Summary
Sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD, in questo protocollo è stata sviluppata una strategia di purificazione dell'affinità modificata più concorrenza per purificare il canale Endogeno Drosophila TRP.
Abstract
La fototrasduzione della drosophila è una delle vie di segnalazione accoppiate alla proteina G più veloci conosciute. Per garantire la specificità e l'efficienza di questa cascata, il canale cationico permeabile al calcio (Ca2+), il potenziale recettore transitorio (TRP), si lega strettamente alla proteina dello scaffold, all'inattivazione-no-after-potential D (INAD) e forma un grande complesso proteico di segnalazione con proteina chinasi C (ePKC) specifica per l'occhio e fosfolipasi Cβ / Nessun potenziale recettore A (PLCβ / NORPA). Tuttavia, le proprietà biochimiche del canale TRP Drosophila rimangono poco chiare. Sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD, è stata sviluppata una strategia di purificazione dell'affinità modificata più concorrenza per purificare il canale TRP endogeno. In primo luogo, il frammento NORPA 863-1095 purificato con istidina (His) è stato legato a Ni-beads e utilizzato come esca per abbattere il complesso proteico INAD endogeno dagli omogeneizzati della testa di Drosophila. Quindi, un eccessivo frammento di glutatione S-transferasi (GST) purificato con tag TRP 1261-1275 è stato aggiunto alle ni-perline per competere con il canale TRP. Infine, il canale TRP nel surnatante è stato separato dall'eccessivo peptide TRP 1261-1275 mediante cromatografia ad esclusione dimensionale. Questo metodo consente di studiare il meccanismo di gating del canale Drosophila TRP sia da angolazioni biochimiche che strutturali. Le proprietà elettrofisiologiche dei canali TRP di Drosophila purificati possono anche essere misurate in futuro.
Introduction
La fototrasduzione è un processo in cui i fotoni assorbiti vengono convertiti in codici elettrici dei neuroni. Trasmette esclusivamente opsine e la successiva cascata di segnalazione accoppiata alla proteina G sia nei vertebrati che negli invertebrati. In Drosophila, utilizzando i suoi cinque domini PDZ, l'inattivazione della proteina scaffold-no-after-potential D (INAD) organizza un complesso di segnalazione supramolecolare, che consiste in un canale del potenziale recettore transitorio (TRP), potenziale del recettore Cβ / No della fosfolipasi A (PLCβ / NORPA) e chinasi C (ePKC) specifica dell'occhio. La formazione di questo complesso di segnalazione supramolecolare garantisce la corretta localizzazione subcellulare, l'alta efficienza e la specificità del macchinario di fototrasduzione Drosophila. In questo complesso, i canali TRP sensibili alla luce agiscono come effettori a valle del NORPA e mediano l'afflusso di calcio e la depolarizzazione dei fotorecettori. Studi precedenti hanno dimostrato che l'apertura del canale TRP di Drosophila è mediata da protoni, interruzione dell'ambiente lipidico locale o forza meccanica 2,3,4. Il canale Drosophila TRP interagisce anche con calmodulina5 ed è modulato dal calcio con feedback sia positivo che negativo 6,7,8.
Finora, gli studi di elettrofisiologia sul meccanismo di gating dei canali Drosophila TRP e TRP-like (TRPL) erano basati su patch di membrana asportate, registrazioni di cellule intere da fotorecettori Drosophila wild-type dissociati e canali etero-espressi in cellule S2, SF9 o HEK 2,9,10,11,12,13, ma non su canali purificati. Anche le informazioni strutturali del canale TRP Drosophila a lunghezza intera rimangono poco chiare. Al fine di studiare le proprietà elettrofisiologiche della proteina purificata in un ambiente di membrana ricostituito e di ottenere informazioni strutturali del canale TRP Drosophila a lunghezza intera, ottenere canali TRP purificati a lunghezza intera è il primo passo necessario, simile alle metodologie utilizzate negli studi sui canali TRP dei mammiferi 14,15,16,17.
Recentemente, sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD 18,19,20, è stata sviluppata per la prima volta una strategia di purificazione dell'affinità più competizione per purificare il canale TRP dagli omogeneizzati della testa di Drosophila da perline di streptavidina 5. Considerando la bassa capacità e il costo costoso delle perle di streptavidina, qui viene introdotto un protocollo di purificazione migliorato che utilizza la proteina esca his-tagged e le corrispondenti perle Ni a basso costo con capacità molto più elevata. Il metodo proposto aiuterà a studiare il meccanismo di gating del canale TRP da angoli strutturali e a misurare le proprietà elettrofisiologiche del canale TRP con proteine purificate.
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Protocol
1. Purificazione di TRP con tag GST e frammenti NORPA con tag His
- Purificare il frammento TRP 1261-1275 con tag GST
- Trasformare il plasmide 10 pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 in celle Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) utilizzando il metodo di trasformazione dello shock termico CaCl2 21. Inoculare una singola colonia in 10 mL di terreno di Luria Bertani (LB) e crescere durante la notte a 37 °C. Quindi, amplificare i 10 mL di coltura di semina in 1 L di terreno LB a 37 °C.
- Dopo che la densità ottica (OD600) delle cellule raggiunge 0,5, raffreddare le cellule a 16 °C e aggiungere 0,1 mM isopropil β-D-1-tiogalatopoliranoside (IPTG; concentrazione finale) per indurre la sovraespressione della proteina bersaglio e incubare a 16 °C per 18 ore.
- Dopo sovraespressione, pellet 1 L di cellule coltivate mediante centrifugazione a 3.993 × g per 20 minuti e risospeso in 40 mL di tampone salino tamponato con fosfato (PBS).
- Caricare le celle risospese in un omogeneizzatore ad alta pressione pre-raffreddato a 4 °C. Aumentare lentamente la pressione dell'omogeneizzatore a 800 bar. Aprire il rubinetto di ingresso e lasciare che le celle risospese passino circolarmente attraverso una valvola con fessure molto strette.
NOTA: Le celle sono omogeneizzate dalle elevate forze di taglio causate da una grande caduta di pressione e cavitazione. - Caricare 5 mL di perline di glutatione su una colonna di flusso gravitazionale e lavare le perline con 50 mL di tampone PBS per un totale di tre volte.
- Centrifugare il lisato cellulare dall'omogeneizzatore ad alta pressione a 48.384 x g. Aggiungere il surnatante del lisato cellulare centrifugato (40 mL) alle perle di glutatione equilibrate nella colonna di flusso gravitazionale e incubare per 30 minuti a 4 °C. Sospendere le perle di glutatione ogni 10 minuti.
- Dopo 30 minuti di incubazione, aprire il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso. Scartare la frazione di flusso. Risciacquare due volte le restanti perle di glutatione con 50 ml di tampone PBS.
- Aggiungere 15 mL di tampone di eluizione alle perle di glutatione e incubare per 30 minuti. Sospendere le perline ogni 10 minuti.
- Dopo 30 minuti di incubazione, eluire il frammento TRP 1261-1275 con tag GST in un tubo conico da 50 mL e caricare in una colonna di esclusione dimensionale (grado di preparazione), che viene bilanciata utilizzando un buffer Tris da 50 mM (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
- Mantenere la portata di eluizione della colonna di esclusione delle dimensioni a 3 ml/min. Raccogliere le proteine eluite alla velocità di 5 ml/tubo.
- Identificare il picco della proteina bersaglio nella colonna di esclusione dimensionale analizzando i segnali di assorbimento UV a 280 nm e verificare mediante analisi del gel SDS-PAGE (parametri di elettroforesi: 150 V per il gel impilante; 200 V per il gel risolutivo). Macchiare il gel con Coomassie blu R250.
- Concentrare il frammento TRP 1261-1275 purificato con tag GST dalla colonna di esclusione delle dimensioni a 1 mL utilizzando una colonna di spin di ultrafiltrazione da 15 mL centrifugata a 3.000 x g a 4 °C in una centrifuga refrigerata da scrivania.
- Determinare la concentrazione di proteine concentrate utilizzando la legge di Beer-Lambert. Misurare l'assorbimento UV del frammento TRP 1261-1275 con tag GST a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro.
- Ottenere il coefficiente di estinzione a 280 nm importando le sequenze proteiche nel programma Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Tipicamente, 1 L di coltura di TRP 1261-1275 con tag GST produce 1 mL di 600 μM di proteine (6 x 10-7 mol). Vedere la Tabella 1 per i materiali necessari.
- Purificazione del frammento NORPA 863-1095 con tag His
- Trasformare il plasmide 20 pETM.3C NORPA 863-1095 in celle E. coli BL21 (DE3) utilizzando il metodo di trasformazione da shock termico CaCl2 21. Inoculare una singola colonia in 10 ml di LB medium e crescere durante la notte a 37 °C. Quindi, amplificare la coltura di semina da 10 ml in 1 L di terreno LB a 37 °C.
- Dopo che l'OD600 delle cellule raggiunge 0,5, raffreddare le cellule a 16 °C e aggiungere 0,1 mM IPTG (concentrazione finale) per indurre la sovraespressione della proteina bersaglio e incubare a 16 °C per 18 h.
- Dopo sovraespressione, pellet 1 L di cellule coltivate mediante centrifugazione a 3.993 x g per 20 minuti e risospeso in 40 mL di tampone legante. Successivamente, lisare le celle risospese in un omogeneizzatore ad alta pressione a 4 °C come descritto al punto 1.1.4.
- Caricare 5 mL di Ni-beads in una colonna di flusso gravitazionale e lavare tre volte con 50 mL di tampone di legame.
- Centrifugare il lisato cellulare dall'omogeneizzatore ad alta pressione a 48.384 x g. Aggiungere il surnatante del lisato cellulare centrifugato alle perle di Ni bilanciate nella colonna di flusso gravitazionale e incubare per 30 minuti a 4 °C. Sospendere le Ni-beads ogni 10 minuti.
- Dopo 30 minuti di incubazione, aprire il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso. Scartare la frazione passante e lavare due volte le restanti perline ni con 50 ml di tampone di lavaggio.
- Aggiungere 15 mL di tampone di eluizione alle ni-perline e incubare per 30 minuti. Sospendere le Ni-beads ogni 10 minuti.
- Dopo 30 minuti di incubazione, raccogliere il frammento NORPA 863-1095 eluito his-tagged in un tubo conico da 50 mL e caricarlo in una colonna di esclusione dimensionale (grado di preparazione), che viene bilanciata utilizzando 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
- Mantenere la portata di eluizione della colonna di esclusione delle dimensioni a 3 ml/min. Raccogliere la proteina eluita alla velocità di 5 ml/tubo.
- Identificare il picco della proteina bersaglio nella colonna di esclusione dimensionale analizzando i segnali di assorbimento UV a 280 nm e verificare mediante analisi del gel SDS-PAGE (parametri di elettroforesi: 150 V per il gel impilante; 200 V per il gel risolutivo). Macchiare il gel usando Coomassie blu R250.
- Concentrare il frammento NORPA 863-1095 purificato con tag His dalla colonna di esclusione delle dimensioni a 1 mL utilizzando una colonna di centrifuga di ultrafiltrazione da 15 mL centrifugata a 3.000 x g a 4 °C in una centrifuga refrigerata da banco.
- Determinare la concentrazione di proteine concentrate utilizzando la legge di Beer-Lambert. Misurare l'assorbimento UV del frammento NORPA 863-1095 con tag His a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro.
- Ottenere il coefficiente di estinzione a 280 nm importando le sequenze proteiche nel programma Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Tipicamente, la coltura da 1 L del frammento NORPA 863-1095 con tag His produce 1 mL di 600 μM di proteine (6 x 10-7 mol). Vedere la Tabella 2 per i materiali necessari.
2. Preparazione delle teste di Drosophila
- Raccogliere mosche adulte in tubi di centrifugazione conica da 50 ml utilizzando il metodo di anestesia CO2 22,23; congelare immediatamente in azoto liquido per 10 minuti e conservare in un congelatore a -80°C.
- Dopo aver raccolto un numero sufficiente di mosche, scuotere vigorosamente i tubi conici congelati da 50 ml a mano per separare le gambe, le teste, le ali e i corpi delle mosche. Trasferire la miscela in tre setacci in acciaio inossidabile preraffreddati in sequenza (rispettivamente 20/30/40 dimensioni di maglia) e agitare i setacci.
- Successivamente, poiché le teste non possono passare attraverso il setaccio a 40 maglie, utilizzare una spazzola per spazzare via le teste di mosca dal setaccio a 40 maglie, trasferirle in tubi conici da 50 ml e conservarle a -80 ° C.
- Raccogliere continuamente le mosche e le loro teste e conservarle in un congelatore a -80 °C fino a quando non raggiungono la quantità necessaria per la sperimentazione (0,5 g). In genere, per raccogliere 0,5 g di teste, sono necessari 35 ml di mosche in un tubo conico da 50 ml. Vedere la Tabella 3 per i materiali necessari.
3. Purificazione del canale TRP di Drosophila
- Pesare un totale di 0,5 g di teste e omogeneizzare completamente in azoto liquido utilizzando un pestello di mortaio pre-raffreddato. Sciogliere le teste omogeneizzate in un tampone di lisi 10x v/w (5 mL), incubare in uno shaker a 4 °C per 20 min e quindi centrifugare a 20.817 x g per 20 min a 4 °C.
- Raccogliere il surnatante spin-down ("20817 g S", Figura 4) e centrifugarlo ulteriormente a 100.000 x g per 60 minuti a 4 °C. Utilizzare il surnatante spin-down ("100.000 g S", Figura 4) per il seguente test pull-down.
- Aggiungere 1 mL di Ni-beads nella colonna di flusso gravitazionale e lavare le perline con 10 mL di H2O (ddH2O) a doppio distillato a 4 °C per un totale di tre volte. Equilibrare le perline con 10 volumi di colonne di tampone di lisi tre volte a 4 °C.
- Aggiungere 500 μL di 600 μM purificata con la proteina NORPA 863-1095 purificata (3 x 10-7 mol) nella colonna Ni e incubare per 30 minuti a 4 °C. Sospendere le perline ogni 10 minuti.
- Aprire il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso. Prendere la frazione di flusso per l'analisi SDS-PAGE (NORPA F, Figura 4). In questa sezione, le proteine dell'esca sono immobilizzate sulle perle di Ni.
- Lavare le ni-perline con 10 volumi di colonna di tampone di lisi (10 ml) a 4 °C e mantenere la frazione di lavaggio per l'analisi SDS-PAGE (Wash 1, Figura 4A). Ripetere i passaggi precedenti e conservare il campione per l'analisi SDS-PAGE (Wash 2, Figura 4A). In questa sezione, le proteine eccessive dell'esca sulle perline Ni vengono rimosse.
- Aggiungere il surnatante dell'omogeneizzato di testa di Drosophila dopo 100.000 x g di centrifugazione nella colonna Ni a 4 °C, dove il frammento NORPA 863-1095 con etichetta His è stato immobilizzato.
- Incubare il surnatante con le Ni-perline a 4 °C per 30 min. Sospendere le perline ogni 10 minuti. Quindi, apri il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso.
- Raccogliere il surnatante per l'analisi SDS-PAGE (lisi della testa di Dro F, Figura 4A). In questa sezione, i complessi proteici INAD (INAD/TRP/ePKC) negli omogeneizzati della testa sono catturati dai frammenti immobilizzati NORPA 863-1095 sulle ni-perline.
- Lavare le ni-perline con 10 volumi di colonna di tampone di lisi (10 ml) a 4 °C e mantenere il surnatante dalla precipitazione per gravità per l'analisi SDS-PAGE (Wash 3, Figura 4A). Ripetere i passaggi precedenti e raccogliere il surnatante per l'analisi SDS-PAGE (Wash 4, Figura 4A). In questa sezione, le proteine non legate sulle perline Ni vengono rimosse.
- Aggiungere 500 μL di 600 μM di proteina TRP 1261-1275 con tag GST (3 x 10-7 mol) nelle Ni-beads e incubare per 20 minuti a 4 °C. Sospendere le perline ogni 10 minuti.
- Raccogliere la frazione eluita dalla colonna gravitazionale (TRP E1, Figura 4B), che contiene il canale Endogeno Drosophila TRP. Ripetere i passaggi precedenti e raccogliere la frazione di eluizione (TRP E2, Figura 4B). In questa fase, utilizzando i frammenti TRP 1261-1275 con tag GST come concorrente, i canali TRP vengono eluiti dai complessi proteici INAD catturati (INAD / TRP / ePKC) sulle ni-perline.
- Lavare le ni-perline con 10 volumi di colonna di tampone di rilegatura (10 ml; Tabella 1) a 4 °C e raccogliere la frazione di lavaggio per l'analisi SDS-PAGE (Wash 5, Figura 4B).
- Aggiungere 500 μL di tampone di eluizione (Tabella 1) nelle ni-perline e incubare per 20 minuti a 4 °C. Raccogliere la frazione di eluizione dalla colonna del flusso gravitazionale (NORPA E1, Figura 4B). Ripetere i passaggi precedenti e raccogliere la frazione di eluizione (NORPA E2, Figura 4B).
- Utilizzando il tampone di eluizione, eluire il frammento NORPA 863-1095 his-tagged accompagnato dai complessi proteici INAD/ePKC. Successivamente, risospese le Ni-beads in 500 μL di buffer di legame.
- Prendi le Ni-beads risospese per eseguire la SDS-PAGE (colorata da Coomassie blue R250) per analizzare l'efficienza dell'eluizione e valutare se il buffer elute funziona (perline, Figura 4B). Vedere la Tabella 4 per i materiali necessari.
4. Purificazione della colonna di esclusione delle dimensioni del canale TRP di Drosophila
- Installare una colonna di esclusione dimensionale (grado analitico) sul sistema di purificazione delle proteine. Equilibrare la colonna con il buffer di colonna (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), che viene filtrato da un filtro da 0,45 μm.
- Concentrare la frazione TRP E1 ed E2 dalla fase 3.14 utilizzando una colonna di spin di ultrafiltrazione da 4 mL, centrifugata a 3.000 x g a 4 °C in una centrifuga refrigerata.
- Risciacquare il ciclo di campionamento con il buffer di colonna e caricare il campione nel ciclo di campionamento. Iniettare il campione nella colonna di esclusione dimensionale ed eluire le proteine con una portata adeguata (0,5 ml/min).
- Identificare il picco della proteina bersaglio per assorbimento a 280 nm ed eseguire un gel SDS-PAGE per rilevare il canale Endogeno Drosophila TRP purificato (Figura 5). Vedere la Tabella 5 per i materiali necessari.
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Representative Results
In questo articolo, viene dimostrato un metodo di purificazione delle proteine per purificare il canale Endogeno Drosophila TRP (Figura 1).
In primo luogo, l'espressione e la purificazione delle proteine ricombinanti vengono applicate per ottenere l'esca e le proteine concorrenti. Quindi, un frammento TRP 1261-1275 con tag GST viene espresso in cellule E. coli BL21 (DE3) in mezzo LB e purificato utilizzando perline di glutatione e una colonna di esclusione delle dimensioni (Figura 2). I campioni sono stati verificati utilizzando l'analisi SDS-PAGE con colorazione Coomassie blue R250. Nel processo di preparazione del campione SDS-PAGE, 30 μL di campione proteico vengono miscelati con 10 μL di colorante di carico 4x e fatti bollire a 100 °C per 10 minuti. Quindi, 15 μL di campione bollito vengono caricati individualmente in ciascun pozzetto. Il frammento NORPA 863-1095 con tag His-Tagged è anche espresso in modo simile nelle cellule di E. coli BL21 (DE3) in mezzo LB e purificato da Ni-beads e colonna di esclusione delle dimensioni (Figura 3). Il TRP 1261-1275 purificato con tag GST e il NORPA 863-1095 con tag His sono concentrati per la purificazione del canale TRP endogeno della Drosophila .
In secondo luogo, le teste di Drosophila vengono raccolte e omogeneizzate in azoto liquido utilizzando un pestello di mortaio pre-raffreddato, e quindi disciolte in un tampone di lisi 10x v / w (Tabella 4). L'omogeneizzato di testa disciolto viene incubato in uno shaker a 4 °C per 20 minuti e centrifugato a 20.817 x g per 20 minuti a 4 °C. Il surnatante spin-down (20817 g S, Figura 4A) viene raccolto e ulteriormente centrifugato a 100.000 x g per 60 minuti a 4 °C. Il secondo surnatante spin-down (100.000 g S, Figura 4A) viene utilizzato per il successivo test pull-down.
Infine, sulla base dei principi del pull-down e del test di competizione, la strategia di purificazione dell'affinità più concorrenza viene utilizzata per purificare il canale TRP endogeno. Il frammento purificato NORPA 863-1095 è legato a Ni-beads e usato come esca per abbattere i complessi proteici INAD endogeni dagli omogenei della testa di Drosophila . Quindi, viene aggiunto un frammento TRP 1261-1275 purificato eccessivamente purificato per competere per il canale TRP dai complessi INAD catturati sulle Ni-beads (TRP E1, TRP E2, Figura 4B). Alla fine, il canale TRP eluito viene separato dall'eccessivo peptide TRP 1261-1275 con tag GST mediante cromatografia di esclusione dimensionale (Figura 5). Nel processo di preparazione del campione SDS-PAGE, 30 μL di campione proteico vengono miscelati con 10 μL di colorante di carico 4x e fatti bollire a 100 °C per 10 minuti. Quindi, i 15 μL di campione vengono caricati individualmente in ciascun pozzetto. Come sottoprodotto, i complessi INAD-ePKC-NORPA 863-1095 possono anche essere ottenuti eluendo le perline ni dopo la competizione peptidica TRP 1261-1275 (NORPA E1, NORAP E2, Figura 4B). Utilizzando questo metodo, la resa tipica del canale finale purificato Drosophila TRP da 0,5 g di teste di mosca è di 50 μL di proteina TRP da 3 μM (1,5 x 10-10 mol). Se sono necessari più canali TRP purificati, aumentare la quantità di teste di mosca, ni-perline, proteine esca e concorrenti corrispondentemente.
Figura 1: Il diagramma schematico per la purificazione del canale Endogeno Drosophila TRP. (A) Le proteine NORPA 863-1095 purificate con tag His sono immobilizzate sulle ni-perline. (B) Le teste di Drosophila sono omogeneizzate e il surnatante spin-down dopo 100.000 x g di centrifugazione viene aggiunto alle Ni-perline legate al NORPA, dove la proteina NORPA 863-1095 funge da esca per catturare i complessi proteici INAD endogeni (INAD / TRP / ePKC). (C) Il frammento TRP 1261-1275 con tag GST viene aggiunto per competere per il canale endogeno Drosophila TRP dai complessi proteici INAD catturati. (D) La proteina TRP eluita viene ulteriormente purificata da una colonna di esclusione dimensionale per separare l'eccessivo frammento TRP 1261-1275 con tag GST. Le frecce rosse evidenziano rispettivamente le posizioni di eluizione del canale TRP e del frammento TRP 1261-1275 con tag GST. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Purificazione della proteina TRP-CT 1261-1275 con tag GST mediante perline di glutatione e cromatografia di esclusione delle dimensioni. (A) Profilo di purificazione della proteina TRP-CT 1261-1275 con tag GST in una colonna di esclusione delle dimensioni (grado di preparazione). Le frazioni sono raccolte a 5 ml/tubo. Le frazioni in posizione freccia (tubi 44-48) vengono raccolte e concentrate per la successiva purificazione del canale TRP endogeno. (B) Gel SDS-PAGE colorato Blu Coomassie R250 che mostra il frammento TRP 1261-1275 con tag GST nella purificazione dell'affinità Glutatione-perline e successiva purificazione della colonna di esclusione dimensionale. La freccia evidenzia la posizione del frammento TRP 1261-1275 con tag GST nel gel SDS-PAGE. Abbreviazioni: P: pellet di E. coli. LISATO CELLULARE BL21 (DE3) dopo omogeneizzazione in tampone PBS e centrifugazione a 48.384 x g; S: surnatante di E. coli. LISATO CELLULARE BL21 (DE3) dopo omogeneizzazione e centrifugazione a 48.384 x g; F: frazione passante dopo la precedente frazione S incubata con perline di glutatione per 30 min a 4 °C; W1 e W2: la prima e la seconda frazione di lavaggio per 10 volumi di colonna di tampone PBS; B: La proteina non eluita sulle perle di glutatione risospese viene analizzata dal gel SDS-PAGE per valutare l'efficienza di eluizione; E: frazione di eluizione da perline di glutatione mediante tampone di eluizione. La ricetta tampone per la purificazione delle proteine con tag GST è descritta nella Tabella 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Purificazione della proteina NORPA 863-1095 con tag His mediante ni-perline e cromatografia ad esclusione dimensionale. (A) Profilo di purificazione della proteina NORPA 863-1095 con tag His in una colonna di esclusione delle dimensioni. Portata = 3 ml/min. Le frazioni sono raccolte a 5 ml/tubo. Le frazioni in posizione freccia (tubi 44-49) vengono raccolte e concentrate per la successiva purificazione del canale TRP endogeno. (B) Gel SDS-PAGE colorato blu R250 di Coomassie che mostra la proteina NORPA 863-1095 con etichetta His nella purificazione della colonna Ni e nella successiva purificazione della colonna di esclusione delle dimensioni. La freccia evidenzia la posizione della proteina NORPA 863-1095 con tag His nel gel SDS-PAGE. Abbreviazioni: P: pellet di E. coli. LISATO CELLULARE BL21 (DE3) dopo omogeneizzazione in tampone legante e centrifugazione a 48.384 x g; S: frazione surnatante da E. coli. LISATO CELLULARE BL21 (DE3) dopo omogeneizzazione e centrifugazione a 48.384 x g; F: frazione passante dopo che la frazione S precedente è stata incubata con perline ni per 30 minuti a 4 °C; W1 e W2: la prima e la seconda frazione di lavaggio per 10 volumi di colonna di tampone di lavaggio; B: proteina non eluita sulle Ni-perle risospese dopo l'eluizione; E: frazioni di eluizione da Ni-beads da parte del tampone di eluizione. La ricetta tampone per la purificazione delle proteine his-tagged è elencata nella Tabella 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Purificazione del canale Endogeno Drosophila TRP. I campioni raccolti da ogni fase vengono analizzati da SDS-PAGE e colorati con colorante Coomassie blue R-250. (A) 20817 g S: frazione surnatante di omagenati di testa dopo centrifugazione 20,817 x g ; NORPA F: frazione passante di Ni-beads secondo his-tagged NORPA 863-1095 fragment binding; Wash1 e Wash2: la prima e la seconda frazione di lavaggio di Ni-beads mediante tampone di lisi dopo la rilegatura NORPA 863-1095 con etichetta His; 100.000 g S: il precedente surnatante S da 20.817 g viene ulteriormente centrifugato a 100.000 x g e il surnatante viene raccolto per SDS-PAGE; Lisi della testa di Dro F: frazione passante di Ni-perline dopo incubazione con il campione S da 100.000 g; Wash3 e Wash4: lavaggio frazioni di ni-perline mediante tampone di lisi dopo incubazione con campione di 100.000 g S. B) TRP E1 ed E2: la prima e la seconda frazione di canale TRP eluita mediante frammento TRP 1261-1275 con tag GST; Wash5: lavaggio di frazioni di ni-perline mediante tampone legante dopo la concorrenza di TRP 1261-1275 con tag GST; NORPA E1 ed E2: la prima e la seconda frazione di eluizione di frammenti NORPA 863-1095 con tag His con complessi INAD/ePKC catturati; perline: proteine non eluite che rimangono nelle Ni-perline risospese dopo il trattamento tampone di eluizione. La ricetta tampone per la purificazione del canale Endogeno Drosophila TRP è descritta nella Tabella 4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Purificazione della proteina canale Endogena Drosophila TRP mediante cromatografia ad esclusione dimensionale. (A) Profilo di purificazione della proteina del canale Endogena Drosophila TRP nella colonna di esclusione dimensionale. Portata = 0,5 ml/min. Le frazioni sono state raccolte a 0,5 ml/tubo. Le frazioni in posizione freccia (1E8-1F2) sono state raccolte e concentrate. (B) Gel SDS-PAGE colorato blu R-250 di Coomassie che mostra la proteina del canale Endogena Drosophila TRP dopo la purificazione della colonna di esclusione dimensionale. La posizione della proteina del canale Drosophila TRP endogena purificata è evidenziata dalla freccia rossa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Materiali necessari per la purificazione del frammento TRP 1261-1275 con etichetta GST. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Materiali necessari per la purificazione del frammento NORPA 863-1095 con etichetta His.S. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Materiali necessari per la preparazione delle teste di Drosophila. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 4: Materiali necessari per la purificazione del canale TRP Drosophila. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Tabella 5: Materiali necessari per la purificazione della colonna di esclusione dimensionale del canale TRP Drosophila. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
INAD, che contiene cinque domini PDZ, è l'organizzatore principale del macchinario di fototrasduzione Drosophila. Studi precedenti hanno dimostrato che INAD PDZ3 si lega al canale TRP C-terminale coda con squisita specificità (KD = 0,3 μM)18. Il tandem INAD PDZ45 interagisce con il frammento NORPA 863-1095 con un'affinità di legame estremamente elevata (KD = 30 nM). Questi risultati forniscono una solida base biochimica per progettare la purificazione dell'affinità più la strategia di concorrenza, che consente al frammento NORPA CC-PBM di essere utilizzato come esca di pulldown, mentre la coda terminale C TRP (frammento 1261-1275) funziona come un reagente competitivo. Pertanto, il primo punto critico per questo metodo è comprendere il meccanismo di assemblaggio del complesso INAD e ottenere abbastanza frammenti NORPA e TRP. Allo stesso tempo, poiché il canale TRP è la proteina di membrana che deve essere estratta dalla membrana e stabilizzata in soluzione, l'uso del detergente è il secondo punto critico di questo metodo. Come detergente popolare per studi strutturali e funzionali dei canali TRP24,25, n-Dodecyl-B-D-Maltoside (DDM) viene utilizzato in questo metodo. Se i risultati della purificazione sono insoddisfacenti, le qualità della proteina esca, della proteina concorrente e del detergente devono essere controllate attentamente. Inoltre, l'efficienza di estrazione dei canali TRP può essere rintracciata da Western blot utilizzando l'anticorpo TRP.
In uno studio precedente5, sono state utilizzate costose perle di streptavidina per purificare il canale TRP dagli estratti di testa di mosca, il che limita la purificazione di routine in laboratorio. Pertanto, il metodo è stato migliorato utilizzando un frammento NORPA 863-1095 con tag His accoppiato con perline Ni per ridurre i costi e aumentare la resa. Attualmente, le rese del canale TRP purificato nel metodo migliorato sono sufficienti per condurre un esperimento di colorazione negativa al microscopio elettronico a trasmissione (TEM), in cui i canali TRP purificati formano tetrameri (dati non mostrati), indicando che il processo di purificazione non interrompe la formazione di tetrameri dei canali TRP. Pertanto, questo protocollo sarà potenzialmente adatto per futuri esperimenti di crio-EM ed elettrofisiologia.
Tuttavia, poiché i concorrenti utilizzati negli esperimenti (frammento NORPA 863-1095, frammento TRP 1261-1275) hanno affinità di legame simili con le proteine wild-type, il limite di questo metodo è che le proteine e le perline competitive massicce devono essere utilizzate per abbattere la proteina bersaglio. Non sarà conveniente per i laboratori che non possono purificare l'esca su larga scala.
Una potenziale applicazione futura di questo metodo sarà quella di studiare le informazioni strutturali del canale TRP Drosophila utilizzando tecniche Cryo-EM. Inoltre, è anche possibile misurare le proprietà elettrofisiologiche dei canali TRP endogeni purificati nella membrana lipidica a doppio strato artificiale. Inoltre, in questo sistema modello ricostituito, sarà interessante caratterizzare le proprietà elettrofisiologiche dei canali TRP endogeni purificati modulando la composizione complessa INAD e la composizione lipidica. Infine, combinati con le informazioni strutturali e le proprietà elettrofisiologiche, i meccanismi di gating e regolazione del canale TRP possono essere attentamente esaminati in futuro.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) e Natural Science Foundation of Guangdong Province, Cina (n. 2021A1515010796) a W. L. Ringraziamo LetPub (www.letpub.com) per la sua assistenza linguistica durante la preparazione di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
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