التنميط الجيني لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة في جينوم الميتوكوندريا عن طريق البيروسي
Summary
تمكن مقايسات Pyrosequencing من التنميط الجيني القوي والسريع لتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة للحمض النووي للميتوكوندريا في الخلايا أو الأنسجة غير المتجانسة.
Abstract
ارتبطت الطفرات في جينوم الميتوكوندريا (mtDNA) بالأمراض الوراثية الموروثة من الأم. ومع ذلك ، فقد زاد الاهتمام بتعدد أشكال mtDNA في السنوات الأخيرة بسبب القدرة التي تم تطويرها مؤخرا على إنتاج نماذج عن طريق طفرات mtDNA وتقدير جديد للارتباط بين الانحرافات الجينية للميتوكوندريا والأمراض الشائعة المرتبطة بالعمر مثل السرطان والسكري والخرف. Pyrosequencing هي تقنية التسلسل عن طريق التوليف التي تستخدم على نطاق واسع عبر مجال الميتوكوندريا لتجارب التنميط الجيني الروتينية. إن قدرتها على تحمل التكاليف النسبية عند مقارنتها بطرق التسلسل المتوازي الضخمة وسهولة التنفيذ تجعلها تقنية لا تقدر بثمن في مجال علم الوراثة الميتوكوندريا ، مما يسمح بالقياس الكمي السريع للبلازما غير المتجانسة مع زيادة المرونة. على الرغم من التطبيق العملي لهذه الطريقة ، فإن تنفيذها كوسيلة للتنميط الجيني mtDNA يتطلب ملاحظة بعض الإرشادات ، على وجه التحديد لتجنب بعض التحيزات ذات الأصل البيولوجي أو التقني. يحدد هذا البروتوكول الخطوات والاحتياطات اللازمة في تصميم وتنفيذ مقايسات البيروسكونيكز لاستخدامها في سياق قياس التغاير الجنسي.
Introduction
يوجد جينوم الميتوكوندريا في شكل جزيئات دائرية صغيرة (16.5 كيلو بايت) (mtDNA) موجودة في الجزء الأعمق من الميتوكوندريا المسماة المصفوفة وتشفر 13 وحدة فرعية من السلسلة التنفسية للميتوكوندريا ، بالإضافة إلى tRNAs و rRNAs اللازمة لترجمتها في الموقع بواسطة ريبوسوم الميتوكوندريا1. يمثل هذا الجينوم حوالي 1٪ من جميع البروتينات اللازمة لوظيفة الميتوكوندريا ، والباقي مشفر بواسطة الحمض النووي النووي (nDNA). من المفترض عموما أن الميتوكوندريا مشتقة من حدث اندماج تكافلي داخلي بين سلف ألفا بروتيني وخلية حقيقية النواة سلف. بمجرد حدوث هذا التعايش الافتراضي ، تم نقل المعلومات الوراثية للميتوكوندريا تدريجيا إلى النواة على مدار الدهور ، وهو ما يفسر الاكتناز المذكور أعلاه ل mtDNA عند مقارنته بجينومات البكتيريا الزرقاءالحديثة 2. يتضح هذا النقل للجينات بقوة من خلال وجود امتدادات طويلة من الحمض النووي النووي (nDNA) متماثلة للغاية مع التسلسلات الموجودة في mtDNA. تعد تسلسلات الميتوكوندريا النووية (NUMTs) مصدرا شائعا لسوء التفسير أثناء التنميط الجيني ، ويجب اتخاذ بعض الاحتياطات لتجنب التحيزات النووية عند التنميط الجيني mtDNA3 (الشكل 1 أ).
ميزة أخرى مميزة ل mtDNA هي أن رقم نسخته يختلف باختلاف نوع الخلية ، حيث يتراوح من عشرات إلى آلاف النسخ لكل خلية4. نظرا لهذه الطبيعة متعددة النسخ ، يمكن أن يؤوي mtDNA مجموعة واسعة من الأنماط الجينية داخل خلية واحدة ، مما قد يؤدي إلى توزيع أكثر استمرارية للأليلات على عكس الأليلات المنفصلة المرتبطة بالجينات النووية عند النظر في زيجوت الكروموسومات. يشار إلى عدم تجانس أليلات الميتوكوندريا باسم رأب الميتوكوندريا ، والذي يتم التعبير عنه عادة في النسبة المئوية لانتشار طفرة معينة كنسبة من إجمالي mtDNA في خلية معينة. يمكن أن يتناقض التغاير مع التماثل ، والذي يشير إلى نوع فريد من mtDNA موجود عبر الخلية.
يعد قياس رأب الميتوكوندريا غير المتجانس ذا أهمية خاصة عند تحديد نسبة جزيئات mtDNA التي تؤوي المتغيرات المسببة للأمراض. تأتي هذه المتغيرات في شكل تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) ، أو indels الصغيرة ، أو عمليات الحذف واسعة النطاق5. معظم البشر غير متجانسين للمتغيرات المسببة للأمراض. ومع ذلك ، فإنها لا تظهر أي أنماط ظاهرية سريرية ، والتي غالبا ما تظهر فقط عند مستويات أعلى من التغاير من mtDNA الممرض في ظاهرة يشار إليها باسم تأثير العتبة6. في حين أن القيم المرتبطة بالإمراضية تعتمد بشكل كبير على طبيعة الطفرة المسببة للأمراض والأنسجة التي تحدث فيها ، فإنها عادة ما تكون أعلى من 60٪ من البلازما غير المتجانسة7.
هناك العديد من مجالات البحث التي يكون فيها التنميط الجيني للميتوكوندريا شائعا. في المجال الطبي ، يمكن أن يكون اختبار طفرات mtDNA أو قياسها كميا بمثابة معيار تشخيصي لأمراض الميتوكوندريا ، والتي يحتوي الكثير منها على انحرافات mtDNA كأصللها 5. بالإضافة إلى دراسة الطفرات المسببة للأمراض البشرية ، من المرجح أن يزداد انتشار النماذج الحيوانية التي تؤوي SNPs المسببة للأمراض في mtDNA ، نظرا للظهور الأخير لتحرير قاعدة الميتوكوندريا الذي تم تمكينه بواسطة محرري قاعدة السيتوزين المشتقة من DddA (DdCBEs) المستهدفة بالميتوكوندريا 8 و deaminases المستندة إلى TALE (TALEDs) لتحرير قاعدة الأدينين9. سيكون هذا النهج مفيدا في فهم التفاعل بين الأنماط الجينية الشاذة للميتوكوندريا والاختلالات الناتجة عنها. هناك أيضا بحث علمي مستمر في إعادة تشكيل جينوم الميتوكوندريا للاستخدام النهائي كاستراتيجية علاجية في أمراض الميتوكوندريا البشرية من خلال نهج يعرف باسم تحول المغايرة. يتضمن هذا المجال من البحث في المقام الأول توجيه النيوكليازات الخاصة بالطفرة إلى مصفوفة الميتوكوندريا. ينتج عن هذا تدهور تفضيلي ل mtDNA الممرض ، مما يؤدي إلى عمليات إنقاذ في النمط الظاهري10،11،12،13. تتطلب أي تجارب تنطوي على إعادة تشكيل النمط الجيني للميتوكوندريا طريقة كمية قوية لتقييم تحولات التغاير الجنسي.
يتم استخدام مجموعة متنوعة من الطرق للنمط الجيني mtDNA ، وهذه تختلف وفقا لطبيعة الطفرة. تعد طرق تسلسل الجيل التالي (NGS) أكثر دقة عندما يتعلق الأمر بقياس SNPs في mtDNA ؛ ومع ذلك ، تظل هذه الطرق باهظة التكلفة بالنسبة للقياس الكمي الروتيني لرأب الميتوكوندريا ، خاصة إذا كان عدد العينات صغيرا. يمكن أن يسمح تسلسل سانجر أيضا باكتشاف SNPs ؛ ومع ذلك ، فإن هذا النهج ليس كميا وغالبا ما يفشل في اكتشاف مستويات منخفضة من التغاير أو يمكن أن يكون غير دقيق عند تقدير البلازما الغيرية العالية. يقترح Pyrosequencing ، كاختبار يتضمن الحد الأدنى من التحضير ويتيح القياس الكمي السريع للبلازما غير المتجانسة لأي عينة mtDNA ، كحل وسط مناسب بين هذين النقيضين. تم استخدام هذه الطريقة بشكل روتيني لتحديد كمية SNPs الميتوكوندريا من قبل العديد من الباحثين في سياقات مختلفة ، بما في ذلك تحليل الطب الشرعي 14،15 ، والتشخيص السريري 16 ، أو التنميط الجيني ل mtDNA من الخلايا المفردة17.
يتضمن هذا الفحص أول خطوة تضخيم مسبق لتفاعل البوليميراز المتسلسل لمنطقة تحيط ب SNP في mtDNA ، والتي يتبعها مقايسة التسلسل عن طريق التوليف باستخدام خيط واحد من amplicon الذي تم إنشاؤه مسبقا. يجب أن يكون أحد البادئين المستخدمين في خطوة التضخيم المسبق هو البيوتينيل في الطرف 5 ‘، مما سيمكن جهاز pyrosequencing من عزل الشريط المفرد من الحمض النووي لاستخدامه كقالب لتفاعل التسلسل. ثم يتم تلدين التمهيدي التسلسل الثالث على الشريط البيوتينيل المحتفظ به ، والذي يسمح بتخليق الحمض النووي الناشئ كنيوكليوتيدات منقوص الأكسجين ليتم صرفها بترتيب محدد مسبقا في غرفة التفاعل. يسجل جهاز التسلسل الحراري كمية كل قاعدة مدمجة بناء على قراءات مضيئة ، مما يسمح بالتحديد الكمي النسبي لأليلات الميتوكوندريا الطافرة والبرية عند تخليق الحمض النووي (الشكل 1 ب). يتم إنشاء التلألؤ بواسطة إنزيم لوسيفيراز ، الذي ينبعث منه الضوء في وجود ATP الذي يصنعه ATP sulfurylase de novo في كل حدث دمج من البيروفوسفات المنبعث من كل نيوكليوتيد. يمكن تلخيص هذين التفاعلين على النحو التالي:
1. PPi (من دمج النوكليوتيدات) + APS → ATP + كبريتات (ATP sulfurylase)
2. ATP + لوسيفيرين + O 2 → أمبير + PPi + أوكسي لوسيفيرين + CO2 + ضوء (لوسيفيراز)
يمثل اكتشاف قواعد الأدينين بواسطة التسلسل الحراري دون تفاعل ATP المتقاطع مع اللوسيفيراز في التفاعل الثاني تحديا. ومع ذلك ، يتم حل هذا باستخدام نظير الأدينين لتخليق الحمض النووي ، وهو dATPαS. على الرغم من عدم كونه ركيزة مثالية للوسيفيراز ، إلا أنه ينتج تلألؤا أقوى مقارنة بالنيوكليوتيدات الثلاثة الأخرى ، والتي يتم ضبطها رقميا بواسطة جهاز التسلسل الحراري وضبطها على عامل 0.9. بسبب هذا التباين المتأصل ، يقترح تجنب تسلسل الأدينين في موضع SNP (انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل).
يفصل البروتوكول التالي طريقة تقييم mtDNA heteroplasmy عن طريق pyrosequencing ويحدد الاحتياطات اللازمة في تصميم بادئات التضخيم لتجنب التحيز البيولوجي أو التقني عند التنميط الجيني SNPs في mtDNA. يتضمن الأخير المسح الرقمي واختيار مجموعات التمهيدي ، وتحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل المسبق ، وأخيرا تسلسل الفحص وتحسينه. تم عرض مثالين تطبيقيين على المقايسات: أولا ، تحسين المتغير الممرض البشري الأكثر شيوعا m.3243A >G 18 ، والثاني ، التنميط الجيني لخلايا الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEF) التي خضعت لتحويل التغاير باستخدام التقنيات المطورة في مختبر Minczuk في كامبريدج 10،11،12،19،20،21،22.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويتمثل أحد الجوانب الحاسمة لنجاح البروتوكول في تجنب التلوث، لا سيما عند استخدام كميات منخفضة من المواد الأولية. يوصى باستخدام غطاء للأشعة فوق البنفسجية وأطراف ماصة مفلترة عند تحضير العينات حيثما أمكن ذلك ، وكذلك للحفاظ على مناطق التضخيم المسبق وما بعد التضخيم منفصلة. يجب دائما تضمين الق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعرب عن تقديرنا لسيلفيا مارشيه وكونستانزا لامبرتي (معهد علم الأعصاب “كارلو بيستا” ، مؤسسة IRCCS ، ميلانو) لإعداد وتوفير خلايا cybrid m.3243A>G المستخدمة كأمثلة توضيحية لهذا البروتوكول. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لأعضاء مجموعة علم الوراثة الميتوكوندريا (MRC-MBU ، جامعة كامبريدج) للمناقشة المفيدة خلال هذا البحث. تم دعم هذا العمل بتمويل أساسي من مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (MC_UU_00015/4 و MC_UU_00028/3). P.A.N. و P.S.-P. بالإضافة إلى ذلك ، يتم دعمها من قبل مؤسسة Lily ومؤسسة Champ ، على التوالي.
Materials
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
- Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
- Chinnery, P. F., Hudson, G. Mitochondrial genetics. British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).
- Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
- Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
- Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Recent advances in mitochondrial disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).
- Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
- Cho, S. -. I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
- Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
- Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
- Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
- Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
- Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
- Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
- Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
- Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
- El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
- Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
- Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
- Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
- Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
- Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
- Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
- Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
- Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).
