通过焦磷酸测序对线粒体基因组中的单核苷酸多态性进行基因分型
Summary
焦磷酸测序测定能够对异质细胞或组织中的线粒体 DNA 单核苷酸多态性进行稳健、快速的基因分型。
Abstract
线粒体基因组（mtDNA）的突变与母系遗传疾病有关。然而，近年来，由于最近开发的通过mtDNA诱变产生模型的能力以及对线粒体遗传畸变与常见的年龄相关疾病（如癌症，糖尿病和痴呆）之间关联的新认识，对mtDNA多态性的兴趣有所增加。焦磷酸测序是一种合成测序技术，广泛用于线粒体领域的常规基因分型实验。与大规模并行测序方法相比，其相对经济实惠且易于实施，使其成为线粒体遗传学领域的宝贵技术，能够以更高的灵活性快速定量异质性。尽管这种方法很实用，但它作为mtDNA基因分型手段的实施需要遵守某些准则，特别是为了避免生物学或技术来源的某些偏差。该协议概述了设计和实施用于异质测量的焦磷酸测序测定的必要步骤和预防措施。
Introduction
线粒体基因组以小（16.5 kb）环状分子（mtDNA）的形式存在，存在于线粒体最内侧的隔室中，称为基质，编码线粒体呼吸链的13个亚基，以及线粒体核糖体1原位翻译所需的tRNA和rRNA。该基因组约占线粒体功能所需的所有蛋白质的1%，其余部分由核DNA（nDNA）编码。人们通常认为线粒体来源于α-变形杆菌祖先和祖先真核细胞之间的内共生融合事件。一旦这种假设的共生发生，线粒体的遗传信息就会在亿万年内逐渐转移到细胞核上，这解释了与现代蓝藻2的基因组相比，mtDNA的致密性。这种基因转移最有力地证明存在长段nDNA，这些nDNA与mtDNA中发现的序列高度同源。这些核线粒体序列（NUMTs）是基因分型过程中误解的常见来源，在对mtDNA3进行基因分型时，必须采取某些预防措施以避免核偏差（图1A）。
mtDNA的另一个显着特征是其拷贝数因细胞类型而异，每个细胞4的拷贝数从数十到数千个不等。由于这种多拷贝性质，mtDNA可以在单个细胞内携带广泛的基因型，与考虑染色体的合合性时与核基因相关的离散等位基因相比，这可以导致等位基因的更连续分布。线粒体等位基因的这种异质性被称为线粒体异质性，其通常以给定突变的患病率百分比表示为给定细胞中总mtDNA的比例。异质性可以与同质性形成对比，同质性是指存在于细胞中的独特mtDNA物种。
在量化携带致病变异的mtDNA分子的比例时，测量线粒体异质性特别重要。这些变体以单核苷酸多态性（SNP）、小插入缺失或大规模缺失的形式出现5。大多数人对致病变异是异质的;然而，它们不表现出任何临床表型，通常只表现在致病性mtDNA的较高异质水平上，这种现象称为阈值效应6。虽然与致病性相关的值高度依赖于致病突变的性质及其发生的组织，但它们通常高于 60% 异质性7。
有几个研究领域线粒体基因分型很常见。在医学领域，检测或量化mtDNA突变可以作为线粒体疾病的诊断标准，其中许多疾病以mtDNA畸变为起源5。除了对人类致病突变的研究外，鉴于最近出现了线粒体靶向DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBEs）8和用于腺嘌呤碱基编辑的基于TAL的脱氨酶（TALEDs）实现的线粒体碱基编辑，mtDNA中携带致病性SNP的动物模型的患病率可能会增加9.这种方法将有助于理解异常线粒体基因型与由此产生的功能障碍之间的相互作用。还正在进行一项科学研究，通过一种称为异质转移的方法重塑线粒体基因组，最终用作人类线粒体疾病的治疗策略。该研究领域主要涉及将突变特异性核酸酶引导至线粒体基质;这导致致病性mtDNA的优先降解，导致表型10，11，12，13的拯救。任何涉及线粒体基因型重塑的实验都需要一种稳健的定量方法来评估异质位移。
用于对mtDNA进行基因分型的方法多种多样，这些方法根据突变的性质而有所不同。下一代测序（NGS）方法在量化mtDNA中的SNP时更加精确;然而，这些方法对于线粒体异质性的常规定量仍然非常昂贵，尤其是在样品数量较少的情况下。桑格测序还可以检测SNP;然而，这种方法不是定量的，并且通常无法检测到低水平的异质性，或者在估计高异质性时可能不准确。焦磷酸测序作为一种涉及最少制备并能够快速定量任何mtDNA样品异质性的测定方法，被认为是这两个极端之间的适当折衷方案。该方法已被许多研究人员常规用于量化线粒体SNPs，包括法医分析14，15，临床诊断16或来自单细胞的mtDNA的基因分型17。
该测定涉及mtDNA中SNP侧翼区域的第一个PCR预扩增步骤，然后使用先前生成的扩增子的一链进行逐个合成测定。预扩增步骤中使用的两种引物之一必须在5’端进行生物素化，这将使焦磷酸测序装置能够分离单链DNA以用作测序反应的模板。然后将第三个测序引物退火到保留的生物素化链上，这允许新生的DNA合成，因为脱氧核苷酸以预定义的顺序分配到反应室中。热测序仪根据发光读数记录每个碱基的掺入量，允许在DNA合成时相对定量突变型和野生型线粒体等位基因（图1B）。发光是由荧光素酶产生的，该酶在ATP存在下发光，ATP硫酸化酶在每个掺入事件中从每个核苷酸释放的焦磷酸盐中 从头 合成。这两种反应可以概括如下：
1. PPi （来自核苷酸掺入）+ APS → ATP + 硫酸盐（ATP 硫酸化酶）
2. ATP + 荧光素 + O 2 → AMP + PPi + 氧化荧光素 + CO2 + 光（荧光素酶）
在第二次反应中，通过热测序仪检测腺嘌呤碱基而不与荧光素酶发生ATP交叉反应是一项挑战。然而，这可以通过使用腺嘌呤类似物进行DNA合成来解决，即dATPαS。尽管不是荧光素酶的完美底物，但与其他三种核苷酸相比，它产生更强的发光，由焦距仪进行数字调整并设置为0.9因子。由于这种固有的可变性，建议避免在SNP位置对腺嘌呤进行测序（有关更多详细信息，请参阅讨论）。
以下协议详细介绍了通过焦磷酸测序评估mtDNA异质性的方法，并概述了设计扩增引物时的必要预防措施，以避免在mtDNA中对SNP进行基因分型时出现生物学或技术偏差。后者涉及数字调查和选择引物组，优化预扩增PCR，最后，测序和改进测定。展示了两种应用的示例测定：首先，优化最常见的人类致病变异m.3243A>G 18，其次，使用剑桥Minczuk实验室开发的技术对经历异质转移的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞进行基因分型10，11，12，19，20，21，22。
Protocol
Representative Results
Discussion
该方案成功的一个关键方面是避免污染，特别是在使用少量起始材料时。建议在制备样品时尽可能使用UV罩和过滤移液器吸头，并保持前扩增和后扩增区域分开。应始终包括空白测量和已知异质性（例如野生型DNA）的样品，以用作检查技术或生物学偏差的基准。
该测定固有的一个值得注意的技术偏差是腺嘌呤类似物掺入产生的发光信号增加。当腺嘌呤在可变位置使用时，它?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢Silvia Marchet和Constanza Lamperti（Istituto Neurologico “Carlo Besta”，IRCCS基金会，米兰）制备和提供m.3243A>Gcybrid细胞，用作该协议的说明性示例。我们还要感谢线粒体遗传学小组（MRC-MBU，剑桥大学）的成员在这项研究过程中进行了有益的讨论。这项工作得到了英国医学研究理事会的核心资金（MC_UU_00015/4和MC_UU_00028/3）的支持。P.A.N. 和 P.S.-P.分别得到百合基金会和冠军基金会的支持。
Materials
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
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