Summary

Het meten van de samenstelling van cd95-doodsopwekkend signaleringscomplex en verwerking van procaspase-8 in dit complex

Published: August 02, 2021
doi:

Summary

Hier wordt een experimentele workflow gepresenteerd die de detectie van caspase-8-verwerking direct bij het death-inducerende signaleringscomplex (DISC) mogelijk maakt en de samenstelling van dit complex bepaalt. Deze methodologie heeft brede toepassingen, van het ontrafelen van de moleculaire mechanismen van celdoodroutes tot de dynamische modellering van apoptosenetwerken.

Abstract

Extrinsieke apoptose wordt gemedieerd door de activering van doodsreceptoren (DRs) zoals CD95 / Fas / APO-1 of tumornecrosefactor-gerelateerde apoptose-inducerende ligand (TRAIL) – receptor 1 / receptor 2 (TRAIL-R1 / R2). Stimulatie van deze receptoren met hun verwante liganden leidt tot de assemblage van het dood-inducerende signaleringscomplex (DISC). DISC bestaat uit DR, het adaptoreiwit Fas-geassocieerd eiwit met death domain (FADD), procaspases-8/-10 en cellulaire FADD-achtige interleukine (IL)-1β-converterende enzym-remmende eiwitten (c-FLIPs). De DISC dient als platform voor procaspase-8 verwerking en activering. Dit laatste gebeurt via zijn dimerisatie/oligomerisatie in de death effector domain (DED) filamenten geassembleerd op de DISC.

Activering van procaspase-8 wordt gevolgd door de verwerking ervan, die in verschillende stappen plaatsvindt. In dit werk wordt een gevestigde experimentele workflow beschreven die de meting van DISC-vorming en de verwerking van procaspase-8 in dit complex mogelijk maakt. De workflow is gebaseerd op immunoprecipitatietechnieken die worden ondersteund door western blot-analyse. Deze workflow maakt zorgvuldige monitoring van verschillende stappen van procaspase-8-rekrutering voor de DISC en de verwerking ervan mogelijk en is zeer relevant voor het onderzoeken van moleculaire mechanismen van extrinsieke apoptose.

Introduction

Een van de best bestudeerde doodsreceptoren (DRs) is CD95 (Fas, APO-1). De extrinsieke apoptotische route begint met de interactie van de DR met zijn verwante ligand, d.w.z. CD95L interageert met CD95 of TRAIL bindt aan TRAIL-R’s. Dit resulteert in de vorming van de DISC bij de overeenkomstige DR. DISC bestaat uit CD95, FADD, procaspase-8/-10 en c-FLIP eiwitten1,2. Bovendien wordt de DISC geassembleerd door interacties tussen death domain (DD)-bevattende eiwitten, zoals CD95 en FADD, en DED-bevattende eiwitten zoals FADD, procaspase-8/-10 en c-FLIP(Figuur 1). Procaspase-8 ondergaat oligomerisatie via associatie van zijn DED’s, wat resulteert in de vorming van DED-filamenten, gevolgd door procaspase-8 activering en verwerking. Dit veroorzaakt een caspase cascade, wat leidt tot celdood (Figuur 1)3,4. Procaspase-8 is dus een centrale initiator caspase van de extrinsieke apoptoseroute gemedieerd door CD95 of de TRAIL-R’s, geactiveerd op het overeenkomstige macromoleculaire platform, DISC.

Van twee isovormen van procaspase-8, namelijk procaspase-8a (p55) en -8b (p53), is bekend dat ze worden gerekruteerd voor de DISC5. Beide isovormen bestaan uit twee DED’s. DED1 en DED2 bevinden zich op het N-terminale deel van procaspase-8a/b gevolgd door de katalytische p18- en p10-domeinen. Gedetailleerde cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) analyse van procaspase-8 DEDs onthulde de assemblage van procaspase-8-eiwitten in filamenteuze structuren genaamd DED-filamenten4,6. Opmerkelijk genoeg werd aanvankelijk gesuggereerd dat de lineaire procaspase-8-ketens betrokken waren bij de dimerisatie gevolgd door procaspase-8-activering op de DISC. Nu is bekend dat die ketens slechts een onderbouw zijn van het procaspase-8 DED-filament, waarbij de laatste bestaat uit drie ketens geassembleerd tot een drievoudige helix3,4,6,7.

Bij dimerisatie bij het DED-filament leiden conformationele veranderingen in procaspase-8a/b tot de vorming van het actieve centrum van procaspase-8 en de activering ervan3,8. Dit wordt gevolgd door procaspase-8-verwerking, die via twee paden wordt gemedieerd: de eerste gaat via de generatie van een p43 / p41-splitsingsproduct en de tweede via de eerste generatie van een p30-splitsingsproduct. De p43/p41-route wordt geïnitieerd door de splitsing van procaspase-8a/b bij Asp374, wat resulteert in p43/p41- en p12-splitsingsproducten(figuur 2). Verder worden deze fragmenten autokatalytisch gesplitst bij Asp384 en Asp210/216, wat aanleiding geeft tot de vorming van het actieve caspase-8 heterotetrameer, p102/ p1829,10,11. Bovendien werd aangetoond dat parallel aan de p43/p41-verwerkingsroute procaspase-8a/b ook wordt gesplitst bij Asp216, wat leidt tot de vorming van het C-terminale splitsingsproduct p30, gevolgd door de proteolyse tot p10 en p1810 (figuur 2).

Procaspase-8a/b activering bij het DED filament wordt strikt gereguleerd door eiwitten genaamd c-FLIPs12. De c-FLIP-eiwitten komen voor in drie isovormen: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)en c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle drie de isovormen bevatten twee DED’s in hun N-terminale regio. c-FLIPL heeft ook een C-terminal katalytisch inactief caspase-achtig domein12,13. Beide korte isovormen van c-FLIP-c-FLIPS en c-FLIPRwerken op een anti-apoptotische manier door de vorming van DED-filamenten op de DISC6,14,15te verstoren. Bovendien kan c-FLIPL de activering van caspase-8 op een concentratieafhankelijke manier regelen. Dit kan resulteren in zowel pro- als anti-apoptotische effecten16,17,18. Door het katalytisch actieve procaspase-8/c-FLIPL heterodimeer te vormen, leidt c-FLIPL tot de stabilisatie van het actieve centrum van procaspase-8 en de activering ervan. De pro- of anti-apoptotische functie van c-FLIPL is direct afhankelijk van de hoeveelheid bij de DED-filamenten en de daaropvolgende hoeveelheid geassembleerde procaspase-8/c-FLIPL heterodimeren19. Lage of intermediaire concentraties c-FLIPL bij de DISC resulteren in voldoende hoeveelheden procaspase-8/c-FLIPL heterodimeren bij het DED-filament, wat de activering van caspase-8 ondersteunt. Daarentegen leiden verhoogde hoeveelheden c-FLIPL direct tot de anti-apoptotische effecten op de DISC20.

Alles bij elkaar genomen is de activering en verwerking van procaspase-8a/b bij de DISC een sterk gereguleerd proces dat verschillende stappen omvat. Dit artikel bespreekt de meting van procaspase-8-verwerking direct op de DISC en de analyse van de samenstelling van dit complex. Dit zal worden gepresenteerd met behulp van CD95 DISC als het voorbeeldige DR-complex.

Protocol

T-cel experimenten werden uitgevoerd volgens de ethische overeenkomst 42502-2-1273 Uni MD. 1. Cellen voorbereiden voor het experiment OPMERKING: Het gemiddelde aantal cellen voor deze immunoprecipitatie is 1 × 107. Adherente cellen moeten een dag voor het experiment worden gezaaid, zodat er op de dag van het experiment 1 ×10 7 cellen zijn. Hechte cellen voorbereiden voor het experiment Zaad 5-8 × 106 …

Representative Results

Om caspase-8-rekrutering voor de DISC en de verwerking ervan op de CD95 DISC te analyseren, beschrijft dit artikel een klassieke workflow, die IP van de CD95 DISC combineert met western blot-analyse. Dit maakt de detectie van verschillende belangrijke kenmerken van caspase-8 activering op de DISC mogelijk: de assemblage van het caspase-8-activerende macromoleculaire platform, rekrutering van procaspase-8 voor de DISC en de verwerking van deze initiator caspase (Figuur 1 en <strong class="xfi…

Discussion

Deze benadering werd voor het eerst beschreven door Kischkel et al.27 en is sindsdien met succes ontwikkeld door verschillende groepen. Verschillende belangrijke kwesties moeten worden overwogen voor efficiënte DISC-immunoprecipitatie en monitoring caspase-8-verwerking in dit complex.

Ten eerste is het essentieel om alle wasstappen tijdens immunoprecipitatie te volgen. Vooral belangrijk zijn de laatste wasstappen van de sepharose kralen en het drogen van de sepharose k…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We erkennen de Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), het Center of Dynamic Systems (CDS), gefinancierd door het EU-programma EFRO (European Regional Development Fund) en de DFG (LA 2386) voor het ondersteunen van ons werk. We bedanken Karina Guttek voor het ondersteunen van onze experimenten. We erkennen Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) voor het leveren van primaire T-cellen.

Materials

12.5% SDS gel self made for two separating gels:
3.28 mL distilled H2O
2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M
4.06 mL acrylamide
100 µL 10% SDS
100 µL 10% APS
7.5 µL TEMED

for two collecting gels:
3.1 mL distilled H2O
1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M
0.5 mL acrylamide
50 µL 10% SDS
25 µL 10% APS
7.5 µL TEMED
14.5 cm cell dishes Greiner 639160
acrylamide Carl Roth A124.1
anti-actin Ab Sigma Aldrich A2103 dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo ALX-805-038-C100 used only for immunoprecipitation
anti-caspase-10 Ab Biozol MBL-M059-3 dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Ab cell signaling 9662 S dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15 provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO ALX-804-242-C100 dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab Santa Cruz sc-715 dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO ALX-804-961-0100 dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO ADI-AAM-212-E dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab cell signaling 9542 dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APS Carl Roth 9592.3
β-mercaptoethanol Carl Roth 4227.2
Bradford solution
Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml
Bio Rad 500-0006 used according to manufacturer's instructions
CD95L provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO ALX-522-020-C005
chemoluminescence detector
Chem Doc XRS+
Bio Rad
cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) Sigma Aldrich 11 836 145 001 prepared according to manufacturer's instructions
DPBS (10x) w/o Ca, Mg PAN Biotech P04-53500 dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge
eletrophoresis buffer self made 10x electrophoresis buffer:
60.6 g Tris
288 g glycine
20 g SDS
ad 2 L H2O
1:10 dilution before usage
glycine Carl Roth 3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRP SouthernBiotech 1070-05 dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-05 dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRP SouthernBiotech 4030-05 dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk
Interleukin-2 Human(hIL-2) Merckgroup/ Roche 11011456001 for activation of T cells
KCl Carl Roth 6781.2
KH2PO4 Carl Roth 3904.1
loading buffer
4x Laemmli Sample Buffer,10 mL
Bio Rad 161-0747 prepared according to manufacturer's instructions
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUFO500
lysis buffer self made 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M
27.5 mL NaCl; 5 M
10 mL EDTA; 2 mM
100 mL Triton X-100
add 960 mL H2O
medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,  2,438 g/L PAN Biotech P04-41154 adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium
medium for primary T cells gibco by Life Technologie 21875034 adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium
milk powder Carl Roth T145.4
Na2HPO4 Carl Roth P030.3
NaCl Carl Roth 3957.2
PBST self made 20x PBST:
230 g NaCl
8 g KCl
56.8 g Na2HPO4
8 g KH2PO4
20 mL Tween-20
ad 2 L H2O
dilution 1:20 before usage
PBST + 5% milk self made 50 g milk powder + 1 L PBST
PHA Thermo Fisher Scientific R30852801 for actavation of T ells
Power Pac HC Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue Bio Rad 161-0373 use between 3-5 µL
Protein A Sepharose CL-4B beads Novodirect/ Th.Geyer GE 17-0780-01 affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions
scraper VWR 734-2602
SDS Carl Roth 4360.2
shaker Heidolph
sodium azide Carl Roth K305.1
TEMED Carl Roth 2367.3
Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks Bio Rad 170-4270 used according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer Bio Rad 10026938 prepared according to manufacturer's instructions
TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane Bio Rad 170-4270 used according to manufacturer's instructions
Trans-Blot-Turbo Bio Rad
Tris Chem Solute 8,08,51,000
Triton X-100 Carl Roth 3051.4
Tween-20 Pan Reac Appli Chem A4974,1000

References

  1. Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
  2. Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
  3. Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
  4. Fu, T. -. M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
  5. Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
  6. Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  7. Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
  8. Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
  9. Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
  10. Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
  11. Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
  12. Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
  13. Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
  14. Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
  15. Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
  16. Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
  17. Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
  18. Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
  19. Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
  20. Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
  21. Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
  22. Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
  23. Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
  24. Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
  25. Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
  26. Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
  27. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  28. Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
  29. Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).

Play Video

Cite This Article
Hillert-Richter, L. K., Lavrik, I. N. Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex. J. Vis. Exp. (174), e62842, doi:10.3791/62842 (2021).

View Video