Medición de la composición del complejo de señalización inductor de muerte CD95 y procesamiento de la procaspasa-8 en este complejo
Summary
Aquí, se presenta un flujo de trabajo experimental que permite la detección del procesamiento de caspasa-8 directamente en el complejo de señalización inductor de muerte (DISC) y determina la composición de este complejo. Esta metodología tiene amplias aplicaciones, desde desentrañar los mecanismos moleculares de las vías de muerte celular hasta el modelado dinámico de las redes de apoptosis.
Abstract
La apoptosis extrínseca está mediada por la activación de receptores de muerte (DR) como CD95 / Fas / APO-1 o ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL) receptor 1 / receptor 2 (TRAIL-R1 / R2). La estimulación de estos receptores con sus ligandos cognados conduce al ensamblaje del complejo de señalización inductor de muerte (DISC). DISC comprende DR, la proteína adaptadora asociada a Fas con dominio de la muerte (FADD), procaspasas-8/-10 y proteínas inhibidoras de enzimas convertidoras de interleucina (IL)-1β similares a FADD celulares (c-FLP). El DISC sirve como plataforma para el procesamiento y la activación de la procaspasa-8. Este último ocurre a través de su dimerización/oligomerización en los filamentos del dominio efector de la muerte (DED) ensamblados en el DISC.
La activación de la procaspasa-8 es seguida por su procesamiento, que ocurre en varios pasos. En este trabajo se describe un flujo de trabajo experimental establecido que permite la medición de la formación de DISC y el procesamiento de la procaspasa-8 en este complejo. El flujo de trabajo se basa en técnicas de inmunoprecipitación apoyadas por el análisis de western blot. Este flujo de trabajo permite un seguimiento cuidadoso de los diferentes pasos del reclutamiento de la procaspasa-8 para el DISC y su procesamiento y es muy relevante para investigar los mecanismos moleculares de la apoptosis extrínseca.
Introduction
Uno de los receptores de muerte (DR) mejor estudiados es CD95 (Fas, APO-1). La vía apoptótica extrínseca comienza con la interacción de la DR con su ligando cognado, es decir, CD95L interactúa con CD95 o TRAIL se une a TRAIL-Rs. Esto da como resultado la formación del DISC en el DR. DISC correspondiente consiste en cd95, FADD, procaspasa-8/-10 y proteínas c-FLIP1,2. Además, el DISC se ensambla mediante interacciones entre proteínas que contienen dominio de muerte (DD), como CD95 y FADD, y proteínas que contienen DED como FADD, procaspasa-8/-10 y c-FLIP(Figura 1). La procaspasa-8 sufre oligomerización a través de la asociación de sus DED, lo que resulta en la formación de filamentos DED, seguidos de la activación y el procesamiento de la procaspasa-8. Esto desencadena una cascada de caspasa, que conduce a la muerte celular(Figura 1)3,4. Así, la procaspasa-8 es una caspasa iniciadora central de la vía de apoptosis extrínseca mediada por CD95 o el TRAIL-R, activada en la plataforma macromolecular correspondiente, DISC.
Se sabe que dos isoformas de la procaspasa-8, a saber, la procaspasa-8a (p55) y la -8b (p53), se reclutan para el DISC5. Ambas isoformas comprenden dos DED. DED1 y DED2 se encuentran en la parte N-terminal de la procaspasa-8a/b seguida de los dominios catalítico p18 y p10. El análisis detallado de microscopía crioelectrónica (crio-EM) de los DED de procaspasa-8 reveló el ensamblaje de proteínas de procaspasa-8 en estructuras filamentosas llamadas filamentos DED4,6. Sorprendentemente, inicialmente se sugirió que las cadenas lineales de procaspasa-8 participaran en la dimerización seguida de la activación de la procaspasa-8 en el DISC. Ahora bien, se sabe que esas cadenas son sólo una subestructura del filamento DED procaspasa-8, este último compuesto por tres cadenas ensambladas en una triple hélice3,4,6,7.
Tras la dimerización en el filamento DED, los cambios conformacionales en la procaspasa-8a/b conducen a la formación del centro activo de la procaspasa-8 y su activación3,8. Esto es seguido por el procesamiento de la procaspasa-8, que está mediado por dos vías: la primera va a través de la generación de un producto de escisión p43 / p41 y la segunda a través de la generación inicial de un producto de escisión p30. La vía p43/p41 se inicia por la escisión de la procaspasa-8a/b en Asp374, dando como resultado productos de escisión p43/p41 y p12 (Figura 2). Además, estos fragmentos se escindieron autocatalíticamente en Asp384 y Asp210/216, dando lugar a la formación del heterotetrámero activo caspasa-8, p102/ p1829,10,11. Además, se demostró que en paralelo a la vía de procesamiento p43/p41, la procaspasa-8a/b también se escinde en Asp216, lo que conduce a la formación del producto de escisión C-terminal p30, seguido de su proteólisis a p10 y p1810 (Figura 2).
La activación de la procaspasa-8a/b en el filamento DED está estrictamente regulada por proteínas llamadas c-FLIPs12. Las proteínas c-FLIP se encuentran en tres isoformas: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)y c-FLIPRaji (c-FLIPR). Las tres isoformas contienen dos DED en su región N-terminal. c-FLIPL también tiene un dominio similar a la caspasa catalíticamente inactivo C-terminal12,13. Ambas isoformas cortas de c-FLIP-c-FLIPS y c-FLIPR-actúande manera antiapoptótica al interrumpir la formación de filamentos DED en el DISC6,14,15. Además, c-FLIPL puede regular la activación de la caspasa-8 de una manera dependiente de la concentración. Esto puede resultar en efectos pro- y anti-apoptóticos16,17,18. Al formar el heterodímero de procaspasa-8/c-FLIPL catalíticamente activo, c-FLIPL conduce a la estabilización del centro activo de la procaspasa-8 y su activación. La función pro- o anti-apoptótica de c-FLIPL depende directamente de su cantidad en los filamentos DED y la cantidad posterior de heterodímeros de procaspasa-8/c-FLIPL ensamblados19. Las concentraciones bajas o intermedias de c-FLIPL en el DISC dan como resultado cantidades suficientes de heterodímeros de procaspasa-8/c-FLIPL en el filamento DED, que apoya la activación de la caspasa-8. En contraste, el aumento de las cantidades de c-FLIPL conduce directamente a sus efectos antiapoptóticos en el DISC20.
En conjunto, la activación y el procesamiento de la procaspasa-8a / b en el DISC es un proceso altamente regulado que implica varios pasos. Este artículo discute la medición del procesamiento de la procaspasa-8 directamente en el DISC, así como el análisis de la composición de este complejo. Esto se presentará utilizando CD95 DISC como el complejo de DR ejemplar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este enfoque fue descrito por primera vez por Kischkel et al.27 y ha sido desarrollado con éxito desde entonces por varios grupos. Se deben considerar varias cuestiones importantes para la eficiencia de la inmunoprecipitación DISC y el monitoreo del procesamiento de la caspasa-8 en este complejo.
En primer lugar, es esencial seguir todos los pasos de lavado durante la inmunoprecipitación. Especialmente importantes son los pasos finales de lavado de las cuentas de sef…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos a la Fundación Wilhelm Sander (2017.008.02), al Centro de Sistemas Dinámicos (CDS), financiado por el programa de la UE FEDER (Fondo Europeo de Desarrollo Regional) y al DFG (LA 2386) por apoyar nuestro trabajo. Agradecemos a Karina Guttek por apoyar nuestros experimentos. Reconocemos al Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburgo) por proporcionarnos células T primarias.
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -. M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
