Измерение состава CD95 Индуцирующего Смерть Сигнального Комплекса и Обработка Прокаспазы-8 в этом Комплексе
Summary
Здесь представлен экспериментальный рабочий процесс, позволяющий обнаружить обработку каспазы-8 непосредственно на вызывающем смерть сигнальном комплексе (DISC) и определяющий состав этого комплекса. Эта методология имеет широкое применение, от разгадки молекулярных механизмов путей гибели клеток до динамического моделирования сетей апоптоза.
Abstract
Внешний апоптоз опосредован активацией рецепторов смерти (DR), таких как CD95/Fas/APO-1 или связанный с фактором некроза опухоли апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAIL)-рецептор 1/рецептор 2 (TRAIL-R1/R2). Стимуляция этих рецепторов их родственными лигандами приводит к сборке вызывающего смерть сигнального комплекса (DISC). DISC содержит DR, адапторный белок Fas-ассоциированный белок с доменом смерти (FADD), прокаспазы-8/-10 и клеточные FADD-подобные интерлейкин (IL)-1β-превращающие фермент-ингибирующие белки (c-FLIP). DISC служит платформой для обработки и активации прокаспазы-8. Последнее происходит через его димеризацию/олигомеризацию в нитях эффекторного домена смерти (DED), собранных на ДИСК.
Активация прокаспазы-8 сопровождается ее обработкой, которая происходит в несколько этапов. В данной работе описан налаженный экспериментальный рабочий процесс, позволяющий измерять образование DISC и обрабатывать прокаспазу-8 в данном комплексе. Рабочий процесс основан на методах иммунопреципитации, поддерживаемых анализом вестерн-блоттинга. Этот рабочий процесс позволяет тщательно контролировать различные этапы набора прокаспазы-8 в DISC и его обработку и очень актуален для исследования молекулярных механизмов внешнего апоптоза.
Introduction
Одним из наиболее изученных рецепторов смерти (DR) является CD95 (Fas, APO-1). Внешний апоптотический путь начинается с взаимодействия ДР с его родственным лигандом, т.е. CD95L взаимодействует с CD95 или TRAIL связывается с TRAIL-Rs. Это приводит к образованию DISC на соответствующем DR. DISC состоит из cd95, FADD, прокаспазы-8/-10 и c-FLIP белков1,2. Кроме того, DISC собирается путем взаимодействия между белками, содержащими домен смерти (DD), такими как CD95 и FADD, и DED-содержащими белками, такими как FADD, прокаспаза-8/-10 и c-FLIP(рисунок 1). Прокаспаза-8 подвергается олигомеризации посредством ассоциации своих DED, что приводит к образованию DED-нитей с последующей активацией и обработкой прокаспазы-8. Это запускает каскад каспазы, который приводит к гибели клеток(рисунок 1)3,4. Таким образом, прокаспаза-8 является центральным инициатором каспазы внешнего пути апоптоза, опосредованного CD95 или TRAIL-Rs, активированным на соответствующей макромолекулярной платформе, DISC.
Известно, что две изоформы прокаспазы-8, а именно прокаспаза-8а (p55) и -8b (p53), рекрутируются в DISC5. Обе изоформы состоят из двух DED. DED1 и DED2 расположены в N-концевой части прокаспазы-8a/b, за которой следуют каталитические домены p18 и p10. Детальный криоэлектронный микроскопический (крио-ЭМ) анализ DED прокаспазы-8 выявил сборку белков прокаспазы-8 в нитевидные структуры, называемыеDED-нитями 4,6. Примечательно, что первоначально предполагалось, что линейные цепи прокаспазы-8 будут заниматься димеризацией с последующей активацией прокаспазы-8 на ДИСК. Теперь известно, что эти цепи являются лишь подструктурой прокаспазы-8 ПСД, последняя состоит из трех цепей, собранных в тройнуюспираль 3,4,6,7.
При димеризации на нити DED конформационные изменения прокаспазы-8а/б приводят к образованию активного центра прокаспазы-8 и ее активации3,8. За этим следует обработка прокаспазы-8, которая опосредована двумя путями: первый идет через генерацию продукта расщепления p43 / p41, а второй – через начальное поколение продукта расщепления p30. Путь p43/p41 инициируется расщеплением прокаспазы-8a/b в Asp374, в результате чего образуются продукты расщепления p43/p41 и p12(рисунок 2). Далее эти фрагменты автокаталитически расщепляются на Asp384 и Asp210/216, давая начало образованию активного гетеротетрамера каспазы-8, p102/p1829,10,11. Кроме того, было показано, что параллельно пути обработки p43/p41 прокаспаза-8a/b также расщепляется на Asp216, что приводит к образованию продукта С-концевого расщепления p30 с последующим его протеолизом на p10 и p1810 (фиг.2).
Активация прокаспазы-8a/b в нити DED строго регулируется белками, называемыми c-FLIPs12. Белки c-FLIP встречаются в трех изоформах: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)и c-FLIPRaji (c-FLIPR). Все три изоформы содержат два DED в их N-концевой области. c-FLIPL также имеет С-концевой каталитически неактивный каспазоподобный домен12,13. Обе короткие изоформы c-FLIP-c-FLIPS и c-FLIPR-действуют антиапоптотическим образом, нарушая образование нити DED наДИСКЕ 6,14,15. Кроме того, c-FLIPL может регулировать активацию каспазы-8 в зависимости от концентрации. Это может привести как к про-, так и к антиапоптотическим эффектам16,17,18. Образуя каталитически активный гетеродимер прокаспазы-8/c-FLIPL, c-FLIPL приводит к стабилизации активного центра прокаспазы-8 и его активации. Про- или антиапоптотическая функция c-FLIPL напрямую зависит от его количества на DED нитях и последующего количества собранных гетеродимеров прокаспазы-8/c-FLIPL 19. Низкие или промежуточные концентрации c-FLIPL на DISC приводят к достаточному количеству гетеродимеров прокаспазы-8/c-FLIPL на нити DED, что поддерживает активацию каспазы-8. Напротив, увеличение количества c-FLIPL непосредственно приводит к его антиапоптотическим эффектам на DISC20.
В совокупности активация и обработка прокаспазы-8a/b на DISC представляет собой строго регулируемый процесс, включающий несколько этапов. В данной работе рассматривается измерение обработки прокаспазы-8 непосредственно на ДИСК, а также анализ состава этого комплекса. Это будет представлено с использованием CD95 DISC в качестве образцового комплекса АВАРИЙНОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот подход был впервые описан Kischkel et al.27 и с тех пор успешно разработан несколькими группами. Необходимо рассмотреть несколько важных вопросов для эффективной обработки DISC-иммунопреципитации и мониторинга каспазы-8 в этом комплексе.
Во-первых, важно соблюд?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Фонд Вильгельма Сандера (2017.008.02), Центр динамических систем (CDS), финансируемый программой ЕС ERDF (Европейский фонд регионального развития) и DFG (LA 2386) за поддержку нашей работы. Мы благодарим Карину Гуттек за поддержку наших экспериментов. Мы благодарим профессора Дирка Рейнхольда (OvGU, Магдебург) за предоставление нам первичных Т-клеток.
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -. M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
