Summary
На основе механизма сборки белкового комплекса INAD в этом протоколе была разработана модифицированная стратегия аффинной очистки плюс конкуренция для очистки эндогенного канала Drosophila TRP.
Abstract
Фототрансдукция дрозофилы является одним из самых быстрых известных сигнальных путей, связанных с G-белком. Чтобы обеспечить специфичность и эффективность этого каскада, кальциевый (Ca2+)-проницаемый катионный канал, переходный рецепторный потенциал (TRP), плотно связывается с каркасным белком, инактивирующим без-после-потенциала D (INAD), и образует большой сигнальный белковый комплекс с глаз-специфической протеинкиназой C (ePKC) и фосфолипазой Cβ / No рецепторного потенциала A (PLCβ / NORPA). Однако биохимические свойства канала Drosophila TRP остаются неясными. На основе механизма сборки белкового комплекса INAD была разработана модифицированная стратегия аффинной очистки плюс конкуренция для очистки эндогенного канала TRP. Во-первых, очищенный фрагмент NORPA 863-1095, помеченный гистидином (His), был связан с Ni-шариками и использовался в качестве приманки для вытягивания эндогенного белкового комплекса INAD из гомогенатов головки Drosophila . Затем к Ni-бусинам был добавлен избыточный очищенный фрагмент TRP 1261-1275 с маркировкой ГЛУТАТИОН S-трансфераза (GST), чтобы конкурировать с каналом TRP. Наконец, канал TRP в супернатанте был отделен от избыточного пептида TRP 1261-1275 с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии. Этот метод позволяет изучить механизм гакинга канала Drosophila TRP как с биохимического, так и со структурного угла. Электрофизиологические свойства очищенных каналов Drosophila TRP также могут быть измерены в будущем.
Introduction
Фототрансдукция — это процесс, при котором поглощенные фотоны преобразуются в электрические коды нейронов. Он исключительно передает опсины и следующий сигнальный каскад, связанный с G-белком, как у позвоночных, так и у беспозвоночных. У дрозофилы, используя пять доменов PDZ, инактивация каркасного белка без последующего потенциала D (INAD) организует супрамолекулярный сигнальный комплекс, который состоит из канала переходного рецепторного потенциала (TRP), фосфолипазного Cβ/No рецепторного потенциала A (PLCβ/NORPA) и глаз-специфической протеинкиназы C (ePKC)1. Формирование этого супрамолекулярного сигнального комплекса гарантирует правильную субклеточную локализацию, высокую эффективность и специфичность механизма фототрансдукции Drosophila. В этом комплексе светочувствительные каналы TRP действуют как нисходящие эффекторы NORPA и опосредуют приток кальция и деполяризацию фоторецепторов. Предыдущие исследования показали, что открытие канала Drosophila TRP опосредовано протонами, нарушением местной липидной среды или механической силой 2,3,4. Канал Drosophila TRP также взаимодействует с кальмодулином5 и модулируется кальцием как положительной, так и отрицательной обратной связью 6,7,8.
До сих пор электрофизиологические исследования механизма захвата каналов Drosophila TRP и TRP-подобных (TRPL) каналов были основаны на иссеченных мембранных пластырях, записях цельноклеток из диссоциированных фоторецепторов дрозофилы дикого типа и гетеро-экспрессированных каналах в клетках S2, SF9 или HEK 2,9,10,11,12,13, но не на очищенных каналах. Структурная информация о полнометражном канале Drosophila TRP также остается неясной. Для изучения электрофизиологических свойств очищенного белка в восстановленной мембранной среде и получения структурной информации о полноразмерном канале Drosophila TRP получение очищенных полноразмерных каналов TRP является необходимым первым шагом, аналогичным методологиям, используемым в исследованиях каналов TRP млекопитающих 14,15,16,17.
Недавно, на основе механизма сборки белкового комплекса INAD 18,19,20, впервые была разработана стратегия аффинной очистки плюс конкуренция для очистки канала TRP от гомогенатов головки дрозофилы бусинами стрептавидина 5. Учитывая низкую емкость и дорогую стоимость бусин стрептавидина, здесь введен улучшенный протокол очистки, в котором используется помеченный Им белок приманки и соответствующие недорогие Ni-бусины с гораздо более высокой емкостью. Предложенный метод поможет изучить механизм гатерации канала ГТО со структурных углов и измерить электрофизиологические свойства канала ГТО очищенными белками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Очистка фрагментов ГТО с тегами GST и NORPA с тегами His
- Очистка фрагмента TRP 1261-1275 с меткой GST
- Преобразование плазмиды pGEX 4T-1 TRP 1261-127510 в клетки Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) с использованием метода теплового шокового преобразования CaCl2 2. Инокулируют одну колонию в 10 мл среды Luria Bertani (LB) и растут в течение ночи при 37 °C. Затем амплируйте 10 мл посевной культуры в 1 л среды LB при 37 °C.
- После того, как оптическая плотность (OD600) клеток достигнет 0,5, охладите клетки до 16 °C и добавьте 0,1 мМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG; конечная концентрация), чтобы индуцировать сверхэкспрессию белка-мишени и инкубировать при 16 °C в течение 18 ч.
- После сверхэкспрессии гранулируют 1 л культивируемых клеток центрифугированием при 3,993 × г в течение 20 мин и повторно суспендируют в 40 мл фосфатно-буферного физиологического (PBS) буфера.
- Загрузите повторно суспендированные ячейки в гомогенизатор высокого давления, предварительно охлажденный при 4 °C. Медленно увеличьте давление гомогенизатора до 800 бар. Откройте впускной кран и позвольте повторно суспендированным ячейкам циркулярно пройти через клапан с очень узкими щелями.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки гомогенизируются высокими сдвиговыми силами, вызванными большим падением давления и кавитацией. - Загрузите 5 мл бусин глутатиона в колонку гравитационного потока и промыть шарики 50 мл буфера PBS в общей сложности три раза.
- Центрифугирование лизата клеток из гомогенизатора высокого давления при 48,384 х г. Добавьте супернатант центрифугированного клеточного лизата (40 мл) к уравновешенным шарикам глутатиона в колонке гравитационного потока и инкубируйте в течение 30 мин при 4°С. Повторно суспендируйте бусины глутатиона каждые 10 минут.
- После 30 мин инкубации откройте выходной кран колонны, чтобы отделить шарики и проточную фракцию. Отбросьте проточную фракцию. Дважды промойте оставшиеся шарики глутатиона 50 мл буфера PBS.
- Добавьте 15 мл буфера элюирования к шарикам глутатиона и инкубируйте в течение 30 минут. Повторно суспендируйте бусины каждые 10 минут.
- После 30 мин инкубации элюируют меченый GST фрагмент TRP 1261-1275 в конической трубке объемом 50 мл и нагружают в колонну исключения размера (подготовительный класс), которая уравновешивается с использованием буфера 50 мМ Tris (рН 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT).
- Сохраните расход элюирования колонки исключения размеров на уровне 3 мл/мин. Соберите элюированные белки из расчета 5 мл/пробирка.
- Определите пик белка-мишени в колонке «размер-исключение» путем анализа сигналов поглощения УФ-излучения при 280 нм и проверьте с помощью анализа геля SDS-PAGE (параметры электрофореза: 150 В для стекирующего геля; 200 В для разрешающего геля). Окрасьте гель синим цветом Coomassie R250.
- Сконцентрируйте очищенный фрагмент TRP 1261-1275 с маркировкой GST от колонны исключения размеров до 1 мл с помощью 15 мл ультрафильтрационной спиновой колонны, центрифугированной при 3000 х г при 4 °C в настольной холодильной центрифуге.
- Определить концентрацию концентрированного белка можно с помощью закона Бира-Ламберта. Измерьте УФ-поглощение фрагмента TRP 1261-1275 с GST-меткой при 280 нм с помощью спектрофотометра.
- Получение коэффициента вымирания при 280 нм путем импорта белковых последовательностей в программу Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Как правило, 1 л культуры GST-меченого TRP 1261-1275 дает 1 мл 600 мкМ белка (6 х 10-7 моль). Необходимые материалы см. в таблице 1 .
- Очищение его меченого фрагмента NORPA 863-1095
- Преобразование плазмиды20 pETM.3C NORPA 863-1095 в ячейки E. coli BL21 (DE3) с использованием метода21 трансформации теплового шока CaCl2. Инокулируют одну колонию в 10 мл среды LB и растут в течение ночи при 37 °C. Затем амплируйте посевную культуру объемом 10 мл в 1 л среды LB при 37 °C.
- После того, как OD600 клеток достигнет 0,5, охладите клетки до 16 °C и добавьте 0,1 мМ IPTG (конечная концентрация), чтобы индуцировать сверхэкспрессию белка-мишени и инкубировать при 16 °C в течение 18 ч.
- После сверхэкспрессии гранулируют 1 л культивируемых клеток центрифугированием при 3,993 х г в течение 20 мин и повторно суспендируют в 40 мл связывающего буфера. Затем лизируйте повторно суспендированные ячейки в гомогенизаторе высокого давления при 4 °C, как описано на этапе 1.1.4.
- Загрузите 5 мл Ni-шариков в гравитационную проточную колонну и трижды промыть 50 мл связывающего буфера.
- Центрифугирование лизата клеток из гомогенизатора высокого давления при 48,384 х г. Добавьте супернатант центрифугированного клеточного лизата к уравновешенным Ni-шарикам в колонке гравитационного потока и инкубируйте в течение 30 мин при 4°C. Повторно суспендируйте Ni-бусины каждые 10 минут.
- После 30 мин инкубации откройте выходной кран колонны, чтобы отделить шарики и проточную фракцию. Отбросьте проточную фракцию и дважды промыть оставшиеся ni-шарики 50 мл промывочного буфера.
- Добавьте 15 мл буфера элюирования в Ni-шарики и инкубируйте в течение 30 мин. Повторно суспендируйте Ni-бусины каждые 10 минут.
- После 30 мин инкубации собрать элюированный his-меченый фрагмент NORPA 863-1095 в коническую трубку объемом 50 мл и загрузить в колонну исключения размеров (подготовительный сорт), которая уравновешивается с использованием 50 мМ Tris (рН 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT).
- Сохраните расход элюирования колонки исключения размеров на уровне 3 мл/мин. Соберите элюированный белок из расчета 5 мл/пробирка.
- Определите пик белка-мишени в колонке «размер-исключение» путем анализа сигналов поглощения УФ-излучения при 280 нм и проверьте с помощью анализа геля SDS-PAGE (параметры электрофореза: 150 В для стекирующего геля; 200 В для разрешающего геля). Окрашивайте гель с помощью Coomassie синим R250.
- Сконцентрируйте очищенный фрагмент NORPA 863-1095 с маркировкой His из колонки исключения размеров до 1 мл с помощью 15 мл ультрафильтрационной спиновой колонны, центрифугированной при 3000 х г при 4 °C в настольной холодильной центрифуге.
- Определить концентрацию концентрированного белка можно с помощью закона Бира-Ламберта. Измерьте УФ-поглощение гис-меченого фрагмента NORPA 863-1095 при 280 нм с помощью спектрофотометра.
- Получение коэффициента вымирания при 280 нм путем импорта белковых последовательностей в программу Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Как правило, 1 л культуры his-меченого фрагмента NORPA 863-1095 дает 1 мл 600 мкМ белка (6 х 10-7 моль). Необходимые материалы см. в таблице 2 .
2. Приготовление голов дрозофилы
- Собирать взрослых мух в конические центрифугирующие трубки объемом 50 мл с помощью метода обезболиванияСО2 22,23; немедленно заморозить в жидком азоте в течение 10 мин и хранить в морозильной камере -80°C.
- Собрав достаточное количество мух, энергично встряхните замерзшие конические трубки объемом 50 мл вручную, чтобы отделить ноги, головы, крылья и тела мух. Переложите смесь на три последовательно уложенных предварительно охлажденных сита из нержавеющей стали (размер ячейки 20/30/40 соответственно) и встряхните сита.
- Затем, поскольку головки не могут пройти через 40-сетчатое сито, используйте щетку, чтобы смести головки мух с 40-сетчатого сита, переложить их в конические трубки объемом 50 мл и хранить их при -80 ° C.
- Непрерывно собирайте мух и их головы и храните их в морозильной камере -80 °C до тех пор, пока они не достигнут необходимого количества, необходимого для экспериментов (0,5 г). Как правило, для сбора 0,5 г головок необходимо 35 мл мух в конической трубке объемом 50 мл. Необходимые материалы см. в таблице 3 .
3. Очистка канала Drosophila TRP
- Взвесьте в общей сложности 0,5 г головок и полностью гомогенизируйте в жидком азоте с помощью предварительно охлажденного раствора-пестика. Растворяют гомогенизированные головки в буфере лизиса 10x v/w (5 мл), инкубируют в шейкере при 4 °C в течение 20 мин, а затем центрифугу при 20,817 x g в течение 20 мин при 4 °C.
- Соберите отжимной супернатант («20817 г S», рисунок 4) и далее центрифугируйте его при 100 000 х г в течение 60 мин при 4 °C. Используйте спин-нисходящий супернатант («100 000 г S», рисунок 4) для следующего анализа вытягивания.
- Добавьте 1 мл Ni-шариков в столб гравитационного потока и промыть шарики 10 мл двойного дистиллированногоH2O (ddH2O) при 4 °C в общей сложности три раза. Уравновесьте бусины 10-колонными объемами буфера лизиса три раза при 4 °C.
- Добавьте 500 мкл 600 мкМ очищенного his-меченого белка NORPA 863-1095 (3 x 10-7 моль) в Ni-колонку и инкубируйте в течение 30 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте бусины каждые 10 минут.
- Откройте выходной кран колонны, чтобы разделить шарики и проточную фракцию. Возьмем проточную дробь для анализа SDS-PAGE (NORPA F, рисунок 4). В этом разделе белки приманки иммобилизованы на Ni-шариках.
- Промыть ni-шарики с 10 колонными объемами лизисного буфера (10 мл) при 4 °C и сохранить промывочную фракцию для анализа SDS-PAGE (Wash 1, рисунок 4A). Повторите описанные выше шаги и сохраните образец для анализа SDS-PAGE (Wash 2, рисунок 4A). В этом разделе удаляются избыточные белки приманки на Ni-шариках.
- Добавьте супернатант гомогената головки дрозофилы после центрифугирования 100 000 х г в Ni-колонку при 4 °C, где иммобилизован фрагмент NORPA 863-1095, помеченный His.
- Инкубировать супернатант с Ni-шариками при 4 °C в течение 30 мин. Повторно суспендируйте бусины каждые 10 минут. Затем откройте выходной кран колонны, чтобы разделить шарики и проточную фракцию.
- Соберите супернатант для анализа SDS-PAGE (лизис головы Dro F, рисунок 4A). В этом разделе белковые комплексы INAD (INAD/TRP/ePKC) в гомогенатах головы захватываются иммобилизованными фрагментами NORPA 863-1095 на Ni-шариках.
- Промыть ni-шарики с 10-колонными объемами лизисного буфера (10 мл) при 4 °C и сохранить супернатант от гравитационных осадков для анализа SDS-PAGE (Wash 3, рисунок 4A). Повторите описанные выше шаги и соберите супернатант для анализа SDS-PAGE (Wash 4, рисунок 4A). В этом разделе удаляются несвязанные белки на Ni-шариках.
- Добавьте 500 мкл 600 мкМ помеченного GST белка TRP 1261-1275 (3 x 10-7 моль) в Ni-шарики и инкубируйте в течение 20 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте бусины каждые 10 минут.
- Соберите элюированную фракцию из гравитационного столба (TRP E1, рисунок 4B), который содержит эндогенный канал Drosophila TRP. Повторите описанные выше шаги и соберите фракцию элюирования (TRP E2, рисунок 4B). На этом этапе, используя помеченные GST фрагменты TRP 1261-1275 в качестве конкурента, каналы TRP элюируются из захваченных белковых комплексов INAD (INAD / TRP / ePKC) на Ni-шариках.
- Промыть Ni-бусины 10 колонными объемами связывающего буфера (10 мл; Таблица 1) при 4 °C и собрать промывочную фракцию для анализа SDS-PAGE (Wash 5, рисунок 4B).
- Добавьте 500 мкл буфера элюирования (таблица 1) в Ni-шарики и инкубируйте в течение 20 мин при 4 °C. Соберите фракцию элюирования из колонки гравитационного потока (NORPA E1, рисунок 4B). Повторите описанные выше шаги и соберите фракцию элюирования (NORPA E2, рисунок 4B).
- Используя буфер элюирования, элюируют помеченный His фрагмент NORPA 863-1095, сопровождаемый белковыми комплексами INAD/ePKC. Затем повторно суспендируйте Ni-шарики в 500 мкл связывающего буфера.
- Возьмите повторно суспендированные Ni-бусины для запуска SDS-PAGE (окрашенного Coomassie в синий цвет R250), чтобы проанализировать эффективность элюирования и оценить, работает ли буфер элюда (бусины, рисунок 4B). Необходимые материалы см. в таблице 4 .
4. Очистка колонки уменьшения размера канала Drosophila TRP
- Установите на систему очистки белка колонку исключения размеров (аналитическую марку). Уравновешивайте колонну с буфером колонны (50 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 2 мМ DTT, 0,75 мМ DDM), который фильтруется фильтром 0,45 мкм.
- Концентрируйте фракции TRP E1 и E2 на стадии 3.14 с помощью спиновой колонны ультрафильтрации 4 мл, центрифугированной при 3000 х г при 4 °C в охлажденной центрифуге.
- Смойте цикл образца с помощью буфера столбцов и загрузите образец в цикл образца. Вводят образец в колонку исключения размеров и элюируют белки с надлежащей скоростью потока (0,5 мл/мин).
- Определите пик целевого белка путем абсорбции при 280 нм и запустите гель SDS-PAGE для обнаружения очищенного эндогенного канала Drosophila TRP (рисунок 5). Необходимые материалы см. в таблице 5 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой статье продемонстрирован метод очистки белка для очистки эндогенного канала Drosophila TRP (рисунок 1).
Во-первых, экспрессия и очистка рекомбинантного белка применяются для получения приманки и белков конкурентов. Затем фрагмент TRP 1261-1275, помеченный GST, экспрессируют в клетках E. coli BL21 (DE3) в среде LB и очищают с использованием шариков глутатиона и колонки исключения размера (рисунок 2). Образцы были проверены с использованием анализа SDS-PAGE с окрашиванием Coomassie blue R250. В процессе пробоподготовки SDS-PAGE 30 мкл образца белка смешивают с 10 мкл 4-кратного нагрузочного красителя и кипятят при 100 °C в течение 10 мин. Затем 15 мкл кипяченого образца индивидуально загружают в каждую скважину. Его-меченый фрагмент NORPA 863-1095 также аналогичным образом экспрессируется в клетках E. coli BL21 (DE3) в среде LB и очищается Ni-шариками и колонкой исключения размера (рисунок 3). Очищенные GST-метки TRP 1261-1275 и His-меченые NORPA 863-1095 концентрируются для очистки эндогенного канала Drosophila TRP.
Во-вторых, головки дрозофил собирают и гомогенизируют в жидком азоте с помощью предварительно охлажденного раствора-пестика, а затем растворяют в 10x v/w лизисном буфере (таблица 4). Гомогенат растворенной головки инкубируют в шейкере при 4°С в течение 20 мин и центрифугируют при 20,817 х г в течение 20 мин при 4°С. Отжимной супернатант (20817 г S, рисунок 4A) собирают и далее центрифугируют при 100 000 x g в течение 60 мин при 4 °C. Второй спин-нисходящий супернатант (100 000 г S, рисунок 4A) используется для последующего вытягивающего анализа.
Наконец, основываясь на принципах вытягивания и анализа конкуренции, для очистки эндогенного канала ГТО используется стратегия аффинности плюс конкуренция. Очищенный фрагмент NORPA 863-1095, помеченный His, связан с Ni-бусинами и используется в качестве приманки для вытягивания эндогенных белковых комплексов INAD из гомогенатов головки дрозофилы . Затем добавляется избыточный очищенный фрагмент TRP 1261-1275 с маркировкой GST, чтобы конкурировать за канал TRP из захваченных комплексов INAD на Ni-шариках (TRP E1, TRP E2, рисунок 4B). В конце концов, элюированный канал TRP отделяется от избыточного GST-помеченного пептида TRP 1261-1275 с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии (рисунок 5). В процессе пробоподготовки SDS-PAGE 30 мкл образца белка смешивают с 10 мкл 4-кратного нагрузочного красителя и кипятят при 100 °C в течение 10 мин. Затем 15 мкл образца индивидуально загружаются в каждую скважину. В качестве побочного продукта комплексы INAD-ePKC-NORPA 863-1095 также могут быть получены путем элюирования Ni-шариков после конкуренции пептидов TRP 1261-1275 (NORPA E1, NORAP E2, рисунок 4B). Используя этот метод, типичный выход конечного очищенного канала Drosophila TRP из 0,5 г мухометных головок составляет 50 мкл белка TRP 3 мкМ (1,5 х 10-10 моль). Если необходимы более очищенные каналы TRP, увеличьте количество нахлыстовых головок, Ni-бусин, белка приманки и, соответственно, конкурента.
Рисунок 1: Принципиальная схема очистки эндогенного канала Drosophila TRP. (A) Очищенные His-меченые белки NORPA 863-1095 иммобилизуются на Ni-шариках. (B) Головки дрозофил гомогенизируются, и спин-нисходящий супернатант после центрифугирования 100 000 х г добавляют к NORPA-связанным Ni-шарикам, где белок NORPA 863-1095 действует как приманка для захвата эндогенных белковых комплексов INAD (INAD / TRP / ePKC). (C) Фрагмент TRP 1261-1275, помеченный GST, добавляется для конкуренции за эндогенный канал Drosophila TRP из захваченных белковых комплексов INAD. (D) Элюированный белок TRP дополнительно очищается колонкой исключения размера для отделения чрезмерного фрагмента TRP 1261-1275 с меткой GST. Красные стрелки выделяют положения элюирования канала TRP и фрагмента TRP 1261-1275 с тегом GST соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Очистка GST-меченого белка TRP-CT 1261-1275 с помощью шариков глутатиона и хроматографии с исключением размера. (A) Профиль очистки помеченного GST белка TRP-CT 1261-1275 в колонке исключения размера (сорт препарата). Фракции собирают по 5 мл/пробирку. Фракции в положении стрелки (трубки 44-48) собирают и концентрируют для последующей очистки эндогенного канала ГТО. (B) Синий окрашенный гель Coomassie R250 SDS-PAGE, показывающий фрагмент TRP 1261-1275 с тегом GST в аффинной очистке глутатионов и последующей очистке колонны с исключением размера. Стрелка выделяет положение фрагмента TRP 1261-1275 с тегом GST в геле SDS-PAGE. Сокращения: P: пеллеты из кишечной палочки. Лизат клеток BL21 (DE3) после гомогенизации в буфере PBS и центрифугирования при 48,384 x g; S: супернатант из кишечной палочки. BL21 (DE3) клеточный лизат после гомогенизации и центрифугирования при 48,384 х г; F: проточная фракция после предыдущей фракции S, инкубированная с шариками глутатиона в течение 30 мин при 4 °C; W1 и W2: первая и вторая промывочная фракция на 10 колонн объемов буфера PBS; B: Неэлюированный белок на ресуспендированных шариках глутатиона анализируется гелем SDS-PAGE для оценки эффективности элюирования; E: фракция элюирования из шариков глутатиона буфером элюирования. Буферный рецепт для очистки белка, помеченного GST, описан в таблице 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Очистка помеченного Им белка NORPA 863-1095 с помощью Ni-шариков и размерно-эксклюзионной хроматографии. (A) Профиль очистки помеченного His белка NORPA 863-1095 в колонке исключения размера. Расход = 3 мл/мин. Фракции собирают по 5 мл/пробирку. Фракции в положении стрелки (трубки 44-49) собирают и концентрируют для последующей очистки эндогенного канала ГТО. (B) Синий гель Coomassie R250, окрашенный SDS-PAGE, показывающий помеченный His белок NORPA 863-1095 при очистке Ni-колонки и последующей очистке колонки с исключением размера. Стрелка подчеркивает положение помеченного His белка NORPA 863-1095 в геле SDS-PAGE. Сокращения: P: пеллеты из кишечной палочки. Лизат клеток BL21 (DE3) после гомогенизации в буфере связывания и центрифугирования при 48,384 х г; S: надосадочная фракция из кишечной палочки. BL21 (DE3) клеточный лизат после гомогенизации и центрифугирования при 48,384 х г; F: проточная фракция после того, как предыдущую фракцию S инкубируют с Никелевыми шариками в течение 30 мин при 4°С; W1 и W2: первая и вторая промывочная фракция на 10 колонн объемов промывочного буфера; B: Неэлюированный белок на ресуспендированных Ni-шариках после элюирования; E: фракции элюирования из Ni-шариков буфером элюирования. Буферный рецепт для очистки белка, помеченного Гисом, приведен в таблице 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Очистка эндогенного канала Drosophila TRP. Собранные образцы с каждого этапа анализируются SDS-PAGE и окрашиваются синим красителем Coomassie R-250. (A) 20817 г S: надосадочная фракция головных гомогенатов после центрифугирования 20 817 х г ; NORPA F: проточная фракция Ni-шариков после связывания фрагментов NORPA 863-1095 с его меткой; Wash1 и Wash2: первая и вторая промывки фракций Ni-шариков лизисным буфером после связывания NORPA 863-1095 с маркировкой His; 100 000 г S: предыдущий супернатант 20 817 г S дополнительно центрифугируется при 100 000 х г , а супернатант собирается для SDS-PAGE; Лизис головки Dro F: проточная фракция Ni-шариков после инкубации с пробой 100 000 г S; Wash3 и Wash4: промывка фракций Ni-шариков лизисным буфером после инкубации с образцом 100 000 г S. (B) ГТО Е1 и Е2: первая и вторая элюированные фракции канала ГТО фрагментом ГТО 1261-1275 с маркировкой GST; Wash5: промывка фракций Ni-бусин связывающим буфером после соревнований по GST-маркировке TRP 1261-1275; NORPA E1 и E2: первая и вторая элюирующая фракция his-меченых фрагментов NORPA 863-1095 с захваченными комплексами INAD/ePKC; бусины: неэлюированный белок, остающийся в повторно суспендированных Ni-шариках после элюционно-буферной обработки. Буферный рецепт эндогенной очистки канала Drosophila TRP описан в таблице 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Очистка эндогенного белка канала Drosophila TRP методом размерно-эксклюзионной хроматографии. (A) Профиль очистки эндогенного белка канала Drosophila TRP в колонке исключения размера. Расход = 0,5 мл/мин. Фракции собирали по 0,5 мл/пробирку. Фракции в положении стрелки (1Е8-1Ф2) собирали и концентрировали. (B) Coomassie blue R-250 окрашенный гель SDS-PAGE, показывающий эндогенный белок канала Drosophila TRP после очистки колонки с исключением размера. Положение очищенного эндогенного белка канала Drosophila TRP выделено красной стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Материалы, необходимые для очистки фрагмента TRP 1261-1275 с маркировкой GST. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Материалы, необходимые для очистки помеченного Им фрагмента NORPA 863-1095. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 3: Материалы, необходимые для приготовления голов дрозофилы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 4: Материалы, необходимые для очистки канала Drosophila TRP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 5: Материалы, необходимые для очистки колонки исключения размера канала Drosophila TRP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
INAD, который содержит пять доменов PDZ, является основным организатором механизма фототрансдукции Drosophila. Предыдущие исследования показали, что INAD PDZ3 связывается с С-концевым хвостом канала ГТО с изысканной специфичностью (KD = 0,3 мкМ)18. Тандем INAD PDZ45 взаимодействует с фрагментом NORPA 863-1095 с чрезвычайно высоким сродством связывания (KD = 30 нМ). Эти результаты обеспечивают прочную биохимическую основу для разработки стратегии аффинной очистки плюс конкуренция, которая позволяет использовать фрагмент NORPA CC-PBM в качестве вытягивающей приманки, в то время как C-концевой хвост TRP (фрагмент 1261-1275) функционирует как конкурентный реагент. Поэтому первым критическим моментом для данного метода является понимание механизма сборки комплекса INAD и получение достаточного количества фрагментов NORPA и TRP. В то же время, поскольку канал TRP является мембранным белком, который необходимо извлечь из мембраны и стабилизировать в растворе, использование моющего средства является второй критической точкой этого метода. В качестве популярного моющего средства для структурно-функциональных исследований каналов ГТО 24,25 в данном методе используется н-додецил-B-D-мальтозид (ДДМ). Если результаты очистки неудовлетворительны, необходимо тщательно проверить качества белка приманки, белка конкурента и моющего средства. Кроме того, эффективность экстракции каналов TRP может быть прослежена с помощью вестерн-блоттинга с использованием антитела TRP.
В предыдущем исследовании5 дорогие шарики стрептавидина использовались для очистки канала TRP от экстрактов головки мухи, что ограничивает рутинную очистку в лаборатории. Таким образом, метод был улучшен за счет использования фрагмента NORPA 863-1095, помеченного His, в сочетании с Ni-шариками для снижения стоимости и увеличения урожайности. В настоящее время выходы очищенного канала ГТО в усовершенствованном способе достаточны для проведения эксперимента по отрицательному окрашиванию просвечивающего электронного микроскопа (ТЭМ), в котором очищенные каналы ГТО образуют тетрамеры (данные не показаны), что указывает на то, что процесс очистки не нарушает тетрамерообразование каналов ГТО. Поэтому этот протокол будет потенциально подходящим для будущих криоэм- и электрофизиологических экспериментов.
Однако, поскольку конкуренты, использованные в экспериментах (фрагмент NORPA 863-1095, фрагмент TRP 1261-1275), имеют сходное сродство связывания с белками дикого типа, ограничение этого метода заключается в том, что массивные конкурентные белки и бусины должны использоваться для вытягивания целевого белка. Это будет неудобно для лабораторий, которые не могут очистить приманку в больших масштабах.
Потенциальным будущим применением этого метода будет изучение структурной информации канала Drosophila TRP с использованием методов Cryo-EM. Кроме того, измерение электрофизиологических свойств очищенных эндогенных каналов ГТО в искусственной двухслойной липидной мембране также возможно. Кроме того, в этой восстановленной модельной системе будет интересно охарактеризовать электрофизиологические свойства очищенных эндогенных каналов ГТО путем модуляции комплексного состава INAD и липидного состава. Наконец, в сочетании со структурной информацией и электрофизиологическими свойствами в будущем могут быть тщательно изучены механизмы гатерации и регуляции канала ГТО.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 31870746), грантами на фундаментальные исследования в Шэньчжэне (JCYJ20200109140414636) и Фондом естественных наук провинции Гуандун, Китай (No 2021A1515010796) W. L. Мы благодарим LetPub (www.letpub.com) за лингвистическую помощь при подготовке этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
- Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
- Hardie, R. C., Franze, K.
- Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
- Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
- Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
- Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
- Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
- Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
- Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
- Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
- Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
- Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
- Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
- Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
- Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).
- Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Hellmich, U. A., Gaudet, R.
