CD95 Ölüme Neden Olan SinyalIzasyon Kompleksinin Bileşiminin Ölçülmesi ve Procaspase-8'in Bu Komplekste İşleniş
Summary
Burada, doğrudan ölüme neden olan sinyal kompleksinde (DISC) caspase-8 işlemenin algılanmasını sağlayan ve bu kompleksin bileşimini belirleyen deneysel bir iş akışı sunulmaktadır. Bu metodoloji, hücre ölüm yollarının moleküler mekanizmalarının çözülmesinden apoptoz ağlarının dinamik modellemesine kadar geniş uygulamalara sahiptir.
Abstract
Dış apoptoz, CD95/Fas/APO-1 veya tümör nekroz faktörüne bağlı apoptoz indükleyici ligand (TRAIL)-reseptör 1/reseptör 2 (TRAIL-R1/R2) gibi ölüm reseptörlerinin (DR) aktivasyonu ile aracılık eder. Bu reseptörlerin konyak ligandları ile uyarılması, ölüme neden olan sinyal kompleksinin (DISC) montajına yol açar. DISC, ölüm etki alanı (FADD), prokaspazlar-8/-10 ve hücresel FADD benzeri interlökin (IL)-1β dönüştürücü enzim inhibitör proteinleri (c-FLIP’ler) ile Fas ilişkili protein olan DR’den oluşur. DISC, procaspase-8 işleme ve etkinleştirme için bir platform görevi görür. İkincisi, DISC’de bir araya getirilen ölüm efektörü etki alanı (DED) filamentlerinde küçültme/oligomerizasyon yoluyla gerçekleşir.
Procaspase-8’in aktivasyonu, birkaç adımda gerçekleşen işlenmesi ile takip edilir. Bu çalışmada, bu komplekste DISC oluşumunun ölçülmesine ve procaspaz-8’in işlenmesine olanak sağlayan yerleşik bir deneysel iş akışı açıklanmaktadır. İş akışı, batı blot analizi tarafından desteklenen immün önksepitasyon tekniklerine dayanmaktadır. Bu iş akışı, DISC’ye prokaspaz-8 işe alımının farklı adımlarının ve işlenmesinin dikkatli bir şekilde izlenmesine izin verir ve dışsal apoptozun moleküler mekanizmalarını araştırmak için son derece önemlidir.
Introduction
En iyi çalışılan ölüm reseptörlerinden (DR) biri CD95’tir (Fas, APO-1). Dışsal apoptotik yol, DR’nin konyak ligand ile etkileşimi ile başlar, yani CD95L, CD95 veya TRAIL-Rs’ye bağlanır. Bu, ilgili DR. DISC’de DİSK oluşumu ile sonuçlanır CD95, FADD, procaspaz-8/-10 ve c-FLIP proteinleri1,2‘den oluşur. Ayrıca, DISC, CD95 ve FADD gibi ölüm alanı (DD) içeren proteinler ile FADD, procaspase-8/-10 ve c-FLIP gibi DED içeren proteinler arasındaki etkileşimlerle bir araya getirilir (Şekil 1). Procaspase-8, DED’lerinin ilişkilendirilmesi yoluyla oligomerizasyondan geçer, bu da DED filamentlerinin oluşumuna ve ardından prokaspaz-8 aktivasyonu ve işlenmesine neden olarak ortaya çıkır. Bu, hücre ölümüne yol açan bir kaspaz kaskad tetikler (Şekil 1)3,4. Bu nedenle, prokaspaz-8, ILGILI makromoleküler platform DISC’de etkinleştirilen CD95 veya TRAIL-Rs tarafından aracılık edilen dış apoptoz yolunun merkezi bir başlatıcı kaspazıdır.
İki procaspase-8 izoformunun, yani procaspase-8a (p55) ve -8b ‘nin (p53), DISC5’ealındığı bilinmektedir. Her iki izoform da iki DED’den oluşur. DED1 ve DED2, prokaspaz-8a/b’nın N-terminal kısmında ve ardından katalitik p18 ve p10 etki alanlarında bulunur. Prokaspaz-8 DED’lerin detaylı kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) analizi, prokaspaz-8 proteinlerinin DED filamentleri4,6adı verilen filamentli yapılara bir araya topladığını ortaya koydu. Dikkat çekici bir şekilde, doğrusal prokaspaz-8 zincirlerinin başlangıçta dimerizasyon ve ardından DISC’de prokaspaz-8 aktivasyonu ile meşgul olduğu öne sürüldü. Şimdi, bu zincirlerin prokaspaz-8 DED filamentinin sadece bir alt yapısı olduğu bilinmektedir, ikincisi üçlü sarmal3, 4,6,7içine monte edilmiş üç zincirden oluşur.
DED filamentinde küçültme üzerine, prokaspaz-8a/b’daki konformasyonel değişiklikler prokaspaz-8’in aktif merkezinin oluşumuna ve aktivasyonuna yol açar3,8. Bunu, iki yoldan aracılık edilen procaspase-8 işleme takip eder: birincisi bir p43 / p41 dekolte ürününün üretimi ve ikincisi bir p30 dekolte ürününün ilk neslinden geçer. p43/p41 yolu, Asp374’te prokaspaz-8a/b’nın bölünmesiyle başlatılır ve p43/p41 ve p12 bölünme ürünleriyle sonuçlanır (Şekil 2). Ayrıca, bu parçalar Asp384 ve Asp210/216’da otomatik olarak bölünür ve aktif kaspaz-8 heterotetramer, p102/p18 29,10,11oluşumuna neden olarak. Ek olarak, p43/p41 işleme yoluna paralel olarak, Procaspase-8a/b’nın da Asp216’da bölündlüğü, bu da C-terminal bölünme ürünü p30’un oluşumuna yol açar, ardından proteolizi p10 ve p1810’a (Şekil 2).
DED filamentinde procaspase-8a/b aktivasyonu kesinlikle c-FLIPs12adlı proteinler tarafından düzenlenir. c-FLIP proteinleri üç izoformda oluşur: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)ve c-FLIPRaji (c-FLIPR). Her üç izoform da N-terminal bölgelerinde iki DED içerir. c-FLIPL ayrıca C-terminal katalitik olarak aktif olmayan kaspaz benzeri etki alanı12,13 ‘esahiptir. C-FLIP-c-FLIPS ve c-FLIPR’ninher iki kısa izoformu da DISC6, 14,15’teDED filament oluşumunu bozarak anti-apoptotik bir şekilde hareket eder. Ek olarak, c-FLIPL kaspaz-8 aktivasyonunu konsantrasyona bağlı bir şekilde düzenleyebilir. Bu hem pro- hem de anti-apoptotik etkilere neden olabilir16,17,18. Katalitik olarak aktif prokaspaz-8/c-FLIPL heterodimerini oluşturan c-FLIPL, prokaspaz-8’in aktif merkezinin stabilizasyonuna ve aktivasyonuna yol açar. c-FLIPL’nin pro-veya anti-apoptotik işlevi doğrudan DED filamentlerindeki miktarına ve sonraki monte edilmiş prokaspaz-8/c-FLIPL heterodimers19miktarına bağlıdır. DISC’deki düşük veya ara c-FLIPL konsantrasyonları, kaspaz-8’in aktivasyonunu destekleyen DED filamentinde yeterli miktarda prokaspaz-8/c-FLIPL heterodimer ile sonuçlanır. Buna karşılık, artan c-FLIPL miktarları doğrudan DISC20’deanti-apoptotik etkilerine yol açar.
Birlikte ele alındığında, DISC’de procaspase-8a/b’nın etkinleştirilmesi ve işlenmesi, birkaç adımı içeren son derece düzenlenmiş bir süreçtir. Bu makalede, prokaspaz-8 işleminin doğrudan DISC’de ölçülmesi ve bu kompleksin bileşiminin analizi tartışılmaktadır. Bu, örnek DR kompleksi olarak CD95 DISC kullanılarak sunulacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yaklaşım ilk olarak Kischkel ve ark.27 tarafından tanımlanmıştır ve o zamandan beri birkaç grup tarafından başarıyla geliştirilmiştir. Bu komplekste etkili DISC-immün önsepitasyon ve izleme kaspaz-8 işleme için birkaç önemli konu göz önünde bulundurulmalıdır.
İlk olarak, immün önseçme sırasında tüm yıkama adımlarını takip etmek önemlidir. Özellikle önemli olan sepharose boncuklarının son yıkama adımları ve sepharose boncukla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışmalarımızı desteklediği için AB programı ERDF (Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu) ve DFG (LA 2386) tarafından finanse edilen Wilhelm Sander Vakfı (2017.008.02), Dinamik Sistemler Merkezi ‘ni (CDS) kabul ediyoruz. Karina Guttek’e deneylerimizi desteklediği için teşekkür ederiz. Prof. Dirk Reinhold’u (OvGU, Magdeburg) bize birincil T hücreleri sağladığı için kabul ediyoruz.
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -. M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
