar | 850375P | 공기 |
| 압출기 | Avanti Polar | 610000 | |
| 형광계 | PTI Serlabo | ||
| 50 µ L 유리 주사기 | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay 인지질 | 와코 | 296-63801 | |
| 액체 크로마토그래피 컬럼 | Sigma-Aldrich | ||
| 메탄올 | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore 폴리카보네이트 멤브레인 (0.1 &마이크로; m 기공 크기, 직경 25mm) | Whatman | 800309 | |
| 폴리스티렌 큐벳, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| 폴리스티렌 세미 마이크로 큐벳, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| 석영 형광 큐벳 | Hellma | 109.004F-QS | |
| 회전 증발 시스템 | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 수지 | Amersham | 17-0042-01 | |
| 아지드 화 나트륨 (NaN3< / sub>) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 염소화 나트륨 (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| 초음파 발생기 욕조 USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | 공기로부터 보호 |
| 트리톤 X-100 | 에로메덱 | 2000-B | |
| 제타지저 나노ZS | 맬번 | ZEN3500 |
참고문헌
- Langel, U. Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , CRC Press. (2006).
- Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005). ....
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재인쇄 및 허가
