מדידת הרכב של CD95 מוות גרימת איתות מורכב ועיבוד של Procaspase-8 במתחם זה
Summary
כאן, מוצגת זרימת עבודה ניסיונית המאפשרת זיהוי של עיבוד caspase-8 ישירות בקומפלקס האיתות מעורר המוות (DISC) וקובעת את ההרכב של קומפלקס זה. למתודולוגיה זו יש יישומים רחבים, החל מחשיפת המנגנונים המולקולריים של נתיבי מוות תאים ועד למודל הדינמי של רשתות אפופטוזיס.
Abstract
אפופטוזיס Extrinsic הוא בתיווך על ידי ההפעלה של קולטני מוות (DRs) כגון CD95 /Fas/APO-1 או גידול נמק הקשורים אפופטוזיס-גרימת ליגנד (TRAIL)-קולטן 1/קולטן 2 (TRAIL-R1/R2). גירוי של קולטנים אלה עם ליגנדים מודעים שלהם מוביל להרכבה של תסביך איתות גרימת מוות (DISC). ה-DISC כולל את DR, חלבון המתאם Fas הקשור לתחום המוות (FADD), פרוקספסות-8/-10, ואינטרלוקין דמוי FADD תאי (IL)-1β הממיר חלבונים מעכבי אנזימים (c-FLIPs). הדיסק משמש כפלטפורמה לעיבוד והפעלה של פרוקספאז-8. זה האחרון מתרחש באמצעות דימרציה שלה / אוליגומריזציה בתחום אפקט המוות (DED) חוטים שהורכבו בדיסק.
הפעלה של procaspase-8 מלווה בעיבוד שלה, אשר מתרחשת במספר שלבים. בעבודה זו, מתוארת זרימת עבודה ניסיונית מבוססת המאפשרת מדידה של היווצרות דיסק ועיבוד של פרוקספאז-8 במתחם זה. זרימת העבודה מבוססת על טכניקות אימונופרציפיטציה הנתמכות על-ידי ניתוח כתם מערבי. זרימת עבודה זו מאפשרת ניטור זהיר של שלבים שונים של גיוס procaspase-8 ל- DISC ועיבודו והיא רלוונטית מאוד לחקירת מנגנונים מולקולריים של אפופטוזיס קיצוני.
Introduction
אחד קולטני המוות הנחקרים ביותר (DRs) הוא CD95 (פאס, APO-1). המסלול האפופטוטי הקיצוני מתחיל באינטראקציה של ה- DR עם ליגנד הקוגנייט שלו, כלומר, CD95L מקיים אינטראקציה עם CD95 או TRAIL נקשר ל- TRAIL-Rs. התוצאה היא היווצרות הדיסק ב- DR. DISC המתאים מורכב CD95, FADD, פרוקספאז-8/-10, וחלבוני C-FLIP1,2. יתר על כן, הדיסק מורכב על ידי אינטראקציות בין חלבונים המכילים תחום מוות (DD), כגון CD95 ו- FADD, וחלבונים המכילים DED כגון FADD, פרוקספסאז-8/-10 ו- c-FLIP (איור 1). Procaspase-8 עובר אוליגומריזציה באמצעות שיוך של DDs שלה, וכתוצאה מכך היווצרות של חוטי DED, ואחריו הפעלה ועיבוד פרוקספאז-8. הדבר מעורר מפל מפל, מה שמוביל למוות תאי (איור 1)3,4. לכן, procaspase-8 הוא יזם מרכזי caspase של מסלול אפופטוזיס extrinsic בתיווך CD95 או TRAIL-Rs, מופעל בפלטפורמה המקרומולקולרית המתאימה, דיסק.
שני איזופורמים של פרוקספאז-8, כלומר פרוקספאז-8a (p55) ו -8b (p53), ידועים שגויסו ל- DISC5. שני האיזופורמים מורכבים משני מקרים של נזיפה. DED1 ו- DED2 ממוקמים בחלק N-terminal של procaspase-8a/b ואחריו הדומיינים הקטליטיים p18 ו- p10. ניתוח מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית מפורטת (cryo-EM) של ממסמכים מזהים פרוקספצאז-8 גילה את ההרכבה של חלבוני פרוקספאז-8 למבנים חוטיים הנקראים חוטי DED4,6. למרבה הפלא, רשתות הפרוקספסאז-8 הליניאריות הוצעו בתחילה לעסוק בדימרציה ואחריה הפעלת פרוקספסאז-8 בדיסק. עכשיו, זה ידוע כי רשתות אלה הם רק תת מבנה של חוט DED procaspase-8, האחרון מורכב שלוש שרשראות התאספו סליל משולש3,4,6,7.
עם עמעום בסימת DED, שינויים קונפורמציה procaspase-8a/b להוביל להיווצרות של המרכז הפעיל של procaspase-8 והפעלתו3,8. לאחר מכן עיבוד procaspase-8, אשר מתווך באמצעות שני מסלולים: הראשון עובר דרך הדור של מוצר מחשוף p43/p41 והשני באמצעות הדור הראשוני של מוצר מחשוף p30. מסלול p43/p41 הוא ביוזמת מחשוף של פרוקספז-8a/b ב Asp374, וכתוצאה מכך p43/p41 ו p12 מחשוף מוצרים(איור 2). יתר על כן, שברים אלה הם אוטומטית קטליטית בקע ב Asp384 ו Asp210/216, מה שמוליד היווצרות של הטרוטרמר קפסטה פעיל-8, p102/p1829,10,11. בנוסף, הוכח כי במקביל למסלול העיבוד p43/p41, פרוקספז-8a/b מבקע גם ב-Asp216, מה שמוביל להיווצרותו של מוצר המחשוף C-terminal p30, ואחריו הפרוטאוליזה שלו ל-p10 ו-p1810 (איור 2).
הפעלה של פרוקספאז-8a/b בסיבי DED מוסדרת בקפדנות על ידי חלבונים הנקראים c-FLIPs12. חלבוני C-FLIP מופיעים בשלושה איזופורמים: C-FLIPלונג (c-FLIPL),C-FLIPShort (c-FLIPS)ו-C-FLIPRaji (c-FLIPR). כל שלושת האיזופורמים מכילים שני מקרים של פענוחים באזור N-terminal שלהם. c-FLIPL כולל גם תחום דמוי קפטאז12,13. שני האיזופורמים הקצרים של C-FLIP-C-FLIPS ו- c-FLIPR– פועלים באופן אנטי-אפופטוטי על ידי שיבוש היווצרות חוט DED בדיסק6,14,15. בנוסף, c-FLIPL יכול לווסת את הפעלת caspase-8 באופן תלוי ריכוז. זה יכול לגרום הן אפקטים פרו-אנטיאפופטוטיים 16,17,18. על ידי יצירת פרוקספאז פעיל קטליטית-8/c-FLIPL הטרודימר, c-FLIPL מוביל לייצוב של המרכז הפעיל של פרוקספז-8 והפעלתו. הפונקציה pro- או אנטי אפופטוטי של c-FLIPL תלויה ישירות בכמות שלה בסיבי DED ואת הכמות הבאה של procaspase-8/c-FLIPL הטרודימרים19. ריכוזים נמוכים או בינוניים של C-FLIPL בדיסק גורמים לכמויות מספיקות של הטרודימרים פרוקספאז-8/c-FLIPL בסיעת DED, התומכת בהפעלה של caspase-8. לעומת זאת, כמויות מוגברות של c-FLIPL מובילות ישירות להשפעות האנטי-אפופטוטיות שלה בדיסק20.
יחד, ההפעלה ועיבוד של procaspase-8a/b בדיסק הוא תהליך מוסדר מאוד הכולל מספר שלבים. מאמר זה דן במדידת עיבוד procaspase-8 ישירות בדיסק, כמו גם בניתוח הרכב של קומפלקס זה. פעולה זו תוצג באמצעות תקליטור CD95 כמתחם DR למופת.
Protocol
Representative Results
Discussion
גישה זו תוארה לראשונה על ידי Kischkel ואח’27 ופותחה בהצלחה מאז על ידי מספר קבוצות. מספר נושאים חשובים יש לשקול עבור יעיל דיסק-immunoprecipitation וניטור בעיבוד caspase-8 במתחם זה.
ראשית, זה חיוני כדי לעקוב אחר כל שלבי הכביסה במהלך immunoprecipitation. חשוב במיוחד הם צעדי הכביסה הסופיים של ח?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בקרן וילהלם סנדר (2017.008.02), המרכז למערכות דינמיות (CDS), הממומן על ידי תוכנית האיחוד האירופי ERDF (הקרן האירופית לפיתוח אזורי) ו- DFG (LA 2386) לתמיכה בעבודתנו. אנו מודים לקרינה גוטק על תמיכתה בניסויים שלנו. אנו מודים לפרופ’ דירק ריינהולד (OvGU, מגדבורג) על כך שסיפק לנו תאי T ראשוניים.
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -. M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
