이 단지에서 CD95 사망 유도 신호 복합체 및 프로카스파스-8의 처리 구성 측정
Summary
여기서, 죽음을 유도하는 신호 복합체(DISC)에서 직접 카스파제-8 처리를 감지하고 이 복합체의 조성을 결정하는 실험 워크플로우가 제시된다. 이 방법론은 세포 사멸 경로의 분자 메커니즘을 해명에서 세포 사멸 네트워크의 동적 모델링에 이르기까지 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있습니다.
Abstract
외래 세포멸은 CD95/Fas/APO-1 또는 종양 괴사 인자-유도 리간드(TRAIL)-수용체 1/수용체 2(TRAIL-R1/R2)와 같은 사망 수용체(DRs)의 활성화에 의해 중재된다. 그들의 cognate 리간드로 이 수용체의 자극은 죽음을 유도하는 신호 복합체 (DISC)의 조립으로 이끌어 냅니다. DISC는 DR, 어댑터 단백질 Fas-연관 단백질을 데스 도메인(FADD), procaspases-8/-10, 및 세포 FADD 와 같은 인터류신(IL)-1β 변환 효소 억제 단백질(c-FLIPs)으로 포함한다. DISC는 procaspase-8 처리 및 활성화를 위한 플랫폼 역할을 합니다. 후자는 디스크에 조립된 데스 이펙터 도메인(DED) 필라멘트의 이질/올리고머화를 통해 발생합니다.
procaspase-8의 활성화는 여러 단계에서 발생하는 처리 뒤에 있습니다. 이 작업에서는 이 컴플렉스에서 DISC 형성 및 프로카스파스-8의 처리를 측정할 수 있는 확립된 실험 워크플로우가 설명되어 있습니다. 워크플로는 서양 얼룩 분석에 의해 지원되는 면역 침전 기술을 기반으로 합니다. 이 워크플로우를 통해 DISC 및 그 처리에 대한 다양한 단계의 procaspase-8 모집을 주의 깊게 모니터링할 수 있으며 외외 세포멸의 분자 메커니즘을 조사하는 데 매우 관련이 있습니다.
Introduction
가장 잘 연구 된 죽음 수용체 중 하나 (DRs) CD95 (Fas, APO-1). 외래 식수 막멸 경로는 COgnate 리간드, 즉 CD95L과 상호 작용하거나 TRAIL-Rs에 결합하는 DR의 상호 작용으로 시작됩니다. 이 결과 해당 DR. DISC에서 디스크의 형성은 CD95, FADD, procaspase-8/-10 및 c-FLIP 단백질1,2로구성된다. 더욱이, DISC는 CD95 및 FADD와 같은 데스 도메인(DD)-함유 단백질, 및 FADD, procaspase-8/-10 및 c-FLIP(도1)와같은 DED 함유 단백질 간의 상호 작용에 의해 조립된다. Procaspase-8은 DEDs의 협회를 통해 올리고머화를 거치며 DED 필라멘트의 형성을 초래하고 procaspase-8 활성화 및 처리가 뒤따릅니다. 이것은 세포 사멸로 이끌어 내는 caspase 폭포를 트리거합니다(그림 1)3,4. 따라서, procaspase-8은 CD95 또는 TRAIL-Rs에 의해 매개되는 외외 세포사멸 경로의 중앙 시인터 카스파제이며, 해당 거대 분자 플랫폼, DISC에서 활성화된다.
procaspase-8의 2개의 등소 형태, 즉 procaspase-8a (p55) 및 -8b (p53), DISC5에모집되는 것으로 알려져 있습니다. 두 등도 형태 모두 두 개의 DED를 포함한다. DED1 및 DED2는 프로카스파스-8a/b의 N 단말 부분에 위치하고 있으며 촉매 p18 및 p10 도메인이 뒤따릅니다. procaspase-8 DEDs의 상세한 극저온 전자 현미경 검사법 (cryo-EM) 분석은 DED 필라멘트4,6에게불린 필라멘트 구조물로 procaspase-8 단백질의 조립을 밝혔습니다. 놀랍게도, 선형 procaspase-8 체인은 처음에 DISC에서 procaspase-8 활성화에 선행된 이질에 종사하는 것이 제안되었습니다. 지금, 그 체인은 procaspase-8 DED 필라멘트의 하위 구조, 세 개의 나선으로 조립 된 세 개의 체인을 포함하는 후자는 알려져 있다3,4,6,7.
DED 필라멘트에서 분화하면, 프로카스파스-8a/b의 형성적 변화는 프로카스파스-8의 활성 센터형성과 활성화3,8로이어진다. 이것은 두 개의 경로를 통해 매개되는 procaspase-8 처리에 선행됩니다: 첫번째는 p43/p41 분열 제품의 생성을 통해 가고 p30 분열 제품의 초기 생성을 통해 두 번째. p43/p41 통로는 Asp374에서 procaspase-8a/b의 분열에 의해 개시되어 p43/p41 및 p12 분열제품(그림 2)을초래한다. 또한, 이들 단편은 Asp384 및 Asp210/216에서 자동 촉매로 갈라져 활성 카스파스-8 이테로테트라머, p10 2/p1829,10,11의형성을초래한다. 또한, 처리의 p43/p41 경로에 병행하여, procaspase-8a/b는 또한 아스p216에서 절단되어 C-단말 분열 제품 p30의 형성으로 이어지고, 그 다음으로 p10 및 p1810(도 2)에대한 프로테올리시스가 뒤따랐다.
DED 필라멘트에서 Procaspase-8a/b 활성화는 c-FLIPs12라는단백질에 의해 엄격하게 조절된다. c-FLIP 단백질은 c-FLIP Long(c-FLIP L),c-FLIP Short(c-FLIPS),c-FLIPRaji(c-FLIP R)세 가지 등등형태로 발생합니다. 세 개의 동소형태모두 N단자 지역에 2개의 DED가 포함되어 있습니다. c-FLIPL은 또한 C-단말 촉매 비활성 카스파스와 같은도메인(12,13)을가지고 있다. c-FLIP-c-FLIPS및 c-FLIPR-의짧은 동소형태는모두 DISC6,14,15에서DED 필라멘트 형성을 방해하여 반석멸 방식으로 작용한다. 또한, c-FLIPL은 농도 의존적 방식으로 카스파제-8 활성화를 조절할 수 있다. 이것은 프로- 및 반-apoptotic 효과16,17,18귀착될 수 있다. 촉매 활성 프로카스파스-8/c-FLIPL 이성애를 형성함으로써 c-FLIPL은 프로카스파스-8의 활성 중심의 안정화및 활성화로 이어집니다. c-FLIPL의 프로-또는 반-아포토틱 기능은 DED 필라멘트의 양과 조립된 procaspase-8/c-FLIPL 이종수(19)의 후속 양에 직접적으로 의존한다. 디스크에서 c-FLIPL의 낮거나 중간 농도는 caspase-8의 활성화를 지원하는 DED 필라멘트에서 충분한 양의 procaspase-8/c-FLIPL 이종수의 결과를 초래한다. 대조적으로, c-FLIPL의 증가양은 직접 DISC20에서그것의 반 자멸 효과로 이끌어 내다.
함께 촬영, 활성화 및 디스크에서 procaspase-8a/b의 처리는 여러 단계를 포함하는 매우 규제 과정이다. 이 백서에서는 DISC에서 직접 프로카스파스-8 처리의 측정과 이 복합체의 조성에 대한 분석에 대해 설명합니다. 이것은 모범적인 DR 복합체로 CD95 DISC를 사용하여 표시됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 접근법은 Kischkel 외27에 의해 처음 설명되었으며 여러 그룹에 의해 그 이후로 성공적으로 개발되었습니다. 이 복합체에서 효율적인 DISC 면역 침전 및 모니터링 caspase-8 처리를 위해 몇 가지 중요한 문제를 고려해야 합니다.
첫째, 면역 침전 중에 모든 세척 단계를 따르는 것이 필수적입니다. 특히 중요한 것은 세파로즈 구슬의 최종 세척 단계와 세파로즈 구?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 빌헬름 산더 재단 (2017.008.02), 다이나믹 시스템 센터 (CDS), 우리의 작업을 지원하기위한 유럽 프로그램 ERDF (유럽 지역 개발 기금)와 DFG (LA 2386)에 의해 투자 인정. 우리는 우리의 실험을 지원 카리나 Guttek 감사합니다. 우리는 우리에게 1 차적인 T 세포를 제공하기 위한 더크 Reinhold 교수 (OvGU, Magdeburg)를 인정합니다.
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
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