Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Fibertype og subcellulær-specifik analyse af lipiddråbeindhold i skeletmuskulatur

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63718
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Medical Sector, Université Catholique de Louvain, 2Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

Summary

Stigende beviser tyder på, at overdreven infiltration af lipider inde i skeletmuskulaturen resulterer i lipotoksicitet og diabetes. Her præsenterer vi en komplet protokol, herunder vævsbehandling, farvning med Bodipy, billedoptagelse og analyse, for at kvantificere størrelsen, densiteten og den subcellulære fordeling af lipiddråber på en fibertypespecifik måde.

Abstract

Skeletmuskel lipid infiltration, kendt som myosteatose, stiger med fedme og aldring. Myosteatose er også for nylig blevet opdaget som en negativ prognostisk faktor for flere andre lidelser såsom hjerte-kar-sygdomme og kræft. Overdreven lipidinfiltration nedsætter muskelmasse og styrke. Det resulterer også i lipotoksicitet og insulinresistens afhængigt af total intramyocellulært lipidindhold, lipiddråbe (LD) morfologi og subcellulær fordeling. Fibertype (oxidativ vs glykolytisk) er også vigtig, da oxidative fibre har større kapacitet til at udnytte lipider. På grund af deres afgørende implikationer i patofysiologi er dybtgående undersøgelser af LD-dynamik og funktion på en fibertypespecifik måde berettiget.

Heri præsenteres en komplet protokol til kvantificering af intramyocellulært lipidindhold og analyse af LD-morfologi og subcellulær fordeling på en fibertypespecifik måde. Til dette formål blev serielle muskelkryosektioner farvet med det fluorescerende farvestof Bodipy og antistoffer mod myosin tunge kædeisoformer. Denne protokol muliggør samtidig behandling af forskellige muskler, hvilket sparer tid og undgår mulige artefakter, og takket være en personlig makro oprettet i Fiji er automatisering af LD-analyse også mulig.

Introduction

Skeletmuskel lipid infiltration, kendt som myosteatose, stiger med fedme og aldring. Myosteatose er negativt korreleret med muskelmasse og styrke og med insulinfølsomhed1. Desuden viser nylige undersøgelser, at graden af myosteatose kan anvendes som en prognostisk faktor for andre tilstande såsom hjerte-kar-sygdom2, ikke-alkoholisk fedtleversygdom3 eller kræft4. Lipider kan akkumuleres i skeletmuskulatur mellem muskelfibre som ekstramyocellulære lipider eller i fibrene, som intramyocellulære lipider (IMCLs). IMCL'er opbevares overvejende som triglycerider i lipiddråber (LD'er), der anvendes som metabolisk brændstof under fysisk træning 5,6. Men når lipidforsyningen overstiger efterspørgslen, eller når mitokondrier bliver dysfunktionelle, vil IMCLs være impliceret i muskelinsulinresistens, som det ses hos metabolisk usunde, overvægtige individer og hos type 2-diabetespatienter7. Spændende nok har udholdenhedsatleter lignende, hvis ikke højere, niveauer af IMCLs til dem, der findes hos overvægtige patienter med type 2-diabetes mellitus, samtidig med at de opretholder høj insulinfølsomhed. Dette fænomen beskrives som "atletens paradoks"8,9 og forklares ved en mere nuanceret vurdering af muskel-ID'er relateret til deres størrelse, tæthed, lokalisering, dynamik og lipidartssammensætning.

For det første er LD-størrelse omvendt korreleret med insulinfølsomhed og fysisk kondition10,11. Faktisk udviser mindre LD'er et relativt større overfladeareal til lipasevirkning og har således potentielt en større kapacitet til at mobilisere lipider12. For det andet spiller LD-densitet (tal/overflade) en kontroversiel rolle i insulinvirkning 8,10; alligevel ser det ud til at være øget hos atleter. For det tredje er den subcellulære lokalisering af LD'er vigtig, da LD'er placeret lige under overflademembranen (subsarcolemmal eller perifer) udøver en mere skadelig virkning på insulinfølsomheden end centrale 8,9,13. Sidstnævnte giver brændstof til centrale mitokondrier, som har en større respiratorisk aktivitet og er mere specialiserede til at imødekomme det høje energibehov, der kræves til sammentrækning14. I modsætning hertil leverer perifere LD'er subsarcolemmale mitokondrier, som er involveret i membranrelaterede processer8. Endelig, ud over triglycerider, kan specifikke komplekse lipider i musklen være mere skadelige end andre. For eksempel kan diacylglycerol, langkædet acyl-CoA og ceramider akkumulere i muskler, når triglyceridomsætningshastigheden er lav, hvilket forringer insulinsignalering 9,15. For at vende tilbage til "atletens paradoks" har udholdenhedsatleter et stort antal mindre centrale LD'er med forhøjede omsætningshastigheder i type I (oxidative) fibre, mens overvægtige og diabetespatienter har større perifere LD'er med lave omsætningshastigheder i type II (glykolytiske) fibre 8,15,16. Ud over deres rolle i energilagring og frigivelse kunne LD'er via afledte fedtsyrer (FA) og et pelsprotein (perilipin 5) også fungere som kritiske aktører involveret i transkriptionel regulering af FA-oxidation og mitokondriebiogenese8. På grund af deres afgørende implikationer i fysiologi og patofysiologi er dybtgående undersøgelser af LD'ers dynamik og funktioner berettiget.

Selvom der er flere teknikker til at studere IMCL'er, er de ikke alle egnede til nøjagtigt at kvantificere LD-størrelse, densitet og distribution på en fiberspecifik måde. For eksempel tilbyder vurderingen af IMCLs ved magnetisk resonansspektroskopi, selvom den ikke er invasiv, et opløsningsniveau, der ikke er tilstrækkeligt til at studere størrelsen og den præcise placering af LD'er i fiberen, og det er ikke fibertypespecifikt17,18. Ligeledes kan biokemiske teknikker udført på helmuskelhomogenater19 ikke vurdere placeringen og størrelsen af lipider. Følgelig er den mest passende metode til analyse af LD-morfologi og placering kvantitativ transmissionselektronisk mikroskopi13, men denne teknik er dyr og tidskrævende. Derfor har konfokal fluorescensbilleddannelse på præparater med farvestoffer som Oil Red O (ORO)20,21, monodansylpentan (MDH)22 eller Bodipy 23,24,25 vist sig som det bedste værktøj til disse undersøgelser.

Her beskrives en komplet protokol, herunder vævsprøvetagning og -behandling, Bodipy-farvning og konfokal billedoptagelse og analyse for at kvantificere LD-størrelse, antal og lokalisering i musemuskelkryosektioner. Da IMCL'er ikke er jævnt fordelt mellem oxidative og glykolytiske fibre, og hver fibertype regulerer LD-dynamik forskelligt, skal undersøgelsen af IMCLs være fibertypespecifik 16,25,26,27. Derfor bruger denne protokol immunfluorescens på serielle sektioner til at identificere myosin tung kæde (MyHC) isoform (er) udtrykt af hver fiber. En anden fordel ved denne protokol er samtidig behandling af en glykolytisk (extensor digitorum longus, EDL) og en oxidativ (soleus) muskel placeret side om side før frysning (figur 1). Denne samtidige behandling sparer ikke kun tid, men undgår også variabilitet på grund af separat behandling af prøverne.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over proceduren. Efter muskeldissektion (1) fremstilles udvalgte muskler af samme størrelse og fryses sammen (2). Serielle tværgående sektioner på 10 μm opnås ved anvendelse af en kryostat og monteres direkte på adhæsionsglas (3). Fra to serielle dias er den første (4A) immunmærket for laminin og farvet med Bodipy for at genkende LD'er, og den anden (4B) er immunostained med antistoffer mod MyHC'er til genkendelse af muskelfibertyper. Billeder erhverves ved hjælp af et konfokalt mikroskop til Bodipy (5A) og et epifluorescensmikroskop til muskelfibertyper (5B). Billeder analyseres i Fiji ved at anvende en tærskel og kvantificere partikler (6A) for at opnå antallet, gennemsnitsstørrelsen, densiteten og procentdelen af det samlede areal, der er optaget af LD'er (7) eller tælleceller (6B) for at opnå procentdelen af fibre af hver type i sektionen (7). Forkortelser: LD'er = lipiddråber; EDL = extensor digitorum longus; MyHC'er = myosin tunge kæde isoformer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer udført på mus blev godkendt af Det Etiske Udvalg for Dyreforsøg fra den medicinske sektor ved Université Catholique de Louvain (2019/UCL/MD/013).

1. Dissektion og forberedelse af prøverne til frysning

  1. Mærk et 3 mm tykt stykke kork til hvert par muskler.
  2. Gennem et lille snit lavet med et blad på midten af korken indsættes vinkelret et rektangulært stykke stiv plast (0,5 cm B, 1 cm H), der vil tjene som støtte (figur 2B).
    BEMÆRK: Størrelsen på det rektangulære plaststykke afhænger af muskelens størrelse. Her er de beskrevne dimensioner tilpasset størrelsen på soleus (~ 9 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) og EDL (~ 5 mg, 1 cm L, 2-3 mm W) af en 3 måneder gammel C57BL / 6J hanmus.
  3. På tidspunktet for dissektion skal du fjerne soleus og EDL af musens bagben. For at forhindre, at prøverne tørrer ud under dissektion, skal du placere dem på en komprimering, der er let fugtet med saltopløsning i en petriskål anbragt på is.
    BEMÆRK: Se Wang et al.28 for forklaringer på, hvordan man dissekerer disse to lemmer muskler.
  4. Anbring en lille dråbe optimal skæretemperaturforbindelse (OCT) ved kork/plast-krydset, så du undgår luftbobler.
  5. Fjern overskydende fugt fra prøverne ved forsigtigt at tørre dem med et papirhåndklæde (figur 2A) og læg begge muskler på plasten vinkelret på korken (figur 2C).
  6. Kontroller orienteringen af muskelmyofibre under et stereomikroskop (figur 2D).
    BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at dække musklen med OCT, da dens isolerende virkning forhindrer hurtig frysning og vil producere frysende artefakter.

2. Frysning af skeletmuskelprøver til kryosesektion

FORSIGTIG: Frysning af musklen skal ske under en kemisk hætte iført passende personlige værnemidler (se materialetabellen).

  1. Brug en tumbler i rustfrit stål (~ 8 cm H, 6 cm Ø) med to sidestropper fastgjort til den mindst 25 cm lange (figur 2F), og fyld tumbleren op til 2/3 af dens kapacitet med isopentan.
  2. Tag fat i tumbleren ved stropperne, nedsænk den forsigtigt i en polystyrenkasse fyldt med flydende nitrogen, så nitrogenniveauet uden for beholderen er over niveauet af isopentan indeni (figur 2F, G).
    FORSIGTIG: Når tumbleren kommer i kontakt med nitrogenet, kan det termiske chok forårsage hvirvling. Sørg for, at tumbleren er tilstrækkeligt nedsænket, men undgå indtrængen af nitrogen, da dette ville forårsage isopentanudfældning. Hvis dette sker, lad isopentanen køle af, fyld tumbleren med ny isopentan og start forfra.
  3. Når indersiden af tumbleren er helt dækket med et hvidt fast lag isopentan, skal du tage det ud af væskekvælstofboksen (figur 2H).
    BEMÆRK: Smeltetemperaturen for isopentan er -159 ° C, kanterne på tumbleren bliver hvide, når den er kold nok.
  4. Rør forsigtigt de faste isopentanstykker i den resterende flydende isopentan med tang, indtil hele volumenet bliver flydende igen.
  5. Nedsænk tumbleren igen i det flydende nitrogen, indtil isopentan danner hvide småsten over hele bunden og kanterne af tumbleren (figur 2G, H).
    BEMÆRK: Dette andet køletrin sikrer den passende frysetemperatur for isopentanen.
  6. Fjern tumbleren fra det flydende nitrogen og dypp hurtigt musklerne i bunden af tumbleren, og hold korken med rotte tandpincet. Korken hvirvles i 15 s i isopentanen, og den opbevares ved -80 °C indtil forarbejdning (figur 2I).
    BEMÆRK: Ved kortvarig opbevaring kan prøverne opbevares i en fryser ved -20 °C. Den komplette protokol for hurtig frysning af skeletmuskulatur er allerede offentliggjort andetsteds. For detaljerede referencer og fejlfinding, se: Meng et al.29, Kumar et al.30 og Leiva-Cepas et al.31.

3. Kryosesektion

  1. Prøverne føres ind i kammeret i en kryostat, der tidligere er afkølet til -20 °C, og klingetemperaturen indstilles til -25 °C.
    BEMÆRK: Transporter prøver fra -20 °C/-80 °C fryseren til kryostaten i en polystyrenkasse fyldt med tøris, og lad prøverne balancere i mindst 20-30 minutter til kammertemperaturen inden skæring.
  2. Fjern plasten fra korken med en fin pincet, og læg kryostatprøveskiven på hurtigfrysningspladen for at afkøle. Når pladen har nået -50 °C, anbringes nogle OCT på skiven, og korken placeres hurtigt oven på disken, mens du trykker hårdt på den. Vent, indtil OCT størkner, og korken er godt fastgjort på disken.
  3. Placer skiven på objekthovedet i den ønskede skæreretning (figur 2J,K) og trim muskelblokken ud over mindst 1/3 af musklernes længde, og indtil begge tværsnit af musklerne er synlige.
  4. Skærtykkelsen indstilles til 10 μm, og placer en sektion på et vedhæftningsglas for at kontrollere den korrekte orientering af fibrene på et brightfieldmikroskop.
    BEMÆRK: Det er kritisk at kontrollere fibrenes tværgående orientering. Hvis fibrene ikke er tilstrækkeligt orienteret, skal du justere vinklen på objekthovedet, skære en anden sektion og kontrollere igen.
  5. Placer to serielle tværsnit på to forudmærkede vedhæftningsdias: det ene dias for at bestemme fibertyper, det andet for at kvantificere lipidindhold (figur 2L).
    BEMÆRK: Yderligere serielle tværsnit kan opnås og opbevares ved -80 °C til andre histologiske undersøgelser. For at undgå at ændre lipidindholdet og intracellulær morfologi24 er det imidlertid vigtigt at behandle de to første dias umiddelbart efter skæring for at forhindre lufttørring. Frysning og optøning af diasene til LD-kvantificering ville have samme virkning og er derfor meget uhensigtsmæssig.

4. Fibertype og Bodipy-farvning

  1. Immunohistokemisk påvisning af muskelfibertype
    BEMÆRK: For følgende protokol er et samlet opløsningsvolumen på 250 μL tilstrækkeligt til at dække hele muskelsektionen omgivet af en cirkel tegnet med en hydrofob pen, den omtrentlige størrelse af en 1 cent mønt.
    1. Omgiv sektionerne med en kontur tegnet med en hydrofob pen og skyl med iskold 0,1 M fosfatbufferet saltvand (PBS) i 1 minut ved stuetemperatur (RT). Placer diaset i et fugtigt kammer og bloker i 90 minutter ved 37 °C i blokerende opløsning (10 % normalt gedeserum (NGS) og 1:30 mus på mus (MOM) blokerende reagens i PBS).
    2. Blokeringsopløsningen fjernes, og diaberes i 90 minutter ved 37 °C med opløsningen indeholdende de primære antistoffer (5 % NGS, 1:30 MOM-blokerende reagens, musens primære antistoffer til at genkende type I (IgG2b, kl. 1:10), type IIa (IgG1, kl. 1:10) og type IIx (IgM, ved 1:5) fibre og en rotte-anti-laminin (α2-kæde, 1:1.000) i PBS.
    3. Vask slides med PBS 3 x 5 min ved RT.
    4. Diabér diasene i mørke i 1 time ved RT med opløsningen indeholdende de sekundære antistoffer (ged anti-IgG2b AF405 (1:500), ged anti-IgG1 AF488 (1:500), ged anti-IgM AF568 (1:1.000) og ged anti-laminin AF647 (1:500) i PBS).
      FORSIGTIG: I resten af protokollen skal du sørge for at holde diasene væk fra lys for at bevare fluorescensen.
    5. Vask igen 3 x 5 min i PBS, skyl i dobbeltdestilleret H2O, fjern overskydende vand og monter med et antifadereagens.
      BEMÆRK: Opbevar diasene ved 4 °C, beskyttet mod lys for at bevare fluorescensen indtil billedoptagelse. Da diasene ikke er faste, anbefales det at bruge frisklavede løsninger til hvert eksperiment, autoklave PBS og erhverve billederne så hurtigt som muligt for at undgå forurening af sektionerne.
  2. Farvning af LD'er med Bodipy
    BEMÆRK: I lighed med trin 4.1 er et samlet opløsningsvolumen på 250 μL tilstrækkeligt til at dække hele muskelsektionen omgivet af en cirkel tegnet med en hydrofob pen med den omtrentlige størrelse af en 1 cent mønt.
    1. Omgiv sektionerne med et omrids tegnet af en hydrofob pen og skyl med iskold 0,1 M PBS i 10 min ved RT. Brug iskold PBS til alle skylninger og vaske.
    2. Der blev fiksret med koldt 4% paraformaldehyd (PFA) uden methanol i 10 minutter ved RT. Efter en første hurtig skylning vaskes rutsjebanerne med PBS 3 x 5 min ved RT.
      FORSIGTIG: Udfør dette trin under en kemisk hætte.
    3. Placer diaset i et fugtigt kammer og blok i 1 time ved RT med 5% NGS i PBS.
    4. Diasene inkuberes i 90 minutter ved 37 °C med opløsningen af det primære antistof (2 % NGS og rotte-anti-laminin (α2-kæde, 1:1.000) i PBS). Vask slides med PBS 3 x 5 min ved RT.
      FORSIGTIG: I resten af protokollen skal du sørge for at holde diasene væk fra lys for at bevare fluorescensen.
    5. Der inkuberes i 1 time ved RT med den sekundære antistofopløsning indeholdende gede-anti-rotte-AF647-antistof (1:500) i PBS. Vask slides med PBS 3 x 5 min ved RT.
    6. Inkuberes i 20 minutter ved RT med en opløsning af 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 0,5 μg/ml) og BODIPY (1 μg/ml) i PBS.
      BEMÆRK: For at fremstille BODIPY-stamopløsning opløses den i DMSO i en koncentration på 1 mg/ml. Forskellige Bodipy-formuleringer er kommercielt tilgængelige til LD-farvning. Afhængigt af det valgte valg er farvningsmetoden den samme (samme trin, koncentration og inkubationstid); erhvervelsesmetoden vil dog være lidt anderledes.
    7. Efter en første hurtig skylning vaskes diasene med PBS 3 x 5 min ved RT, skylles i dobbeltdestilleret H2O, fjernes overskydende vand og monteres med et antifaderegens.
      BEMÆRK: Opbevar diasene ved 4 °C, beskyttet mod lys, for at bevare fluorescensen indtil billedoptagelse.

5. Erhvervelse af billeder

BEMÆRK: Når farvningsprotokollerne er afsluttet, er det vigtigt straks at gå videre til billedoptagelse (inden for de følgende 24 timer), ikke kun for at undgå forurening, men også for at bevare morfologien, størrelsen og antallet af LD'er.

  1. Erhvervelse af billeder for at vurdere fibertyperne for hver muskel, der udtages prøver af
    BEMÆRK: Dette trin kunne opnås med et hel-dias fluorescens scanningsmikroskop eller med et konventionelt epifluorescensmikroskop. Med sidstnævnte skal manuel eller automatiseret syning af billederne udføres for at rekonstruere sektionen.
    1. Til genkendelse af fibertype skal du bruge et epifluorescensmikroskop med et 10x / 0,3 mål. Vælg excitationsfiltre til DAPI (405 nm), FITC, TRITC og Cy5 for at registrere henholdsvis type I, IIa, IIx fibre og laminin.
      BEMÆRK: Type IIb fibre vil ikke være immunmærkede. De vil blive genkendt som fibre farvet af laminin på sarkollemmaets grænser med en sort sarkoplasma.
    2. Juster den passende eksponeringstid for hver kanal.
    3. Når du bruger et konventionelt epifluorescensmikroskop, skal du altid erhverve billederne af hele musklen efter samme rækkefølge for at lette muskelrekonstruktionen. Sørg for, at fibrene i højre kant af et billede også vises i venstre kant af følgende billede. Det samme gælder for den øverste og nederste del af billederne (figur 3A).
      BEMÆRK: Som reference vil et gennemsnit på henholdsvis seks og otte billeder for et afsnit af EDL eller soleus dissekeret fra en 3 måneder gammel mus dække hele muskeltværsnittet.
    4. Når musklen er scannet, skal du uploade de optagne digitale billeder til enhver billedbehandlingssoftware til rekonstruktion (syning) baseret på fibermorfologien (laminin) og muskelsektionens histologi og gemme den som en TIFF-, PNG- eller JPG-fil med alle kanaler (farver) fusioneret (figur 3A).
  2. Erhvervelse af billeder med laminin og Bodipy co-farvning
    BEMÆRK: For at genkende fibertypen og få et skøn over antallet af fibre for hver type fanget, er det vigtigt at have fibertypesektionen allerede scannet og musklerne rekonstrueret, inden billedoptagelsen af Bodipy-laminin påbegyndes (figur 3B).
    1. Til Bodipy-billedobservation og -erhvervelse skal du bruge et konfokalt mikroskop med en 40x oliedypningsobjektiv med en numerisk blænde på 1,4.
    2. Brug følgende indstillinger: pinhole ved 1 AU, 2.048 pixel x 2.048 pixelopløsning, pixelstørrelse ved 0,08 μm, ensrettet tilstand, scanningshastighed ved 4 (~4 μs/pixel), linjegennemsnit indstillet til 4x og digital zoom indstillet til 1.
    3. For at undgå krydstale mellem Bodipy-558/568 og laminin-AF647 skal du bruge den sekventielle scanningstilstand på confocal-softwaren.
      BEMÆRK: Når det valgte farvestof er Bodipy-493/503, er samtidig konfokal laserscanning mulig uden krydstale mellem Bodipy-kanalen og laminin-AF647-kanalen. Dette vil fremskynde erhvervelsen af billeder.
    4. Excite Bodipy-493/503 ved hjælp af 488 nm laserlinjen eller argonlaserlinjen, og excite Bodipy-555/568 ved hjælp af 561 nm diodelaserlinjen. Endelig skal du registrere laminin-AF647 med en 640 nm diodelaserlinje.
      FORSIGTIG: Husk, at Bodipy-molekyler er meget følsomme over for fotobleaching, så undgå unødvendig laserscanning. For at genkende fibre skal du kun bruge laseren til laminin.
    5. Afhængigt af det valgte farvestof indstilles emissionsintervallerne til 570-650 nm for Bodipy-493/50324 og til 565-620 nm for Bodipy-558/568. Indstil emissionsområdet for laminin til 656-700 nm.
    6. Indstil forstærkningen og den digitale forstærkning korrekt, så der ikke registreres mættede pixels på områdeindikatoren. Ret baggrundssignalet ved at justere forskydningen.
      BEMÆRK: Filtervalg og andre ovennævnte scanningsparametre skal optimeres for hvert konfokalmikroskop. Det er vigtigt, at alle ovennævnte indstillinger holdes konstante, så alle de billeder, der er taget fra prøver, kan sammenlignes.
    7. For at identificere typen af fiber blandt dem, der visualiseres på det konfokale mikroskop, skal du bruge en personlig bærbar computer, hvor billedet af sektionen rekonstrueret efter fibertype immundetektion kontrolleres (figur 3B).
    8. Når en gruppe fibre er korrekt identificeret, skal du erhverve billedet med Bodipy- og laminin-kanalerne.
      BEMÆRK: Det anbefales at bemærke Bodipy-laminin-billednavnet på det område af musklen, hvor disse fibre er placeret på billedet erhvervet til MyHC-genkendelse for at lette den senere fiberspecifikke analyse af LD'er.

6. Analyse af billeder

  1. Analyse af fibertyperne på hver muskelprøve
    1. I Fiji (eller ImageJ)32 skal du åbne TIFF-, PNG- eller JPG-filen med den rekonstruerede muskel opnået ved fletningen af alle de kanaler, der bruges til at detektere fiberisoformerne.
    2. For at starte celletællingsværktøjet skal du klikke på Plugins | Analyser | Celle tæller | Celle tæller.
    3. I vinduet Celletæller skal du klikke på Handlinger | Initialiser.
    4. Under Tællere i det samme vindue skal du vælge Type 1.
    5. I Fiji-hovedvinduet skal du vælge Wand-værktøjet .
    6. For at kvantificere antallet af fibre af hver type skal du klikke på hver fiber af samme type, så programmet registrerer antallet af fibre, der klikkes på.
    7. Når du er færdig, skal du vælge den næste type fiber og gentage de samme trin.
    8. Når alle fibre i billedet er blevet tildelt en given fibertype, skal du klikke på Resultater i vinduet Celletæller for at få vist resultaterne i en tabel.
    9. Gem denne tabel som en regnearkstabel ved at klikke på File | Gem som i vinduet Resultater .
    10. Gem og genindlæs markeringerne på det samme billede til enhver tid ved at klikke på henholdsvis Gem markører eller Belastningsmarkører i vinduet Celletælling .
  2. Analyse af lipiddråber på en fibertypeafhængig måde
    1. Analyser billederne af Bodipy og laminin opnået på konfokalen ved hjælp af Fiji til kvantificering af LD'er.
      BEMÆRK: Forfatterne designede en tilpasset makro til automatisering af analysen. Denne makro er sammen med en trinvis forklaring på, hvordan du bruger den, tilgængelig som henholdsvis supplerende fil 1 og supplerende fil 2.
    2. Åbn hvert billede ved hjælp af Bio-Formats Importer fra Fiji. Under indstillingen Vis stak med skal du vælge Hyperstack | Farvetilstand, Standard. Sørg for, at vinduet Autoskalering er valgt.
      BEMÆRK: Følgende trin beskriver protokollen til analyse af en fiber på billedet, men det skal gentages så mange gange som antallet af hele fibre vises på billedet.
    3. Brug frihåndsvalgværktøjet til manuelt at vælge fiberens sarkolemma baseret på lamininkanalen (figur 4A), og tryk på T på tastaturet for at registrere markeringen eller Interesseområde (ROI) i ROI-vinduet .
    4. Gå til Fijis hovedvindue , og klik på Analyser | Indstil målinger, og vælg Område og Ferets diameter i pop op-vinduet. Lad de resterende felter være umarkeret og andre parametre, som de vises som standard.
    5. Klik på Mål i ROI-vinduet for at få området og minimal ferets diameter (MF) for den valgte fiber, og noter dem til senere brug.
      BEMÆRK: Når du analyserer LD'er, er det vigtigt at huske på, at deres størrelse og densitet varierer mellem fiberens centrum og periferi (subsarcolemmal region-SS). Derfor skal analysen udføres separat.
    6. Beregn værdien af 1/6 af MF for at afgrænse den centrale del af fiberen.
      BEMÆRK: I makroen er standard MF-værdien indstillet til 6, hvilket betyder, at den anvendte reduktion indstilles til 1/6 af MF. Denne værdi blev valgt ud fra de empiriske data opnået fra soleus af dyr fodret med en fedtfattig kost. Hver forsker skal dog ændre dette tal baseret på de empiriske data og den analyserede muskel, typen af fiber og dyrets tilstand.
    7. I ROI-vinduet skal du klikke på Tilføj for at få en kopi af det første investeringsafkast og vælge det andet investeringsafkast, der vises i vinduet.
    8. I Fijis hovedvindue skal du klikke på Rediger | Udvælgelse | Forstør og introducer den tidligere beregnede værdi (fra trin 6.2.6.) med et minustegn før nummeret, og klik på OK. I ROI-vinduet skal du klikke på Tilføj [t] (en tredje ROI skal vises) og Slet for at slette den anden ROI.
      BEMÆRK: Forskeren kan kontrollere resultaterne ved at klikke på vis alle boks i ROI-vinduet . På dette tidspunkt skal der vises to ROI'er, en der omgiver hele fiberens omkreds (figur 4B) og en anden, der er placeret i midten (figur 4C).
    9. Vælg begge ROI'er i ROI-vinduet , og klik på Mere | XOR | Tilføj[t]. Vent på, at der vises en tredje ROI, som svarer til fiberens periferi (figur 4D).
    10. Gem RIE'erne ved at klikke på Flere | Gem for at redde RIE'erne, hvis der er behov for en senere genanalyse af de samme fibre.
    11. Vælg Bodipy-kanalen , og åbn tærskelværktøjet ved at klikke på Billed- | Juster | Tærskel på Fijis hovedvindue .
    12. I pop op-vinduet Tærskel skal du indstille værdierne til 70/255, vælge Yen | B&W-metode, og klik på Mørk baggrund | Anvend.
      BEMÆRK: De værdier, der anvendes på tærsklen, kan variere afhængigt af betingelserne for eksperimentet, og tærsklen skal indstilles korrekt for at optimere analysen. Et B&W-vindue med Bodipy-signalet over tærskelgrænsen vist i hvidt og baggrunden i sort skal vises (sammenlign det originale Bodipy-billede i figur 4E med det i figur 4F).
    13. Gå til Fijis hovedvindue , og klik på Analyser | Angiv målinger, og vælg Område, Arealfraktion og Begræns til tærskel i pop op-vinduet. Lad de resterende felter være umarkeret og andre parametre, som de vises som standard.
      BEMÆRK: Hvis forskeren ønsker at analysere "cirkulariteten" af LD'er, som er et indeks for den sfæriske morfologi, der spænder fra 1 for en perfekt kugle til 0 for en linje, skal du klikke på feltet Formbeskrivelser i pop op-vinduet Indstil målinger .
    14. Gå til ROI-vinduet , og vælg den første ROI. I Fijis hovedvindue skal du klikke på Analyser | Analyser partikler værktøj.
      BEMÆRK: Dette værktøj kvantificerer antallet, størrelsen, det dækkede område og procentdelen af det samlede areal, der er dækket af partikler på hver markering, og gemmer resultaterne som en regnearksfil.
    15. Indstil værdierne fra 2 til Uendelig (2-Uendelig) i vinduet Analyser partikler , marker afkrydsningsfeltet Pixels , bevar standardcirkularitetsværdierne, vælg Opsummer, og klik på OK.
      BEMÆRK: For at kontrollere resultaterne på fiberen skal du vælge en af de tilgængelige indstillinger under Indstillingen Vis . Hvis oplysningerne for hvert LD genkendes på markeringen i en tabel, skal du kontrollere indstillingen Vis resultater i vinduet Analysér partikler . Resultaterne fra analysen af fiberens samlede areal er gennemsnitlige og opsummeret i en tabel med flere kolonner (Antal, Samlet areal, Gennemsnitlig størrelse, % Areal; disse svarer til antallet af partikler [LD'er], det område, der optages af disse partikler, deres gennemsnitlige størrelse og procentdelen af det samlede område af udvælgelsen optaget af partikler, henholdsvis). For at beregne densiteten skal du dividere antallet af partikler med det samlede areal af hvert valg.
    16. For at opnå værdierne for fiberens centrum og periferi gentages trin 6.2.14 og 6.2.15, idet du vælger den anden (center) og den tredje ROI (periferi) hver gang.
    17. Gem resultaterne ved at klikke på File | Gem som i vinduet Oversigt .
      BEMÆRK: Medtag fibertypen, betingelsen og billednavnet på det tildelte navn på resultaterne for at lette senere forening og statistisk analyse af dataene. For at analysere resten af fibrene i det samme billede gentages trin 6.2.3 til 6.2.17. Til den statistiske analyse skal mindst 10-15 fibre af hver type analyseres pr. Dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen beskrevet heri giver en effektiv metode til let at kvantificere LD'er på en fibertype og subcellulær-specifik måde. Det viser, hvordan den tid og de ressourcer, der bruges på de følgende trin, reduceres med halvdelen ved at fryse to muskler af samme størrelse, såsom EDL og soleus.

Der findes en komplet protokol til immunstaining, billedoptagelse og analyse af de forskellige MyHC-isoformer udtrykt i voksne musemuskler. Denne protokol er baseret på den, der først blev designet af Schiaffino et al. i 198933, med nogle justeringer såsom brugen af et ekstra antistof til mærkning af laminin. Denne senere ændring er kritisk for placeringen af type IIb-fibre, som vil være sorte, da de ikke er farvet med noget antistof. Som vist i figur 5 tillader denne immunohistokemiske protokol ikke kun genkendelse af musens langsomt oxidative (type I og IIa) og hurtigt glykolytiske (type IIx og IIb) fibre, men også tilstedeværelsen af hybridfibre (se stjerne i figur 5D). Desuden tillader tværsnit af begge muskler på samme dias sammenligning af proportionerne af hver fibertype mellem de to udvalgte muskler, hvilket sikrer, at de eksperimentelle betingelser var identiske på begge sektioner.

Til LD-mærkning er resultaterne præsenteret her baseret på brugen af Bodipy-558/568 C12 som lipidfarvestof; læseren henvises dog til et fremragende protokolpapir, der beskriver brugen af det klassiske farvestof Bodipy-493/503 på muskelafsnit23. Den præsenterede protokol kombinerede farvning af LD'er baseret på immunohistokemi mod α2-laminin for at skelne fibersarkolemmaet. Som med fibertypeeksperimentet er dette trin afgørende, ikke kun for anerkendelse af individuelle fibre, men også for efterfølgende analyse af lipider i både de centrale og perifere områder af fibre (figur 4). Et af de kritiske trin i denne protokol er identifikation og mærkning af de samme fibre på de to dias. Som forklaret før er det vigtigt at scanne diaset med fibertyper og få rekonstruktion af muskeltværsnit med de fusionerede farver inden erhvervelsen af billeder til LD'er (figur 3B). Bemærkelsesværdige strukturer i hver muskelsektion, såsom axonkviste eller muskelspindler, er gode vartegn, der kan hjælpe forskeren med at lokalisere de samme fibre på begge dias (figur 6). Husk, at fordi diaset er placeret på hovedet på de fleste konfokale mikroskoper, anbefales det at invertere det fiber-type rekonstruerede billede på pc'en for at lette placeringsopgaven.

De indstillinger, der er beskrevet for erhvervelse af Bodipy-lamininfarvning ved konfokal mikroskopi, tillader visualisering og senere analyse af størrelse, antal og fordeling af LD'er fra tre til seks fibre samtidigt (figur 6 og figur 7). En detaljeret trin-for-trin protokol til analyse af LD'er med billedanalysesoftwaren Fiji findes også her. Som vist i protokollen er den fulde analyse af hver af de fibre, der er til stede på et billede, lang og kedelig. Fiji har dog den fordel, at det tillader design af tilpassede programmer, kaldet makroer, baseret på Java-sproget. Forfatterne designede en makro, der muliggør automatisering af serien af individuelle kommandoer beskrevet ovenfor, der automatisk køres i en løkke for at analysere på få minutter - ikke kun hver af de fibre, der findes på et billede, men også et stort sæt billeder. Det eneste input fra forskeren er det manuelle valg af omkredsen af fiberen, der skal analyseres hver gang, udvælgelsen af fibertypen og den visuelle inspektion af det resulterende billede efter påføring af tærsklen og kvantificering af partiklerne.

Her implementeres analysen af LD'er på en placeringsafhængig måde. Ved tidligere måling af fiberens areal og MF-diameter anvendes en størrelsesafhængig (ikke-fast som beskrevet af Strauss et al.25) reduktion for at opnå de centrale og perifere områder af hver fiber (figur 4 og figur 7). Som det ses i histogrammerne i figur 7, tillader denne metode kvantificering af tre vigtige parametre: procentdelen af fiberarealet besat af LD'er (figur 7E), densiteten af LD'er - antallet af LD'er pr. μm2 (figur 7F) og den gennemsnitlige størrelse af LD'er (figur 7G). Som følge heraf udgør fibre af type IIa (grøn kontur) og type IIx (rød kontur) i 3 måneder gamle mus (N = 5) den største andel af arealet besat af LD'er i periferien (figur 7E). Med hensyn til tætheden af partikler viser EDL-fibre altid højere densitet end soleusfibre uafhængigt af den subcellulære placering (figur 7F). Endelig er den gennemsnitlige størrelse af disse LD'er altid større i periferien end i midten (figur 7G).

De forskellige metoder, der anvendes af andre grupper til at vurdere akkumuleringen af LD'er i gnaverskeletmuskulatur 34,35, gør det vanskeligt at sammenligne disse resultater med resultaterne af tidligere undersøgelser. I overensstemmelse med resultaterne fra Komiya et al.34 er procentdelen af fiberareal optaget af LD'er imidlertid højere i soleus type IIa og EDL type IIx fibre. Vigtigst af alt præsenterede type IIb-fibre den laveste procentdel af areal besat af LD'er (figur 7E, grå histogrammer). Da fibertype IIb er den mest dominerende fibertype af EDL (75%, figur 5E), bekræfter disse resultater, hvad andre grupper tidligere har beskrevet: den samlede ophobning af lipider er lavere i EDL end i soleus34,35.

I modsætning til hvad der er beskrevet hos mennesker25, og også i overensstemmelse med resultaterne af Komiya et al.34, viser resultaterne præsenteret her, at akkumuleringen af LD'er i soleus type I fibre er relativt lav. Dette kan forklares ved forskelle mellem mus og menneskermellem fibre 36, da de metaboliske egenskaber af human type I fibre ligner mere dem af gnaver type IIa og IIx, mens de af human type IIx fibre er tæt på gnaver type IIb37. Sammenfattende giver de forskellige teknikker, der er beskrevet her, en reproducerbar, pålidelig og tidseffektiv metode til at studere og sammenligne flere parametre relateret til LD'er og deres fordeling i cellen på en fibertypeafhængig måde.

Suboptimale eksperimenter
Hvis fryseproceduren ikke udføres korrekt, og isopentan ikke har den rigtige temperatur, dannes iskrystaller inde i fibrene (figur 8A). Disse fryseartefakter kan kun påvises efter den histologiske forberedelse af prøven og kan genkendes som huller i fibrene. For korrekt kvantificering af LD'er skal disse artefakter undgås. Det er blevet påvist, at optøning og genfrysning af muskelblokken korrekt kan reducere disse artefakter betydeligt29.

Et andet problem opstår, når fibre ikke skæres vinkelret på længdeaksen (figur 8B). LD-kvantificering og sammenligning mellem fibre, muskler eller dyr kan ikke udføres, når sektioner ikke er tværgående. Af denne grund er det vigtigt at placere musklerne korrekt på korken ved hjælp af et stereomikroskop inden frysning og have et brightfieldmikroskop tæt på kryostaten. Sidstnævnte vil gøre det muligt for forskeren at finde den korrekte justering af prøven på kryostaten.

I nogle sjældne tilfælde er mærkningen af MyHC-isoformer meget svag på en eller flere fibertyper (figur 8C). Hvis dette sker, vil analysen af LD'er være ufuldstændig. I dette tilfælde skal eksperimentet gentages ud fra skæringen af musklerne. Endelig kunne Bodipy akkumulere i periferien af muskeltværsnittet (figur 8D). Hvis dette sker, vil farvningen være meget stærk på de fibre, der producerer et artefaktresultat. Undgå erhvervelse af billeder fra disse fibre.

Figure 2
Figur 2: Forberedelse af prøverne til frysning og kryosesektion. (A-D) Mouse soleus og EDL muskler dissekeres og anbringes på en kork, der holdes af en stiv plast med en dråbe OCT. (E-G) En tumbler i rustfrit stål fyldes med isopentan og afkøles til sin smeltetemperatur i flydende nitrogen. (H,I) Tumbleren med den kolde isopentan tages ud af det flydende nitrogen, og prøven nedsænkes op til bunden af tumbleren og hvirvler i 15 s. (J-L) Korken med prøverne placeres på kryostatholderskiven uden plaststøtte, og serielle tværgående sektioner på 10 μm monteres direkte på vedhæftningsglas. To tilstødende serielle tværsnit behandles straks til farvning af LD'er og påvisning af MyHC'er. Forkortelser: LD'er = lipiddråber; EDL = extensor digitorum longus; MyHC'er = myosin tunge kæde isoformer; OCT = optimal skæretemperatur. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Bodipy-billedoptagelse efter identifikation af typen af fiber fra det rekonstruerede sammensatte billede set på en anden computer. (A) Rekonstruktion af hele soleussektionen immunlabelt til fibertype (MyHC'er) fra syv uafhængige fusionerede billeder (stiplede rektangler) syet sammen ved hjælp af billedbehandlingssoftware. De hvide pile og tallene repræsenterer den rækkefølge, der følges under billedoptagelse ved hjælp af et konventionelt epifluorescensmikroskop. (B) For Bodipy-billedoptagelse visualiseres (1) et felt, der indeholder muskelsektionen immunstained med laminin-AF647 og Bodipy-555/568, på skærmen på en computer, der er tilsluttet konfokalmikroskopet. (2) Disse fibre er placeret på det rekonstruerede billede af muskelsektionen immunstained for at detektere typen af fibre (MyHC'er). (3) Billedet er erhvervet ved hjælp af et konfokalt mikroskop. Forkortelser: LD'er = lipiddråber; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; MyHC'er = myosin tunge kæde isoformer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Analyse af lipiddråber med Fiji. (A, B) Fiberens sarkolemma genkendes baseret på lamininbilledet og vælges som ROI. Samlet areal og MF måles. (C) For at genkende den centrale del af fiberen reduceres udvælgelsen med 1/6 af MF-værdien. (D) Arealet mellem det centrale og det samlede udvalg er angivet som periferien eller det subsarcolemmale område. (E) Til analyse af LD'er farvet med Bodipy anvendes en tærskel, (F) og værktøjet Analyze Particles bruges til at kvantificere forskellige parametre relateret til LD'erne (se tabel). Disse værdier opnås for den komplette fiber (Alle), for den centrale del (Center) og for det subsarcolemmale område (Periferi), uafhængigt. Skalastænger = 12 μm. Forkortelser: LD'er = lipiddråber; ROI = region af interesse; MF = Minimal Ferets diameter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentativ immunstaining af fibertyper i EDL (glycolytisk) og soleus (oxidativ) musemuskel. Fusionerede fluorescensbilleder af EDL (A, B) og soleus (C, D) opnået med et digitalt, helslids fluorescensmikroskop. Antistoffer mod type I (blå-AF405), type IIa (grøn-AF488), type IIx (rød-AF568) og laminin (hvid-AF647) blev anvendt. Sorte fibre svarer til fibertype IIb. B og D viser detaljer om fibrene inde i de hvide rektangler i henholdsvis panel A og C. Stjernen (*) i panel D viser en IIa/IIx hybridfiber. (E,F) Repræsentativ kvantificering af fibertypefordeling i EDL og soleus fra 3 måneder gamle mus (N = 5). EDL var hovedsageligt sammensat af type IIb, derefter IIx og IIa fibre (henholdsvis ~ 75%, 15% og 5%). I modsætning hertil var soleus hovedsageligt sammensat af type IIa (>50%) og type I fibre (30%). Andelene af type IIx fibre var ret ens i begge muskler, mens hybridfibrene var meget lave. Skalastænger = 200 μm (A, C), 100 μm (B, D). Forkortelse: EDL = extensor digitorum longus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Repræsentativ farvning af LD'er med Bodipy på serielle tværsnit, der tidligere var immunmærket for MyHC-isoformer. Fluorescens fusionerede billeder af mus EDL (A) og soleus (B) erhvervet ved hjælp af et epifluorescensmikroskop, der viser type I (blå), IIa (grøn), IIx (rød), IIb (sort) fibre og laminin (hvidt signal omkring fibrene). (C-F) Konfokale fluorescensbilleder fra EDL (C, D) og soleus (E, F) sammenmærket med laminin (cyan) og Bodipy (rød). Bemærk, at fibre vist i C-F er de samme som dem inde i de hvide rektangler på panelerne A og B. I højre hjørne af det hvide rektangel i A kan der skelnes en axonkvist (hvid pilespids). Skalastænger = 200 μm (A, B), 20 μm (C-F). Forkortelser: LD'er = lipiddråber; EDL = extensor digitorum longus; MyHC'er = myosin tunge kæde isoformer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Kvantificering af LD'er på en fibertype- og subcellulær-specifik måde. Repræsentative fluorescenskonfokale billeder af type I og type IIa fibre fra soleus (A, B) og type IIx og type IIb fibre fra EDL (C, D) opnået efter co-mærkning med Bodipy (rød) og α2-laminin (ikke vist). LD-indhold (% af det område, der er besat af Bodipy og densitet) og morfologi (størrelse) blev analyseret på en subcellulær-specifik måde. Fiberperimeter blev defineret ved lamininfarvning, og de centrale eller perifere områder blev indstillet baseret på MF-diameteren. Procentdel af fiberareal optaget af Bodipy (LD'er) (E), LD-densitet (tal / μm2) (F) eller gennemsnitlig LD-størrelse (G) i centrale eller perifere regioner for hver fibertype. Resultaterne er repræsenteret som middel ± SEM. Skala søjler = 10 μm. Forkortelser: LD'er = lipiddråber; EDL = extensor digitorum longus; C = central; P = perifer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Billeder svarende til suboptimale resultater. (A) Brightfield-billede af muskeltværsnit farvet for hæmatoxylin-eosin, der viser iskrystaller dannet under fryseprocessen. (B) Fluorescens fusioneret billede af en soleus sektion immunostained for MyHC'er og laminin, hvilket viser, at størstedelen af fibre skæres langs længdeaksen. (C) Fluorescensbillede af en EDL-sektion immunstained for MyHC'er og laminin. Den svage farvning af fibertype IIa (grøn) forhindrer den korrekte kvantificering af hver fibertype. (D) Konfokalt billede, der viser en stærk artefaktlig farvning af Bodipy (rød) på fibre placeret i periferien af muskeltværsnittet. Skalastænger = 50 μm (A,B), 200 μm (C,D). Forkortelser: EDL = extensor digitorum longus; MyHC'er = myosin tunge kæde isoformer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: LD-farvning med Olierød O på muskeltværsnit. (A,B) Konfokale billeder, der viser farvemønsteret opnået med Oil Red O i henholdsvis soleus og EDL. Protokollen, der anvendes til denne farvning, er beskrevet detaljeret af Prats et al.24. Bemærk, at akkumulering af LD'er er højere i den subsarcolemmale region af myofibrene, som tidligere beskrevet for Bodipy. Skalastænger = 20 μm. Forkortelser: LD = lipid dråbe; EDL = extensor digitorum longus. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Co-farvning af LD'er og mitokondrier i soleusmusklen. (A) Konfokalt flettet billede, der viser immunmærkningen af Tomm20, et protein, der findes på mitokondriemembranen (grøn), DAPI (blå) og Bodipy-558/568 mærkede LD'er (rød). Indsatsen i A viser flere mitokondrier (grøn) bundet til LD'er (rød). Dette billede blev opnået ved at anvende Airyscan konfokal superopløsningsmikroskopi. (B,C) Tilsvarende enkeltkanalbilleder af henholdsvis LD'er og mitokondrier. Skalastænger = 10 μm (A-C), 5 μm (A, indsat). Forkortelser: LD'er = lipiddråber; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Fiji-makro til automatiseret analyse af LD'er på flere laminin+Bodipy-billeder. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Trin-for-trin forklaring af, hvordan du arbejder med makroen Bodipy_JoVE.ijm. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen, der er beskrevet her, beskriver en effektiv metode til at kvantificere LD'er mærket med Bodipy på fibertype- og subcellulært-specifikt grundlag. I de senere år er klassiske lipidfarvestoffer, såsom ORO eller Sudan Black B, blevet erstattet med et nyt udvalg af cellegennemtrængelige, lipofile, fluorescerende farvestoffer, der binder til neutrale lipider (f.eks. Bodipy). Bodipy fås som forskellige konjugater og har vist sig meget effektiv til at mærke LD'er for at studere deres morfologi, dynamik og interaktion med andre organeller, ikke kun i forskellige faste væv og celler 23,38,39,40, men også i levende celler41,42.

Inden for protokollen er der flere kritiske aspekter, som forskeren skal overveje for at opnå optimale resultater. Det er vigtigt at placere de valgte muskler korrekt på korken for at sikre perfekt justering og orientering af muskelmyofibre, da der, når de er frosne, kun kan foretages små justeringer af holderen på kryostaten. Desuden er det afgørende at starte immunostainingprotokollen umiddelbart efter, at sektionerne er skåret, da lufttørrende kryosektion (i kun 15 minutter) har alvorlige bivirkninger på LD'er, hvilket resulterer i et fald på 66% i LD-densitet og et fald på 37% i gennemsnitsstørrelsen24. På samme måde vil frysning og optøning af diasene have negative virkninger og anbefales derfor ikke. Et tredje vigtigt træk ved denne protokol er relateret til fiksering af prøver. Til identifikation af de forskellige MyHC-isoformer med de antistoffer, der er nævnt her, skal vævsfiksering undgås, da det forstyrrer bindingen af de valgte antistoffer til deres epitoper. Hvis muskelprøverne tidligere er blevet rettet, henvises læseren til et nyligt offentliggjort papir ved hjælp af forskellige antistoffer43. Kun PFA uden methanol anbefales til mærkning og kvantificering af LD'er, fordi brugen af methanol eller acetone forstyrrer morfologien afLD'er 23,44. Desuden er et permeabiliseringstrin ikke nødvendigt for kvantificeringen af LD'er på dias immunmærket med laminin. Da nogle grupper har vist, at permeabilisering med vaskemidler som TritonX-100, saponin eller glycin kan reducere størrelsen eller antallet af LD'er 44,45, frarådes permeabilisering stærkt. Endelig er finjusteringen af de konfokale mikroskopindstillinger afgørende for kun at genkende de neutrale lipider, der er til stede i LD'er og ikke dem i membraner i andre organeller24.

Her blev Bodipy-558/568 C12 brugt som LD-markør. Den hyppigste Bodipy, der anvendes til mærkning af LD'er og undersøgelse af deres morfologi og placering i skeletmuskulaturmyofibre, er imidlertid Bodipy-493/503. Begge farvestoffer er ens i deres inkubationstid, arbejdskoncentration og deres smalle emissionsspektre, selvom deres excitations- og emissionsområder er lidt forskellige. For en komplet protokol om brugen af Bodipy-493/503 henvises læseren til arbejdet i Listenberger og Brown46 eller Spangenburg et al.23. Bodipy-558/568 C12 er blevet brugt til farvning af LD'er i andre væv såsom fedtvæv47, degenererende nethinde48, fibrotiske nyrer49 eller fibroblaster50. Denne Bodipy giver en farvning svarende til den, der opnås med ORO (se supplerende figur S1), men med betydeligt mindre teknisk byrde og mere specificitet24,51. Desuden har Bodipy-558/568 C12 den fordel, at det muliggør kvantificering af LD'er i kombination med påvisning af proteiner eller organeller mærket med et grøntspektret sekundært antistof (se supplerende figur S2 og Yan et al.49) eller med GFP-genetisk modificerede modeller52. Disse to applikationer er meget kraftfulde værktøjer til at opklare dynamikken og interaktionerne mellem LD'er med andre celleorganeller og proteiner. Ikke desto mindre, når der ikke er beregnet kolmærkning af proteiner i cellerne, anbefaler forfatterne brugen af det bedst karakteriserede LD-farvestof Bodipy-493/503.

En af begrænsningerne i denne protokol er relateret til erhvervelsen af billeder og kvantificeringen af LD morfologiske egenskaber. Teknologiske fremskridt inden for konfokal laserscanningsmikroskopi har i høj grad forbedret planopløsningen sammenlignet med vidfeltmikroskoper og tillader 3D-rekonstruktion af objekter, når prøven scannes i Z-planet. Dette har været meget nyttigt til studiet af LD-morfologi24 og interaktion med andre proteiner i skeletmyofibre 38,53, men har øget billedoptagelses- og behandlingstiden, da hvert 3D-rekonstrueret billede er sammensat af flere uafhængige 2D-billeder. I ovenstående protokol blev konfokale billeder erhvervet med en 40x objektiv linse og kun i 2D. Denne metode tillader erhvervelse af tre til seks myofibre pr. billede i stedet for kun en, som det ville være, når man bruger et 63x mål. Dette resulterer i lavere opløsning og et samlet skøn over LD-størrelsen og morfologien, der ikke er helt nøjagtig. Ikke desto mindre tillader det analyse af et større antal fibre pr. Prøve, hvilket også er en vigtig kendsgerning at overveje, især i dyreforsøg, hvor et stort antal muskler og betingelser skal sammenlignes.

Her er det vist, at ved at fryse to muskler af samme størrelse, der støder op til hinanden34, reduceres behandlingstiden for prøverne betydeligt, og mulige artefaktforskelle afledt af deres uafhængige behandling reduceres. Desuden tager denne metode til analyse af LD'er hensyn til forskellene mellem den subcellulære fordeling af LD'er inden for og blandt fibertyper54. Valg af myofiberens omkreds og reduktion af dette valg i forhold til fiberens Minimale Ferets diameter letter undersøgelsen af størrelsen og densiteten af centrale og perifere (subsarcolemmale) LD'er uafhængigt. Anvendelse af denne metode er ekstremt vigtig, da det er blevet påvist, at den subsarkolemale akkumulering af LD'er direkte bidrager til insulinresistens. Mens nogle rapporter hos mennesker har studeret LD'er på en fibertype- og placeringsafhængig måde 11,16,25, er det første gang, så vidt vi ved, at denne metode er blevet anvendt på muskler fra gnavere. Desuden reducerede og forenklede kvantificeringen af LD'er ved hjælp af en selvdesignet makro til Fiji billedanalysetiden betydeligt. Både makroen og en trinvis forklaring på, hvordan du bruger den, er tilgængelige som henholdsvis supplerende fil 1 og supplerende fil 2.

Samlet set mener forfatterne, at protokollen beskrevet heri kan være et nyttigt værktøj for andre forskere, der studerer lipidmetabolisme i skeletmuskulatur. De forklarede teknikker kan anvendes på forskellige muskler og under forskellige forhold (fastende / overfødt, trænet / stillesiddende, ung / alderen, magert / overvægtig) og vil forhåbentlig bidrage til bedre at forstå dynamikken i LD'er, vigtigheden af deres interaktioner med andre komponenter i cellen, hvordan lipider opbevares og metaboliseres i glykolytiske og oxidative fibre og deres rolle i begyndelsen af insulinresistens i type 2-diabetes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) og Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. er modtager af et ph.d.-stipendium fra FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. modtog et stipendium fra Wallonie-Bruxelles International Excellence Program.

Forfatterne takker Alice Monnier for hendes bidrag til udviklingen af denne protokol og Caroline Bouzin for hendes ekspertise og tekniske hjælp i billedoptagelsesprocessen. Vi takker også 2IP-IREC-billeddannelsesplatformen for adgang til kryostaten og mikroskoperne (2IP-IREC Imaging Platform, Institute of Experimental and Clinical Research, Université Catholique de Louvain, 1200 Bruxelles, Belgien). Endelig vil forfatterne gerne takke Nicolas Dubuisson, Romain Versele og Michel Abou-Samra for konstruktiv kritik af manuskriptet. Nogle af figurerne i denne artikel blev oprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AxioCam 506 mono 6 Mpix camera Zeiss
AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera  Zeiss
Chemical hood Potteau Labo EN-14175
Confocal microscope Zeiss LSM800
Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick)  Electron Microscopy Sciences 63305
Cryo-Gloves Tempshield 16072252
Cryostat  Thermo Scientific  Microm Cryo Star HM 560
Dissecting Stereo Microscope SMZ745 Nikon
Dry Ice
Dumont Forceps F.S.T 11295-10
Epifluorescence microscope Zeiss AxioImage-Apotome Z1
Extra Fine Bonn Scissors F.S.T 14084-08
FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm) ThermoFisher 22-363-552 Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing
Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) BRAND Petri dish, MERK BR455751 Used to place the muscles on ice during dissection
ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen Vector Labs H-4000 Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections
Incubator MMM Medcenter Incucell 707 
Microscope Cover Glasses (24x50 mm) Assistent  40990151
Microscope Slide Boxes  Kartell 278 Used as humid chambers for immunohistochemistry
Neck holder Linie zwo SB-035X-02 Used as strap to hold the stainless steel tumbler
No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade Swann-Morton 0205
Paint brushes Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X Used to handle cryosections
Permanent Marker Pen Black Klinipath/VWR 98307-R Used to label slides
Pierce Fixation Forceps F.S.T 18155-13
Polystyrene Box  H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat
Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3 Aesculap BB073R
Stainless Steel Cup 10oz  Eboxer B07GFCBPFH Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing
Superfrost Ultra Plus slides ThermoFisher J1800AMNZ
Surgical tweezers 1/2 teeth Medische Vakhandel 1303152 Also called "Rat teeth tweezers"
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge F.S.T 15000-00
Weighing boats VWR international 611-2249
Whole-Slide Scanner for Fluorescence Zeiss Axio Scan.Z1
Reagents
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b Sigma-Aldrich SAB4600477 Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 ThermoFisher A-21121 Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM Abcam ab175702 Used at a final concentration of 1:1,000
Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody ThermoFisher A-21247 Used at a final concentration of 1:500
BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) ThermoFisher D3922 Used at a final concentration of 1 µg/mL
BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) ThermoFisher D3835 Used at a final concentration of 1 µg/mL
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) ThermoFisher D1306 Used at a final concentration of 0.5 µg/mL
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D-8418 Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Sigma-Aldrich 1004969011 CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Isopentane GPR RectaPur VWR international 24872.298 CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection.
Liquid Nitrogen CAUTION:  Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids.
Mouse on mouse Blocking Reagent  Vector Labs MKB-2213-1 Used at concentration of 1:30
Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b DSHB University of Iowa BA-D5-supernatant Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene:  MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1 DSHB University of Iowa SC-71-supernatant Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene:  MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa 6H1-supernatant Used at a final concentration of 1:5
Normal Goat Serum (NGS) Vector Labs S-1000
PBS 0.1 M Commonly used on histology laboratories
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen  P36930
Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal) Sigma-Aldrich L0663 Used at a final concentration of 1:1,000
Tissue-Tek O.C.T compound Sakura  4583
Software
Adobe Illustrator CC Adobe Inc. Used to design the figures
Adobe Photoshop Adobe Inc. Confocal software
BioRender https://biorender.com/ Used to design the figures
Fiji/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ Used to analyse the acquired images
Microsoft PowerPoint Microsoft Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types
Zen Blue 2.6 Zeiss Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963 (2020).
  2. Miljkovic, I., et al. Greater skeletal muscle fat infiltration is associated with higher all-cause and cardiovascular mortality in older men. Journals of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (9), 1133-1140 (2015).
  3. Nachit, M., et al. Myosteatosis rather than sarcopenia associates with non-alcoholic steatohepatitis in non-alcoholic fatty liver disease preclinical models. Journal of Cachexia, Sarcopenia, and Muscle. 12 (1), 144-158 (2021).
  4. Aleixo, G. F. P., et al. Myosteatosis and prognosis in cancer: Systematic review and meta-analysis. Critical Reviews in Oncology/Hematolgoy. 145, 102839 (2020).
  5. Gemmink, A., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Exercising your fat (metabolism) into shape: a muscle-centred view. Diabetologia. 63 (8), 1453-1463 (2020).
  6. van Loon, L. J. Use of intramuscular triacylglycerol as a substrate source during exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 97 (4), 1170-1187 (2004).
  7. Coen, P. M., Goodpaster, B. H. Role of intramyocelluar lipids in human health. Trends in Endocrinology and Metabolism. 23 (8), 391-398 (2012).
  8. Seibert, J. T., Najt, C. P., Heden, T. D., Mashek, D. G., Chow, L. S. Muscle lipid droplets: cellular signaling to exercise physiology and beyond. Trends in Endocrinology and Metabolism. 31 (12), 928-938 (2020).
  9. Bergman, B. C., Goodpaster, B. H. Exercise and muscle lipid content, composition, and localization: influence on muscle insulin sensitivity. Diabetes. 69 (5), 848-858 (2020).
  10. Nielsen, J., Christensen, A. E., Nellemann, B., Christensen, B. Lipid droplet size and location in human skeletal muscle fibers are associated with insulin sensitivity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 313 (6), 721-730 (2017).
  11. Covington, J. D., et al. Intramyocellular lipid droplet size rather than total lipid content is related to insulin sensitivity after 8 weeks of overfeeding. Obesity (Silver Spring). 25 (12), 2079-2087 (2017).
  12. Bosma, M. Lipid droplet dynamics in skeletal muscle). Experimental Cell Research. 340 (2), 180-186 (2016).
  13. Nielsen, J., et al. Increased subsarcolemmal lipids in type 2 diabetes: effect of training on localization of lipids, mitochondria, and glycogen in sedentary human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 298 (3), 706-713 (2010).
  14. Ferreira, R., et al. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria proteome differences disclose functional specializations in skeletal muscle. Proteomics. 10 (17), 3142-3154 (2010).
  15. Barrett, J. S., Whytock, K. L., Strauss, J. A., Wagenmakers, A. J. M., Shepherd, S. O. High intramuscular triglyceride turnover rates and the link to insulin sensitivity: influence of obesity, type 2 diabetes and physical activity. Applied Physiology, Nutrition and Metabolism. , 1-14 (2022).
  16. Daemen, S., et al. Distinct lipid droplet characteristics and distribution unmask the apparent contradiction of the athlete's paradox. Molecular Metabolism. 17, 71-81 (2018).
  17. Bredella, M. A., Ghomi, R. H., Thomas, B. J., Miller, K. K., Torriani, M. Comparison of 3.0 T proton magnetic resonance spectroscopy short and long echo-time measures of intramyocellular lipids in obese and normal-weight women. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 32 (2), 388-393 (2010).
  18. Schrauwen-Hinderling, V. B., Hesselink, M. K., Schrauwen, P., Kooi, M. E. Intramyocellular lipid content in human skeletal muscle. Obesity (Silver Spring). 14 (3), 357-367 (2006).
  19. De Bock, K., et al. Evaluation of intramyocellular lipid breakdown during exercise by biochemical assay, NMR spectroscopy, and Oil Red O staining. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (1), 428-434 (2007).
  20. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochemistry and Cell Biology. 116 (1), 63-68 (2001).
  21. Gueugneau, M., et al. Skeletal muscle lipid content and oxidative activity in relation to muscle fiber type in aging and metabolic syndrome. Journal of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (5), 566-576 (2015).
  22. Gemmink, A., et al. Super-resolution microscopy localizes perilipin 5 at lipid droplet-mitochondria interaction sites and at lipid droplets juxtaposing to perilipin 2. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (11), 1423-1432 (2018).
  23. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 598358, (2011).
  24. Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), 77774 (2013).
  25. Strauss, J. A., Shepherd, D. A., Macey, M., Jevons, E. F. P., Shepherd, S. O. Divergence exists in the subcellular distribution of intramuscular triglyceride in human skeletal muscle dependent on the choice of lipid dye. Histochemistry and Cell Biology. 154 (4), 369-382 (2020).
  26. Shepherd, S. O., et al. Sprint interval and traditional endurance training increase net intramuscular triglyceride breakdown and expression of perilipin 2 and 5. Journal of Physiology. 591 (3), 657-675 (2013).
  27. Whytock, K. L., et al. A 7-day high-fat, high-calorie diet induces fibre-specific increases in intramuscular triglyceride and perilipin protein expression in human skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (6), 1151-1167 (2020).
  28. Wang, C., Yue, F., Kuang, S. Muscle histology characterization using h&e staining and muscle fiber type classification using immunofluorescence staining. Bio-Protocol. 7 (10), (2017).
  29. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51586 (2014).
  30. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52793 (2015).
  31. Leiva-Cepas, F., et al. Laboratory methodology for the histological study of skeletal muscle. Archivos de Medicina del Deporte. 35 (186), 254-262 (2018).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 10 (3), 197-205 (1989).
  34. Komiya, Y., et al. Mouse soleus (slow) muscle shows greater intramyocellular lipid droplet accumulation than EDL (fast) muscle: fiber type-specific analysis. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 38 (2), 163-173 (2017).
  35. Andrich, D. E., et al. Altered lipid metabolism impairs skeletal muscle force in young rats submitted to a short-term high-fat diet. Frontiers in Physiology. 9, 1327 (2018).
  36. Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiologica. 199 (4), 451-463 (2010).
  37. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
  38. Gemmink, A., et al. Decoration of intramyocellular lipid droplets with PLIN5 modulates fasting-induced insulin resistance and lipotoxicity in humans. Diabetologia. 59 (5), 1040-1048 (2016).
  39. Askinas, C., et al. Biophotonics Congress: Biomedical Optics Congress 2018 (Microscopy/Translational/Brain/OTS). , JTu3A.4 (Optical Society of America) (2018).
  40. Morén, B., et al. EHD2 regulates adipocyte function and is enriched at cell surface-associated lipid droplets in primary human adipocytes. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1147-1159 (2019).
  41. Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
  42. de la Rosa Rodriguez, M. A., et al. Hypoxia-inducible lipid droplet-associated induces DGAT1 and promotes lipid storage in hepatocytes. Molecular Metabolism. 47, 101168 (2021).
  43. Jevons, E. F. P., Gejl, K. D., Strauss, J. A., Ørtenblad, N., Shepherd, S. O. Skeletal muscle lipid droplets are resynthesized before being coated with perilipin proteins following prolonged exercise in elite male triathletes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 318 (3), 357-370 (2020).
  44. Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochemistry and Cell Biology. 124 (5), 445-452 (2005).
  45. Prats, C., et al. Decrease in intramuscular lipid droplets and translocation of HSL in response to muscle contraction and epinephrine. Journal of Lipid Research. 47 (11), 2392-2399 (2006).
  46. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24 (Unit 24.22) (2007).
  47. Xue, Y., Lim, S., Bråkenhielm, E., Cao, Y. Adipose angiogenesis: quantitative methods to study microvessel growth, regression and remodeling in vivo. Nature Protocols. 5 (5), 912-920 (2010).
  48. Muliyil, S., et al. ADAM17-triggered TNF signalling protects the ageing Drosophila retina from lipid droplet-mediated degeneration. The EMBO Journal. 39 (17), 104415 (2020).
  49. Yan, Q., et al. Autophagy activation contributes to lipid accumulation in tubular epithelial cells during kidney fibrosis. Cell Death Discovery. 4, 2 (2018).
  50. Coassin, S., et al. Investigation and functional characterization of rare genetic variants in the adipose triglyceride lipase in a large healthy working population. PLoS Genetics. 6 (12), 1001239 (2010).
  51. Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
  52. Chen, Q., et al. Rab8a deficiency in skeletal muscle causes hyperlipidemia and hepatosteatosis by impairing muscle lipid uptake and storage. Diabetes. 66 (9), 2387-2399 (2017).
  53. Gemmink, A., et al. Decoration of myocellular lipid droplets with perilipins as a marker for in vivo lipid droplet dynamics: A super-resolution microscopy study in trained athletes and insulin resistant individuals. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (2), 158852 (2021).
  54. Bergman, B. C., Hunerdosse, D. M., Kerege, A., Playdon, M. C., Perreault, L. Localisation and composition of skeletal muscle diacylglycerol predicts insulin resistance in humans. Diabetologia. 55 (4), 1140-1150 (2012).

Tags

Medicin udgave 184
Fibertype og subcellulær-specifik analyse af lipiddråbeindhold i skeletmuskulatur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Selvais, C. M., De Cock, L. L.,… More

Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-López de Carrizosa, M. A. Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (184), e63718, doi:10.3791/63718 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter