Messung der Zusammensetzung von CD95 Death-Inducing Signaling Complex und Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex
Summary
Hier wird ein experimenteller Workflow vorgestellt, der den Nachweis der Caspase-8-Verarbeitung direkt am todesinduzierenden Signalkomplex (DISC) ermöglicht und die Zusammensetzung dieses Komplexes bestimmt. Diese Methodik hat breite Anwendungen, von der Entschlüsselung der molekularen Mechanismen von Zelltodwegen bis hin zur dynamischen Modellierung von Apoptose-Netzwerken.
Abstract
Die extrinsische Apoptose wird durch die Aktivierung von Todesrezeptoren (DRs) wie CD95/Fas/APO-1 oder Tumornekrosefaktor-bedingtem Apoptose-induzierendem Liganden (TRAIL)-Rezeptor 1/Rezeptor 2 (TRAIL-R1/R2) vermittelt. Die Stimulation dieser Rezeptoren mit ihren verwandten Liganden führt zum Aufbau des todinduzierenden Signalkomplexes (DISC). DISC umfasst DR, das Adapterprotein Fas-assoziiertes Protein mit Todesdomäne (FADD), Procaspasen-8/-10 und zelluläre FADD-ähnliche Interleukin (IL)-1β-converting enzyme-inhibitory proteins (c-FLIPs). Die DISC dient als Plattform für die Procaspase-8-Verarbeitung und -Aktivierung. Letzteres geschieht durch seine Dimerisierung / Oligomerisierung in den an der DISC zusammengesetzten Filamenten der Death Effector Domain (DED).
Auf die Aktivierung von Procaspase-8 folgt seine Verarbeitung, die in mehreren Schritten erfolgt. In dieser Arbeit wird ein etablierter experimenteller Workflow beschrieben, der die Messung der DISC-Bildung und die Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex ermöglicht. Der Workflow basiert auf Immunpräzipitationstechniken, die durch die Western-Blot-Analyse unterstützt werden. Dieser Workflow ermöglicht eine sorgfältige Überwachung verschiedener Schritte der Procaspase-8-Rekrutierung in die DISC und ihrer Verarbeitung und ist für die Untersuchung molekularer Mechanismen der extrinsischen Apoptose von hoher Relevanz.
Introduction
Einer der am besten untersuchten Todesrezeptoren (DRs) ist CD95 (Fas, APO-1). Der extrinsische apoptotische Signalweg beginnt mit der Interaktion des DR mit seinem verwandten Liganden, d.h. CD95L interagiert mit CD95 oder TRAIL bindet an TRAIL-Rs. Dies führt zur Bildung der DISC an der entsprechenden DR. DISC besteht aus CD95, FADD, Procaspase-8/-10 und c-FLIP Proteinen1,2. Darüber hinaus wird die DISC durch Wechselwirkungen zwischen Death Domain (DD)-haltigen Proteinen wie CD95 und FADD und DED-haltigen Proteinen wie FADD, Procaspase-8/-10 und c-FLIP zusammengesetzt (Abbildung 1). Procaspase-8 wird durch Assoziation seiner DEDs oligomerisiert, was zur Bildung von DED-Filamenten führt, gefolgt von procaspase-8-Aktivierung und -Verarbeitung. Dies löst eine Caspase-Kaskade aus, die zum Zelltod führt (Abbildung 1)3,4. Somit ist Procaspase-8 eine zentrale Initiator-Caspase des extrinsischen Apoptoseweges, vermittelt durch CD95 oder den TRAIL-Rs, aktiviert an der entsprechenden makromolekularen Plattform, DISC.
Es ist bekannt, dass zwei Isoformen von Procaspase-8, nämlich Procaspase-8a (p55) und -8b (p53), für die DISC5rekrutiert wurden. Beide Isoformen bestehen aus zwei DEDs. DED1 und DED2 befinden sich im N-terminalen Teil der Procaspase-8a/b, gefolgt von den katalytischen Domänen p18 und p10. Eine detaillierte Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) Analyse von Procaspase-8-DEDs ergab die Assemblierung von Procaspase-8-Proteinen zu fadenförmigen Strukturen, den sogenannten DED-Filamenten4,6. Bemerkenswerterweise wurde zunächst vorgeschlagen, dass die linearen Procaspase-8-Ketten an der Dimerisierung beteiligt sind, gefolgt von der Procaspase-8-Aktivierung an der DISC. Nun ist bekannt, dass diese Ketten nur eine Unterkonstruktion des Procaspase-8-DED-Filaments sind, das aus drei Ketten besteht, die zu einer Dreifachhelix3, 4,6,7zusammengesetzt sind.
Bei der Dimerisierung am DED-Filament führen Konformationsänderungen in der Procaspase-8a/b zur Bildung des aktiven Zentrums von Procaspase-8 und seiner Aktivierung3,8. Es folgt die Procaspase-8-Verarbeitung, die über zwei Wege vermittelt wird: Der erste geht über die Erzeugung eines p43/p41-Spaltprodukts und der zweite über die initiale Erzeugung eines p30-Spaltprodukts. Der p43/p41-Signalweg wird durch die Spaltung von Procaspase-8a/b an Asp374 eingeleitet, was zu p43/p41- und p12-Spaltprodukten führt (Abbildung 2). Ferner werden diese Fragmente bei Asp384 und Asp210/216 automatisch katalytisch gespalten, was zur Bildung des aktiven Caspase-8-Heterotetramers, p102/p1829, 10,11führt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass parallel zum p43/p41-Verarbeitungsweg auch procaspase-8a/b an Asp216 gespalten wird, was zur Bildung des C-terminalen Spaltprodukts p30 führt, gefolgt von dessen Proteolyse zu p10 und p1810 (Abbildung 2).
Die Procaspase-8a/b-Aktivierung am DED-Filament wird streng durch Proteine namens c-FLIPs12reguliert. Die c-FLIP Proteine kommen in drei Isoformen vor: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS) und c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle drei Isoformen enthalten zwei DEDs in ihrem N-terminalen Bereich. c-FLIPL hat auch eine C-terminale katalytisch inaktive Caspase-ähnliche Domäne12,13. Beide kurzen Isoformen von c-FLIP-c-FLIPS und c-FLIPRwirken anti-apoptotisch, indem sie die Bildung von DED-Filamenten an der DISC 6,14,15stören. Darüber hinaus kann c-FLIPL die Caspase-8-Aktivierung konzentrationsabhängig regulieren. Dies kann sowohl zu pro- als auch zu anti-apoptotischen Wirkungen führen16,17,18. Durch die Bildung des katalytisch aktiven Procaspase-8/c-FLIPL Heterodimers führt c-FLIPL zur Stabilisierung des aktiven Zentrums von Procaspase-8 und dessen Aktivierung. Die pro- oder anti-apoptotische Funktion von c-FLIPL ist direkt abhängig von seiner Menge an den DED-Filamenten und der anschließenden Menge an zusammengesetzten Procaspase-8/c-FLIPL Heterodimeren19. Niedrige oder mittlere Konzentrationen von c-FLIPL an der DISC führen zu ausreichenden Mengen an Procaspase-8/c-FLIP L-Heterodimeren am DED-Filament, was die Aktivierung von Caspase-8 unterstützt. Im Gegensatz dazu führen erhöhte Mengen an c-FLIPL direkt zu seiner anti-apoptotischen Wirkung an der DISC20.
Zusammengenommen ist die Aktivierung und Verarbeitung von Procaspase-8a/b am DISC ein stark regulierter Prozess, der mehrere Schritte umfasst. Dieser Beitrag diskutiert die Messung der Procaspase-8-Verarbeitung direkt am DISC sowie die Analyse der Zusammensetzung dieses Komplexes. Dies wird anhand der CD95 DISC als exemplarischem DR-Komplex präsentiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Ansatz wurde erstmals von Kischkel et al.27 beschrieben und seitdem von mehreren Gruppen erfolgreich entwickelt. Für eine effiziente DISC-Immunpräzipitation und überwachung der Caspase-8-Verarbeitung in diesem Komplex müssen mehrere wichtige Aspekte berücksichtigt werden.
Erstens ist es wichtig, alle Waschschritte während der Immunpräzipitation zu befolgen. Besonders wichtig sind die letzten Waschschritte der Sepharoseperlen und das Trocknen der Sepharosep…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Wilhelm Sander-Stiftung (2017.008.02), dem Center of Dynamic Systems (CDS), gefördert durch das EU-Programm EFRE (Europäischer Fonds für regionale Entwicklung) und der DFG (LA 2386) für die Unterstützung unserer Arbeit. Wir danken Karina Guttek für die Unterstützung unserer Experimente. Wir danken Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) für die Bereitstellung von primären T-Zellen.
Materials
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
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| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
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| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
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| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for actavation of T ells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
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