Genotipagem de Polimorfismos de Nucleotídeo Único no Genoma Mitocondrial por Pirosequenciamento

Summary

Os ensaios de pirosequenciamento permitem a genotipagem robusta e rápida de polimorfismos de nucleotídeo único do DNA mitocondrial em células ou tecidos heteroplasmáticos.

Abstract

Mutações no genoma mitocondrial (mtDNA) têm sido associadas a doenças genéticas maternas hereditárias. No entanto, o interesse em polimorfismos do mtDNA tem aumentado nos últimos anos devido à capacidade recentemente desenvolvida de produzir modelos por mutagênese do mtDNA e uma nova apreciação da associação entre aberrações genéticas mitocondriais e doenças comuns relacionadas à idade, como câncer, diabetes e demência. O pirosequenciamento é uma técnica de sequenciamento por síntese amplamente empregada em todo o campo mitocondrial para experimentos de genotipagem de rotina. Sua relativa acessibilidade quando comparada a métodos massivos de sequenciamento paralelo e facilidade de implementação a tornam uma técnica inestimável no campo da genética mitocondrial, permitindo a rápida quantificação de heteroplasmia com maior flexibilidade. Apesar da praticidade desse método, sua implementação como meio de genotipagem do mtDNA requer a observação de certas diretrizes, especificamente para evitar certos vieses de origem biológica ou técnica. Este protocolo descreve as etapas e precauções necessárias no projeto e implementação de ensaios de pirosequenciamento para uso no contexto da medição de heteroplasmia.

Introduction

O genoma mitocondrial existe na forma de pequenas moléculas circulares (mtDNA de 16,5 kb) presentes no compartimento mais interno da mitocôndria, denominado matriz e codifica 13 subunidades da cadeia respiratória mitocondrial, bem como os RNAt e RNAr necessários para sua tradução in situ pelo ribossomo mitocondrial¹. Este genoma representa aproximadamente 1% de todas as proteínas necessárias para a função mitocondrial, sendo o restante codificado pelo DNA nuclear (nDNA). É comumente assumido que as mitocôndrias são derivadas de um evento de fusão endossimbiótico entre um ancestral alfa-proteobacteriano e uma célula eucariótica ancestral. Uma vez ocorrida essa simbiose hipotética, a informação genética das mitocôndrias foi gradualmente transferida para o núcleo ao longo de eras, o que explica a já mencionada compacidade do mtDNA quando comparada aos genomas das cianobactérias^modernas2. Tal transferência de genes é mais fortemente evidenciada pela existência de longos trechos de nDNA que são altamente homólogos às sequências encontradas no mtDNA. Essas sequências mitocondriais nucleares (NUMTs) são uma fonte comum de interpretação errônea durante a genotipagem, e certos cuidados devem ser tomados para evitar vieses nucleares ao genotipar o mtDNA³ (Figura 1A).

Outra característica distintiva do mtDNA é que seu número de cópias varia dependendo do tipo celular, numerando de dezenas a milhares de cópias por célula⁴. Devido a essa natureza multicopiada, o mtDNA pode abrigar uma ampla gama de genótipos dentro de uma única célula, o que pode resultar em uma distribuição mais contínua de alelos em contraste com os alelos discretos associados a genes nucleares quando se considera a zigosidade dos cromossomos. Essa heterogeneidade dos alelos mitocondriais é referida como heteroplasmia mitocondrial, que é tipicamente expressa na prevalência percentual de uma dada mutação como uma proporção do mtDNA total em uma dada célula. A heteroplasmia pode ser contrastada com a homoplasmia, que se refere a uma espécie única de mtDNA estar presente em uma célula.

A mensuração da heteroplasmia mitocondrial é de particular interesse quando se quantifica a proporção de moléculas de mtDNA que abrigam variantes patogênicas. Tais variantes apresentam-se na forma de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), pequenos indéis ou deleções em grande escala⁵. A maioria dos seres humanos é heteroplasmática para variantes patogênicas; no entanto, não exibem fenótipos clínicos, que muitas vezes só se manifestam em níveis mais elevados de heteroplasmia do mtDNA patogênico, em um fenômeno denominado efeito limiar⁶. Embora os valores associados à patogenicidade sejam altamente dependentes da natureza da mutação patogênica e do tecido em que ela ocorre, eles tipicamente encontram-se acima de 60% de heteroplasmia⁷.

Existem várias áreas de pesquisa nas quais a genotipagem mitocondrial é comum. Na área médica, testar ou quantificar mutações no mtDNA pode servir como critério diagnóstico para doenças mitocondriais, muitas das quais têm como origem as aberrações do mtDNA⁵. Além do estudo de mutações patogênicas humanas, é provável que a prevalência de modelos animais que abrigam SNPs patogênicos no mtDNA aumente, dado o recente advento da edição de bases mitocondriais possibilitada por editores de base de citosina derivados de DddA (DdCBEs) direcionados mitocondrialmente8 e deaminases baseadas em TALEs (TALEDs^{) para edição de} bases de adenina9. Esta abordagem será fundamental para o entendimento da interação entre genótipos mitocondriais aberrantes e as disfunções resultantes. Há também pesquisas científicas em andamento sobre a remodelação do genoma mitocondrial para uso final como estratégia terapêutica em doenças mitocondriais humanas por meio de uma abordagem conhecida como deslocamento de heteroplasmia. Este campo de pesquisa envolve principalmente o direcionamento de nucleases específicas de mutação para a matriz mitocondrial; isso resulta na degradação preferencial do mtDNA patogênico, levando a resgates no fenótipo10,11,12,13. Quaisquer experimentos envolvendo a remodelação do genótipo mitocondrial requerem um método quantitativo robusto para avaliar os desvios heteroplasmáticos.

Uma grande variedade de métodos é usada para genotipar o mtDNA, e estes variam de acordo com a natureza da mutação. Os métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS) são mais precisos quando se trata de quantificar SNPs no mtDNA; no entanto, esses métodos permanecem proibitivamente caros para a quantificação rotineira da heteroplasmia mitocondrial, particularmente se o número de amostras for pequeno. O sequenciamento de Sanger também pode permitir a detecção de SNPs; no entanto, essa abordagem não é quantitativa e muitas vezes falha em detectar baixos níveis de heteroplasmia ou pode ser imprecisa ao estimar altas heteroplasmias. O pirosequenciamento, como um ensaio que envolve preparação mínima e permite a quantificação rápida de heteroplasmia para qualquer amostra de mtDNA, é proposto como um compromisso adequado entre esses dois extremos. Esse método tem sido utilizado rotineiramente para quantificar SNPs mitocondriais por inúmeros pesquisadores em vários contextos, incluindo análise forense14,15^, diagnóstico clínico16 ou genotipagem do mtDNA a partir de células^isoladas17.

Este ensaio envolve uma primeira etapa de pré-amplificação por PCR de uma região flanqueando o SNP no mtDNA, que é seguida por um ensaio de sequenciamento por síntese usando uma fita do amplicon previamente gerado. Um dos dois primers utilizados na etapa de pré-amplificação deve ser biotinilado na extremidade 5′, o que permitirá ao aparelho pirosequenciador isolar a fita única de DNA a ser usada como molde para a reação de sequenciamento. Um terceiro primer de sequenciamento é então recozido na fita biotinilada retida, o que permite que a síntese de DNA nascente como desoxinucleotídeos seja dispensada em uma ordem predefinida na câmara de reação. O pirosequenciador registra a quantidade de cada base incorporada com base em uma leitura luminescente, permitindo a quantificação relativa de alelos mitocondriais mutantes e selvagens após a síntese de DNA (Figura 1B). A luminescência é gerada por uma enzima luciferase, que emite luz na presença de ATP que uma ATP sulfurilase sintetiza de novo a cada evento de incorporação a partir dos pirofosfatos liberados por cada nucleotídeo. Essas duas reações podem ser resumidas da seguinte forma:

1. PP_i (da incorporação de nucleotídeos) + APS → ATP + sulfato (ATP sulfurilase)

2. ATP + luciferina + O 2 → AMP + PP_i + oxiluciferina + CO₂ + luz (luciferase)

A detecção de bases de adenina pelo pirosequenciador sem reação cruzada de ATP com a luciferase na segunda reação é um desafio. No entanto, isso é resolvido usando um análogo de adenina para a síntese de DNA, ou seja, dATPαS. Apesar de não ser um substrato perfeito para a luciferase, produz uma luminescência mais forte em comparação com os outros três nucleotídeos, que é ajustada digitalmente pelo pirosequenciador e ajustada para um fator de 0,9. Devido a essa variabilidade inerente, sugere-se evitar o sequenciamento de adenina na posição SNP (veja a discussão para mais detalhes).

O protocolo a seguir detalha o método de avaliação da heteroplasmia do mtDNA por pirosequenciamento e descreve as precauções necessárias no planejamento dos primers de amplificação para evitar viés biológico ou técnico ao genotipar SNPs no mtDNA. Este último envolve o levantamento e seleção digital dos conjuntos de primers, a otimização da PCR pré-amplificação e, finalmente, o sequenciamento e refinamento do ensaio. Dois ensaios de exemplo aplicados são demonstrados: primeiro, a otimização da variante patogênica humana mais comum m.3243A>G¹⁸ e, segundo, a genotipagem de células de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF) que sofreram deslocamento heteroplasmático usando tecnologias desenvolvidas no laboratório Minczuk em Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.

Protocol

Consentimento informado foi fornecido para o uso das células cybrid 3243A>G humanas e dos MEFs m.5024C>T imortalizados usados neste estudo. A aprovação ética não foi necessária neste caso, pois as células do paciente não foram coletadas na Universidade de Cambridge. O uso de fibroblastos humanos pode, no entanto, exigir aprovação ética. É altamente recomendável seguir as melhores práticas para a configuração do PCR ao preparar o DNA da amostra para pirosequenciamento. A amplificação frequente usando pri…

Representative Results

Esta seção apresenta um exemplo de otimização de um ensaio de pirosequenciamento para uma mutação patogênica humana no mtDNA, bem como dados de sequenciamento da genotipagem de fibroblastos embrionários (MEFs) heteroplasmáticos (m.5024C>T) tratados com nucleases mitocondriais de dedo de zinco (mtZFNs). A otimização do ensaio para células humanas e a comparação de dois ensaios diferentes demonstram como selecionar o mais preciso, enquanto a genotipagem de células MEF geneticamente modificadas no segundo exe…

Discussion

Um aspecto crítico para o sucesso do protocolo é evitar contaminações, especialmente quando se utilizam baixas quantidades de material de partida. Recomenda-se o uso de uma capa UV e pontas de pipeta filtradas ao preparar as amostras sempre que possível, bem como manter as áreas de pré-amplificação e pós-amplificação separadas. Medições em branco e amostras de heteroplasmia conhecida (como DNA selvagem) devem sempre ser incluídas para serem usadas como referência para verificar vieses técnicos ou biológ…

Materials

KOD Hot Start DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	71086
PyroMark Assay Design 2.0	QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips	QIAGEN	974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)	QIAGEN	974022
Pyromark Q48 Autoprep	QIAGEN	9002470
PyroMark Q48 Cartridge Set	QIAGEN	9024321
Pyromark Q48 Disks	QIAGEN	974901
Pyromark Q48 Magnetic beads	QIAGEN	974203
PyroMark Q48 Software License (1)	QIAGEN	9024325