Summary
Baserat på monteringsmekanismen för INAD-proteinkomplexet utvecklades i detta protokoll en modifierad affinitetsrening plus konkurrensstrategi för att rena den endogena Drosophila TRP-kanalen.
Abstract
Drosophila fototransduktion är en av de snabbaste kända G-proteinkopplade signalvägarna. För att säkerställa specificiteten och effektiviteten hos denna kaskad binder kalcium (Ca2+)-permeabel katjonkanal, transient receptorpotential (TRP), tätt till ställningsproteinet, inaktivering-no-after-potential D (INAD), och bildar ett stort signalproteinkomplex med ögonspecifikt proteinkinas C (ePKC) och fosfogpas Cβ/No receptorpotential A (PLCβ/NORPA). De biokemiska egenskaperna hos Drosophila TRP-kanalen är emellertid fortfarande oklara. Baserat på monteringsmekanismen för INAD-proteinkomplex utvecklades en modifierad affinitetsrening plus konkurrensstrategi för att rena den endogena TRP-kanalen. Först bands det renade histidin (His) -märkta NORPA 863-1095-fragmentet till Ni-pärlor och användes som bete för att dra ner det endogena INAD-proteinkomplexet från Drosophila-huvudhomogenater. Sedan tillsattes överdrivet renat glutation S-transferas (GST)-märkt TRP 1261-1275-fragment till Ni-pärlorna för att konkurrera med TRP-kanalen. Slutligen separerades TRP-kanalen i supernatanten från den överdrivna TRP 1261-1275-peptiden genom storleksuteslutningskromatografi. Denna metod gör det möjligt att studera gatingmekanismen hos Drosophila TRP-kanalen från både biokemiska och strukturella vinklar. Elektrofysiologiska egenskaper hos renade Drosophila TRP-kanaler kan också mätas i framtiden.
Introduction
Fototransduktion är en process där absorberade fotoner omvandlas till elektriska koder för neuroner. Det vidarebefordrar uteslutande opsiner och följande G-proteinkopplade signalkaskad hos både ryggradsdjur och ryggradslösa djur. I Drosophila, genom att använda sina fem PDZ-domäner, organiserar scaffold protein inactivation-no-after-potential D (INAD) ett supramolekylärt signalkomplex, som består av en övergående receptorpotential (TRP) kanal, fosfolipas Cβ / No receptorpotential A (PLCβ / NORPA) och ögonspecifikt proteinkinas C (ePKC)1. Bildandet av detta supramolekylära signalkomplex garanterar korrekt subcellulär lokalisering, hög effektivitet och specificitet hos Drosophila fototransduktionsmaskineri. I detta komplex fungerar ljuskänsliga TRP-kanaler som nedströms effektorer av NORPA och förmedlar kalciuminflöde och depolarisering av fotoreceptorer. Tidigare studier visade att öppningen av Drosophila TRP-kanalen förmedlas av protoner, störningar i den lokala lipidmiljön eller mekanisk kraft 2,3,4. Drosophila TRP-kanalen interagerar också med kalmodulin5 och moduleras av kalcium genom både positiv och negativ återkoppling 6,7,8.
Hittills har elektrofysiologiska studier av grindmekanismen för Drosophila TRP- och TRP-liknande (TRPL) kanaler baserats på utskurna membranplåster, helcellsinspelningar från dissocierade Drosophila-fotoreceptorer av vild typ och hetero-uttryckta kanaler i S2-, SF9- eller HEK-celler 2,9,10,11,12,13, men inte på renade kanaler. Den strukturella informationen om Drosophila TRP-kanalen i full längd är också oklar. För att studera de elektrofysiologiska egenskaperna hos renat protein i en rekonstituerad membranmiljö och för att få strukturell information om Drosophila TRP-kanalen i full längd är erhållande av renade TRP-kanaler i full längd det nödvändiga första steget, liknande de metoder som används i däggdjurs TRP-kanalstudier 14,15,16,17.
Nyligen, baserat på monteringsmekanismen för INAD-proteinkomplex 18,19,20, utvecklades först en affinitetsrening plus konkurrensstrategi för att rena TRP-kanalen från Drosophila-huvudhomogenater med streptavidinpärlor 5. Med tanke på den låga kapaciteten och dyra kostnaden för streptavidinpärlor introduceras här ett förbättrat reningsprotokoll som använder His-taggat beteprotein och motsvarande billiga Ni-pärlor med mycket högre kapacitet. Den föreslagna metoden kommer att bidra till att studera TRP-kanalens grindmekanism från strukturella vinklar och att mäta de elektrofysiologiska egenskaperna hos TRP-kanalen med renade proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rening av GST-märkta TRP- och His-taggade NORPA-fragment
- Rena GST-märkt TRP 1261-1275-fragment
- Omvandla pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 plasmid10 till Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) celler med hjälp av CaCl2 värmechocktransformationsmetod21. Inokulera en enda koloni i 10 ml Luria Bertani (LB) medium och växa över natten vid 37 °C. Förstärk sedan 10 ml såddkultur i 1 liter LB-medium vid 37 °C.
- När cellernas optiska densitet (OD600) når 0,5, kyl ner cellerna till 16 °C och tillsätt 0,1 mM isopropyl β-D-1-tiolaktopyranosid (IPTG; slutlig koncentration) för att inducera överuttrycket av målproteinet och inkubera vid 16 °C i 18 timmar.
- Efter överuttryck pelleterar 1 liter odlade celler genom centrifugering vid 3,993 × g i 20 min och återsuspenderas i 40 ml fosfatbuffrad saltlösningsbuffert (PBS).
- Ladda de återsuspenderade cellerna i en högtryckshomogenisator som förkylts vid 4 °C. Öka långsamt homogenisatortrycket till 800 bar. Öppna inloppskranen och låt de återsuspenderade cellerna cirkulärt passera genom en ventil med mycket smala slitsar.
OBS: Cellerna homogeniseras av de höga skjuvkrafterna som orsakas av ett stort tryckfall och kavitation. - Ladda 5 ml glutationpärlor till en tyngdkraftsflödeskolonn och tvätta pärlorna med 50 ml PBS-buffert totalt tre gånger.
- Centrifugera celllysaten från högtryckshomogenisatorn vid 48 384 x g. Tillsätt supernatanten i den centrifugerade celllysaten (40 ml) till de ekvilibrerade glutationpärlorna i gravitationsflödeskolonnen och inkubera i 30 minuter vid 4 °C. Resuspend glutationpärlorna var 10: e minut.
- Efter 30 minuters inkubation öppnar du kolonnutloppskranen för att separera pärlorna och genomströmningsfraktionen. Kassera genomströmningsfraktionen. Skölj de återstående glutationpärlorna två gånger med 50 ml PBS-buffert.
- Tillsätt 15 ml elueringsbuffert till glutationpärlorna och inkubera i 30 minuter. Resuspend pärlorna var 10: e min.
- Efter 30 minuters inkubation eluera det GST-märkta TRP 1261-1275-fragmentet i ett 50 ml koniskt rör och ladda i en storleksuteslutningskolonn (beredningskvalitet), som likställs med 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) buffert.
- Håll elueringsflödet för storleksuteslutningskolonnen till 3 ml/min. Samla upp de eluerade proteinerna med en hastighet av 5 ml/rör.
- Identifiera toppen av målproteinet i storleksuteslutningskolonnen genom att analysera UV-absorptionssignalerna vid 280 nm och verifiera med SDS-PAGE-gelanalys (elektroforesparametrar: 150 V för staplingsgelen; 200 V för den upplösande gelén). Färga gelén med Coomassie blå R250.
- Koncentrera det renade GST-märkta TRP 1261-1275-fragmentet från storleksuteslutningskolonnen till 1 ml med hjälp av en 15 ml ultrafiltreringsspinnkolonn centrifugerad vid 3 000 x g vid 4 °C i en kylcentrifug på skrivbordet.
- Bestäm koncentrationen av koncentrerat protein med hjälp av Beer-Lambert-lagen. Mät UV-absorptionen av GST-märkt TRP 1261-1275-fragment vid 280 nm med hjälp av en spektrofotometer.
- Erhåll utrotningskoefficienten vid 280 nm genom att importera proteinsekvenserna till Protparam-programmet (https://web.expasy.org/protparam/). Typiskt ger 1 L-odling av GST-märkt TRP 1261-1275 1 ml 600 μM protein (6 x 10-7 mol). Se tabell 1 för material som behövs.
- Rening av His-taggat NORPA 863-1095 fragment
- Transformera pETM.3C NORPA 863-1095 plasmid20 till E. coli BL21 (DE3) celler med hjälp av CaCl2 värmechocktransformationsmetoden21. Inokulera en enda koloni i 10 ml LB-medium och växa över natten vid 37 °C. Förstärk sedan 10 ml såddkulturen i 1 liter LB-medium vid 37 °C.
- När OD600 av cellerna når 0,5, kyl ner cellerna till 16 °C och tillsätt 0,1 mM IPTG (slutkoncentration) för att inducera överuttryck av målprotein och inkubera vid 16 °C i 18 timmar.
- Efter överuttryck pelleterar 1 liter odlade celler genom centrifugering vid 3,993 x g i 20 min och återsuspenderas i 40 ml bindningsbuffert. Lysera därefter de återsuspenderade cellerna i en högtryckshomogenisator vid 4 °C enligt beskrivningen i steg 1.1.4.
- Ladda 5 ml Ni-pärlor i en tyngdkraftsflödeskolonn och tvätta tre gånger med 50 ml bindningsbuffert.
- Centrifugera celllysaten från högtryckshomogenisatorn vid 48 384 x g. Tillsätt supernatanten i den centrifugerade celllysaten till de ekvilibrerade Ni-pärlorna i gravitationsflödeskolonnen och inkubera i 30 minuter vid 4 °C. Resuspend Ni-pärlorna var 10: e minut.
- Efter 30 minuters inkubation öppnar du kolonnutloppskranen för att separera pärlorna och genomströmningsfraktionen. Kassera genomströmningsfraktionen och tvätta de återstående Ni-pärlorna två gånger med 50 ml tvättbuffert.
- Tillsätt 15 ml elueringsbuffert till Ni-pärlorna och inkubera i 30 minuter. Resuspend Ni-pärlorna var 10: e minut.
- Efter 30 minuters inkubation, samla upp det eluerade His-märkta NORPA 863-1095-fragmentet i ett 50 ml koniskt rör och ladda i en storleksuteslutningskolonn (beredningskvalitet), som utjämnas med 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
- Håll elueringsflödet för storleksuteslutningskolonnen till 3 ml/min. Samla upp det eluerade proteinet med en hastighet av 5 ml/rör.
- Identifiera toppen av målproteinet i storleksuteslutningskolonnen genom att analysera UV-absorptionssignalerna vid 280 nm och verifiera med SDS-PAGE-gelanalys (elektroforesparametrar: 150 V för staplingsgelen; 200 V för den upplösande gelén). Färga gelén med Coomassie blå R250.
- Koncentrera det renade His-märkta NORPA 863-1095-fragmentet från storleksuteslutningskolonnen till 1 ml med hjälp av en 15 ml ultrafiltreringsspinnkolonn centrifugerad vid 3 000 x g vid 4 °C i en kylcentrifug på skrivbordet.
- Bestäm koncentrationen av koncentrerat protein med hjälp av Beer-Lambert-lagen. Mät UV-absorptionen av His-taggade NORPA 863-1095-fragment vid 280 nm med hjälp av en spektrofotometer.
- Erhåll utrotningskoefficienten vid 280 nm genom att importera proteinsekvenserna till Protparam-programmet (https://web.expasy.org/protparam/). Typiskt ger 1 L-odling av His-taggat NORPA 863-1095-fragment 1 ml 600 μM protein (6 x 10-7 mol). Se tabell 2 för material som behövs.
2. Beredning av Drosophila-huvuden
- Samla vuxna flugor i 50 ml koniska centrifugeringsrör med co2-bedövningsmetoden22,23. frys omedelbart i flytande kväve i 10 min och förvara i en frys på -80 °C.
- Efter att ha samlat ett tillräckligt antal flugor, skaka kraftigt de frusna 50 ml koniska rören för hand för att separera flugornas ben, huvuden, vingar och kroppar. Överför blandningen till tre sekventiellt staplade förkylda siktar av rostfritt stål (20/30/40 maskstorlek) och skaka siktarna.
- Därefter, eftersom huvudena inte kan passera genom sikten med 40 maskor, använd en borste för att sopa flughuvudena från sikten med 40 maskor, överför dem till 50 ml koniska rör och förvara dem vid −80 °C.
- Samla kontinuerligt flugorna och deras huvuden och förvara dem i en frys på -80 °C tills de når den mängd som krävs för experiment (0,5 g). För att samla 0,5 g huvuden behövs vanligtvis 35 ml flugor i ett 50 ml koniskt rör. Se tabell 3 för material som behövs.
3. Drosophila TRP-kanalrening
- Väg totalt 0,5 g huvuden och homogenisera helt i flytande kväve med hjälp av en förkyld mortelstöt. Lös upp de homogeniserade huvudena i 10x v/w lysbuffert (5 ml), inkubera i en shaker vid 4 °C i 20 min och centrifugera sedan vid 20,817 x g i 20 min vid 4 °C.
- Samla upp den nedsnurna supernatanten ("20817 g S", figur 4) och centrifugera den ytterligare vid 100 000 x g i 60 minuter vid 4 °C. Använd spin-down supernatanten ("100 000 g S", figur 4) för följande nedrullningsanalys.
- Tillsätt 1 ml Ni-pärlor i gravitationsflödeskolonnen och tvätta pärlorna med 10 ml dubbeldestilleradH2O(ddH2O) vid 4 °C i totalt tre gånger. Balansera pärlorna med 10 kolonnvolymer lysbuffert tre gånger vid 4 °C.
- Tillsätt 500 μL 600 μM renat His-taggat NORPA 863-1095-protein (3 x 10-7 mol) i Ni-kolonnen och inkubera i 30 min vid 4 °C. Resuspend pärlorna var 10: e min.
- Öppna kolonnutloppskranen för att separera pärlorna och genomströmningsfraktionen. Ta genomströmningsfraktionen för SDS-PAGE-analys (NORPA F, figur 4). I detta avsnitt immobiliseras beteproteinerna på Ni-pärlorna.
- Tvätta Ni-pärlorna med 10 kolonnvolymer lysbuffert (10 ml) vid 4 °C och behåll tvättfraktionen för SDS-PAGE-analys (tvätt 1, figur 4A). Upprepa stegen ovan och behåll provet för SDS-PAGE-analys (tvätt 2, figur 4A). I detta avsnitt avlägsnas de överdrivna beteproteinerna på Ni-pärlorna.
- Tillsätt supernatanten av Drosophila-huvudhomogenat efter 100 000 x g centrifugering i Ni-kolonnen vid 4 °C, där det His-märkta NORPA 863-1095-fragmentet har immobiliserats.
- Inkubera supernatanten med Ni-pärlorna vid 4 °C i 30 minuter. Resuspend pärlorna var 10: e min. Öppna sedan kolonnutloppskranen för att separera pärlorna och genomströmningsfraktionen.
- Samla supernatanten för SDS-PAGE-analys (Dro-huvudlys F, figur 4A). I detta avsnitt fångas INAD-proteinkomplexen (INAD / TRP / ePKC) i huvudhomogenaten av de immobiliserade NORPA 863-1095-fragmenten på Ni-pärlorna.
- Tvätta Ni-pärlorna med 10 kolonnvolymer lysbuffert (10 ml) vid 4 °C och håll supernatanten från gravitationsutfällning för SDS-PAGE-analys (tvätt 3, figur 4A). Upprepa stegen ovan och samla in supernatanten för SDS-PAGE-analys (tvätt 4, figur 4A). I detta avsnitt avlägsnas de obundna proteinerna på Ni-pärlorna.
- Tillsätt 500 μL 600 μM GST-märkt TRP 1261-1275-protein (3 x 10-7 mol) i Ni-pärlorna och inkubera i 20 minuter vid 4 °C. Resuspend pärlorna var 10: e min.
- Samla den eluerade fraktionen från tyngdkraftskolonnen (TRP E1, figur 4B), som innehåller den endogena Drosophila TRP-kanalen. Upprepa stegen ovan och samla in elueringsfraktionen (TRP E2, figur 4B). I det här steget, genom att använda de GST-märkta TRP 1261-1275-fragmenten som konkurrent, elueras TRP-kanalerna från de fångade INAD-proteinkomplexen (INAD / TRP / ePKC) på Ni-pärlorna.
- Tvätta Ni-pärlorna med 10 kolonnvolymer bindande buffert (10 ml; Tabell 1) vid 4 °C och samla upp tvättfraktionen för SDS-PAGE-analys (tvätt 5, figur 4B).
- Tillsätt 500 μL elueringsbuffert (tabell 1) i Ni-pärlorna och inkubera i 20 minuter vid 4 °C. Samla upp elueringsfraktionen från gravitationsflödeskolonnen (NORPA E1, figur 4B). Upprepa stegen ovan och samla upp elueringsfraktionen (NORPA E2, figur 4B).
- Använd elueringsbufferten och eluera det His-taggade NORPA 863-1095-fragmentet tillsammans med INAD / ePKC-proteinkomplexen. Därefter återsuspendera Ni-pärlorna i 500 μL bindningsbuffert.
- Ta de återsuspenderade Ni-pärlorna för att köra SDS-PAGE (färgad av Coomassie blå R250) för att analysera elueringens effektivitet och utvärdera om elutebufferten fungerar (pärlor, figur 4B). Se tabell 4 för material som behövs.
4. Storleksuteslutningskolonnrening av Drosophila TRP-kanal
- Installera en storleksuteslutningskolonn (analytisk kvalitet) på proteinreningssystemet. Balansera kolonnen med kolonnbufferten (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), som filtreras med ett 0,45 μm filter.
- Koncentrera TRP E1- och E2-fraktionen från steg 3.14 med hjälp av en 4 ml ultrafiltreringsspinnkolonn, centrifugerad vid 3 000 x g vid 4 °C i en kylcentrifug.
- Skölj provslingan med kolonnbufferten och ladda provet i provslingan. Injicera provet i storleksuteslutningskolonnen och eluera proteinerna med en korrekt flödeshastighet (0,5 ml/min).
- Identifiera toppen av målproteinet genom absorption vid 280 nm och kör en SDS-PAGE-gel för att detektera den renade endogena Drosophila TRP-kanalen (figur 5). Se tabell 5 för material som behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna artikel demonstreras en proteinreningsmetod för att rena endogen Drosophila TRP-kanal (Figur 1).
Först appliceras rekombinant proteinuttryck och rening för att erhålla betet och konkurrerande proteiner. Därefter uttrycks ett GST-märkt TRP 1261-1275-fragment i E. coli BL21 (DE3) -celler i LB-medium och renas med glutationpärlor och en storleksuteslutningskolonn (figur 2). Proverna verifierades med SDS-PAGE-analys med Coomassie-blå R250-färgning. I sds-page-provberedningsprocessen blandas 30 μl proteinprov med 10 μl 4x laddningsfärgämne och kokas vid 100 °C i 10 min. Därefter laddas 15 μL kokt prov individuellt i varje brunn. Det His-taggade NORPA 863-1095-fragmentet uttrycks också på liknande sätt i E. coli BL21 (DE3) -celler i LB-medium och renas av Ni-pärlor och storleksuteslutningskolonn (figur 3). De renade GST-märkta TRP 1261-1275 och His-taggade NORPA 863-1095 är koncentrerade för rening av den endogena Drosophila TRP-kanalen.
För det andra samlas Drosophila-huvuden upp och homogeniseras i flytande kväve med användning av en förkyld mortelstöt och löses sedan i 10x v / w lysbuffert (tabell 4). Homogenatet med upplöst huvud inkuberas i en skakapparat vid 4 °C i 20 minuter och centrifugeras vid 20,817 x g i 20 minuter vid 4 °C. Spin-down supernatanten (20817 g S, figur 4A) samlas upp och centrifugeras ytterligare vid 100 000 x g i 60 minuter vid 4 °C. Den andra spin-down supernatanten (100 000 g S, figur 4A) används för den efterföljande neddragningsanalysen.
Slutligen, baserat på principerna för pull-down och konkurrensanalys, används affinitetsrening plus konkurrensstrategi för att rena den endogena TRP-kanalen. Det renade His-taggade NORPA 863-1095-fragmentet är bundet till Ni-pärlor och används som bete för att dra ner de endogena INAD-proteinkomplexen från Drosophila-huvudhomogenater. Sedan läggs överdrivet renat GST-taggat TRP 1261-1275-fragment till för att konkurrera om TRP-kanalen från de fångade INAD-komplexen på Ni-pärlorna (TRP E1, TRP E2, Figur 4B). I slutändan separeras den eluerade TRP-kanalen från den överdrivna GST-märkta TRP 1261-1275-peptiden genom storleksuteslutningskromatografi (figur 5). I sds-page-provberedningsprocessen blandas 30 μl proteinprov med 10 μl 4x laddningsfärgämne och kokas vid 100 °C i 10 min. Därefter laddas provet på 15 μl individuellt i varje brunn. Som en biprodukt kan INAD-ePKC-NORPA 863-1095-komplexen också erhållas genom att eluera Ni-pärlorna efter TRP 1261-1275 peptidkonkurrens (NORPA E1, NORAP E2, Figur 4B). Med hjälp av denna metod är det typiska utbytet av den slutliga renade Drosophila TRP-kanalen från 0,5 g flughuvuden 50 μL 3 μM TRP-protein (1,5 x 10-10 mol). Om fler renade TRP-kanaler behövs, skala upp mängden flughuvuden, Ni-pärlor, beteprotein och konkurrent på motsvarande sätt.
Figur 1: Det schematiska diagrammet för rening av endogen Drosophila TRP-kanal. (B) Drosophila-huvuden homogeniseras och spin-down-supernatanten efter 100 000 x g centrifugering tillsätts till de NORPA-bundna Ni-pärlorna, där NORPA 863-1095-proteinet fungerar som bete för att fånga de endogena INAD-proteinkomplexen (INAD / TRP / ePKC). (C) Det GST-märkta TRP 1261-1275-fragmentet tillsätts för att konkurrera om den endogena Drosophila TRP-kanalen från de fångade INAD-proteinkomplexen. (D) Det eluerade TRP-proteinet renas ytterligare med en storleksuteslutningskolonn för att separera det alltför stora GST-märkta TRP 1261-1275-fragmentet. De röda pilarna markerar elueringspositionerna för TRP-kanalen respektive GST-taggade TRP 1261-1275-fragmentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Rening av GST-märkt TRP-CT 1261-1275-protein med glutationpärlor och storleksuteslutningskromatografi. Fraktionerna samlas upp vid 5 ml/rör. Fraktionerna vid pilpositionen (rör 44-48) samlas upp och koncentreras för följande rening av den endogena TRP-kanalen. (B) Coomassie blå R250-färgad SDS-PAGE-gel som visar det GST-märkta TRP 1261-1275-fragmentet i glutation-pärlornas affinitetsrening och efterföljande storleksuteslutningskolonnrening. Pilen markerar positionen för det GST-märkta TRP 1261-1275-fragmentet i SDS-PAGE-gelén. Förkortningar: P: pellet från E. coli. BL21 (DE3) celllysat efter homogenisering i PBS-buffert och centrifugering vid 48,384 x g; S: supernatant från E. coli. BL21 (DE3) celllysat efter homogenisering och centrifugering vid 48,384 x g; F: genomströmningsfraktion efter föregående S-fraktion inkuberad med glutationpärlor i 30 minuter vid 4 °C; W1 och W2: den första och andra tvättfraktionen med 10 kolonnvolymer pbs-buffert. B: Ej eluerat protein på de återsuspenderade glutationpärlorna analyseras av SDS-PAGE-gel för att utvärdera elueringseffektiviteten; E: elueringsfraktion från glutationpärlor med elueringsbuffert. Buffertreceptet för den GST-märkta proteinreningen beskrivs i tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Rening av His-taggat NORPA 863-1095-protein med Ni-pärlor och storleksuteslutningskromatografi. Flödeshastighet = 3 ml /min. Fraktionerna samlas upp vid 5 ml/rör. Fraktionerna vid pilpositionen (rör 44-49) samlas upp och koncentreras för följande rening av den endogena TRP-kanalen. (B) Coomassie blå R250-färgad SDS-PAGE-gel som visar det His-märkta NORPA 863-1095-proteinet vid rening av nikolonnrening och efterföljande storleksexkluderingskolonnrening. Pilen markerar positionen för His-taggat NORPA 863-1095-protein i SDS-PAGE-gelén. Förkortningar: P: pellet från E. coli. BL21 (DE3) celllysat efter homogenisering i bindningsbuffert och centrifugering vid 48,384 x g; S: supernatantfraktion från E. coli. BL21 (DE3) celllysat efter homogenisering och centrifugering vid 48,384 x g; F: genomströmningsfraktion efter det att den föregående S-fraktionen inkuberats med Ni-pärlor i 30 minuter vid 4 °C; W1 och W2: den första och andra tvättfraktionen med 10 kolonnvolymer tvättbuffert. B: Ej eluerat protein på de återsuspenderade Ni-pärlorna efter eluering; E: Elueringsfraktioner från Ni-pärlor med elueringsbufferten. Buffertreceptet för histaggad proteinrening anges i tabell 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Rening av endogen Drosophila TRP-kanal. De insamlade proverna från varje steg analyseras av SDS-PAGE och färgas med Coomassie blå R-250 färgämne. A) 20817 g S: supernatant fraktion av huvudhomogenater efter 20,817 x g centrifugering. NORPA F: genomströmningsfraktion av Ni-pärlor efter His-taggad NORPA 863-1095 fragmentbindning; Tvätt1 och tvätt2: den första och andra tvättfraktionen av Ni-pärlor genom lysbuffert efter His-märkt NORPA 863-1095-bindning; 100 000 g S: den föregående supernatanten på 20 817 g S centrifugeras ytterligare vid 100 000 x g och supernatanten samlas upp för SDS-PAGE; Drohuvudlys F: genomströmningsfraktion av Ni-pärlor efter inkubation med provet 100 000 g S. Tvätt3 och Tvätt4: Tvättfraktioner av Ni-pärlor genom lysbuffert efter inkubation med 100 000 g S prov. B) TRP E1 och E2: den första och andra eluerade TRP-kanalfraktionen med GST-märkt TRP 1261-1275-fragment. Tvätt5: tvättfraktioner av Ni-pärlor genom bindande buffert efter tävling av GST-märkta TRP 1261-1275; NORPA E1 och E2: den första och andra elueringsfraktionen av His-märkta NORPA 863-1095-fragment med fångade INAD / ePKC-komplex; pärlor: icke-eluerat protein som stannar kvar i de återsuspenderade Ni-pärlorna efter elueringsbuffertbehandling. Buffertreceptet för endogen Drosophila TRP-kanalrening beskrivs i tabell 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Rening av endogent Drosophila TRP-kanalprotein genom storleksuteslutningskromatografi. (A) Reningsprofil för endogent Drosophila TRP-kanalprotein i storleksuteslutningskolonn. Flödeshastighet = 0,5 ml/min. Fraktionerna samlades upp vid 0,5 ml/rör. Fraktionerna vid pilpositionen (1E8-1F2) samlades in och koncentrerades. (B) Coomassie blå R-250 färgad SDS-PAGE-gel som visar det endogena Drosophila TRP-kanalproteinet efter storleksuteslutningskolonnrening. Positionen för renat endogent Drosophila TRP-kanalprotein markeras med den röda pilen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Material som behövs för rening av det GST-märkta TRP 1261-1275-fragmentet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Material som behövs för rening av det His-märkta NORPA 863-1095-fragmentet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Material som behövs för beredning av Drosophila-huvuden .
Tabell 4: Material som behövs för rening av Drosophila TRP-kanal.
Tabell 5: Material som behövs för storleksuteslutning av kolonnrening av Drosophila TRP-kanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
INAD, som innehåller fem PDZ-domäner, är kärnorganisatören av Drosophila fototransduktionsmaskineri. Tidigare studier visade att INAD PDZ3 binder till TRP-kanalens C-terminala svans med utsökt specificitet (KD = 0,3 μM)18. INAD PDZ45 tandem interagerar med NORPA 863-1095 fragment med en extremt hög bindningsaffinitet (KD = 30 nM). Dessa fynd ger en solid biokemisk grund för att utforma affinitetsrening plus konkurrensstrategi, vilket gör att NORPA CC-PBM-fragmentet kan användas som pulldown-bete, medan TRP C-terminal svans (fragment 1261-1275) fungerar som ett konkurrenskraftigt reagens. Därför är den första kritiska punkten för denna metod att förstå monteringsmekanismen för INAD-komplexet och erhålla tillräckligt med NORPA- och TRP-fragment. Samtidigt, eftersom TRP-kanalen är membranproteinet som måste extraheras från membranet och stabiliseras i lösning, är användningen av tvättmedel den andra kritiska punkten i denna metod. Som ett populärt tvättmedel för strukturella och funktionella studier av TRP-kanaler 24,25 används n-Dodecyl-B-D-Maltoside (DDM) i denna metod. Om reningsresultaten är otillfredsställande måste egenskaperna hos beteproteinet, konkurrentproteinet och tvättmedlet kontrolleras noggrant. Dessutom kan extraktionseffektiviteten hos TRP-kanalerna spåras av western blot med användning av TRP-antikroppen.
I en tidigare studie5 användes dyra streptavidinpärlor för att rena TRP-kanalen från flughuvudextrakt, vilket begränsar rutinmässig rening i labbet. Därför förbättrades metoden genom att använda ett His-taggat NORPA 863-1095-fragment i kombination med Ni-pärlor för att minska kostnaderna och öka avkastningen. För närvarande är utbytet av den renade TRP-kanalen i den förbättrade metoden tillräckliga för att genomföra ett transmissionselektronmikroskop (TEM) negativt färgningsexperiment, där de renade TRP-kanalerna bildar tetramerer (data visas inte), vilket indikerar att reningsprocessen inte stör tetramerbildningen av TRP-kanaler. Därför kommer detta protokoll att vara potentiellt lämpligt för framtida kryo-EM- och elektrofysiologiska experiment.
Men eftersom konkurrenterna som används i experimenten (NORPA 863-1095-fragment, TRP 1261-1275-fragment) har liknande bindningsaffiniteter med vildtypsproteiner, är begränsningen med denna metod att massiva konkurrenskraftiga proteiner och pärlor måste användas för att dra ner målproteinet. Det kommer inte att vara bekvämt för laboratorier som inte kan rena betet i stor skala.
En potentiell framtida tillämpning av denna metod kommer att vara att studera den strukturella informationen om Drosophila TRP-kanalen med hjälp av Cryo-EM-tekniker. Dessutom är det också möjligt att mäta de elektrofysiologiska egenskaperna hos renade endogena TRP-kanaler i det konstgjorda dubbelskiktslipidmembranet. Dessutom kommer det i detta rekonstituerade modellsystem att vara intressant att karakterisera de elektrofysiologiska egenskaperna hos renade endogena TRP-kanaler genom att modulera INAD-komplexkompositionen och lipidkompositionen. Slutligen, i kombination med strukturell information och elektrofysiologiska egenskaper, kan TRP-kanalens grind- och regleringsmekanismer noggrant undersökas i framtiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) och Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr 2021A1515010796) till W. L. Vi tackar LetPub (www.letpub.com) för dess språkliga hjälp under utarbetandet av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| BL21(DE3) Competent Cells | Novagen | 69450 | Protein overexpression |
| Experiment models | |||
| D.melanogaster: W1118 strain | Bloomington Drosophila Stock Center | BDSC:3605 | Drosophila head preparation |
| Material | |||
| 20/30/40 mesh stainless steel sieves | Jiufeng metal mesh company | GB/T6003.1 | Drosophila head preparation |
| 30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) | Lablead | A3291 | SDS-PAGE gel preparation |
| Ammonium Persulfate | Invitrogen | HC2005 | SDS-PAGE gel preparation |
| Cocktail protease inhibitor | Roche | 05892953001 | Protease inhibitor |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech | A100472-0025 | SDS-PAGE gel staining |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sangon Biotech | A620058-0100 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) | Sangon Biotech | A500838-0500 | Size-exclusion column buffer preparation |
| Glycine | Sangon Biotech | A610235-0005 | SDS-PAGE buffer preparation |
| Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads | Cytiva | 17513202 | Affinity chromatography |
| Imidazole | Sangon Biotech | A500529-0001 | Elution buffer preparation for Ni-column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sangon Biotech | A600168-0025 | Induction of protein overexpression |
| LB Broth Powder | Sangon Biotech | A507002-0250 | E.coli. cell culture |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma-aldrich | G4251-100G | Elution buffer preparation for Glutathione beads |
| Ni-Sepharose excel beads | Cytiva | 17371202 | Affinity chromatography |
| N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) | Sangon Biotech | A610424-001 | Detergent for protein purification |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-aldrich | T9281-100ML | SDS-PAGE gel preparation |
| PBS | Sangon Biotech | E607008-0500 | Homogenization buffer for E.coli. cell |
| PMSF | Lablead | P0754-25G | Protease inhibitor |
| Prestained protein marker | Thermo Scientific | 26619/26616 | Prestained protein ladder |
| Size exclusion column (preparation grade) | Cytiva | 28989336 | HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column |
| Size exclusion column (analytical grade) | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL column |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A501218-0001 | Protein purification buffer preparation |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sangon Biotech | A500228-0001 | SDS-PAGE gel/buffer preparation |
| Tris base | Sigma-aldrich | T1503-10KG | Protein purification buffer preparation |
| Ultrafiltration spin column | Millipore | UFC901096/801096 | Protein concentration |
| Equipment | |||
| Analytical Balance | DENVER | APX-60 | Metage of Drosophila head |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes | Eppendorf | 5810R | Protein concentration |
| Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes | Eppendorf | 5417R | Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) | Bio-Rad | 738-0015 | TRP protein purification |
| Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) | Bio-Rad | 738-0017 | Bait and competitor protein purification from E.coli. |
| Gel Documentation System | Bio-Rad | Universal Hood II Gel Doc XR System | SDS-PAGE imaging |
| High-speed refrigerated centrifuge | Beckman coulter | Avanti J-26 XP | Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate |
| High pressure homogenizer | UNION-BIOTECH | UH-05 | Homogenization of E.coli. cells |
| Liquid nitrogen tank | Taylor-Wharton | CX-100 | Drosophila head preparation |
| Protein purification system | Cytiva | AKTA purifier | Protein purification |
| Refrigerator (-80°C) | Thermo | 900GP | Drosophila head preparation |
| Spectrophotometer | MAPADA | UV-1200 | OD600 measurement of E.coli. cells |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | Determination of protein concentration |
| Ultracentrifuge | Beckman coulter | Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Ultracentrifugation |
References
- Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
- Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
- Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
- Hardie, R. C., Franze, K.
- Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
- Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
- Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
- Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
- Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
- Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
- Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
- Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
- Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
- Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
- Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
- Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
- Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
- Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
- Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
- Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
- Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).
- Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
- Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
- Hellmich, U. A., Gaudet, R.
