Genotipado de polimorfismos de nucleótido único en el genoma mitocondrial mediante pirosecuenciación
Summary
Los ensayos de pirosecuenciación permiten el genotipado robusto y rápido de polimorfismos de nucleótido único de ADN mitocondrial en células o tejidos heteroplásmicos.
Abstract
Las mutaciones en el genoma mitocondrial (ADNmt) se han asociado con enfermedades genéticas hereditarias por la madre. Sin embargo, el interés en los polimorfismos de ADNmt ha aumentado en los últimos años debido a la capacidad recientemente desarrollada para producir modelos mediante mutagénesis de ADNmt y una nueva apreciación de la asociación entre las aberraciones genéticas mitocondriales y las enfermedades comunes relacionadas con la edad, como el cáncer, la diabetes y la demencia. La pirosecuenciación es una técnica de secuenciación por síntesis que se emplea ampliamente en todo el campo mitocondrial para experimentos de genotipado de rutina. Su relativa asequibilidad en comparación con los métodos de secuenciación paralela masiva y su facilidad de implementación la convierten en una técnica invaluable en el campo de la genética mitocondrial, lo que permite la cuantificación rápida de la heteroplasmia con mayor flexibilidad. A pesar de la practicidad de este método, su implementación como medio de genotipado de ADNmt requiere la observación de ciertas pautas, específicamente para evitar ciertos sesgos de origen biológico o técnico. Este protocolo describe los pasos y precauciones necesarios en el diseño e implementación de ensayos de pirosecuenciación para su uso en el contexto de la medición de heteroplasmia.
Introduction
El genoma mitocondrial existe en forma de pequeñas moléculas circulares (ADNmt) (16,5 kb) presentes en el compartimento más interno de las mitocondrias llamado matriz y codifica 13 subunidades de la cadena respiratoria mitocondrial, así como los ARNt y ARNr necesarios para su traducción in situ por el ribosoma mitocondrial1. Este genoma representa aproximadamente el 1% de todas las proteínas necesarias para la función mitocondrial, el resto de las cuales están codificadas por el ADN nuclear (ADNn). Comúnmente se asume que las mitocondrias se derivan de un evento de fusión endosimbiótica entre un ancestro alfa-proteobacteriano y una célula eucariota ancestral. Una vez que tuvo lugar esta simbiosis hipotética, la información genética de las mitocondrias se transfirió gradualmente al núcleo durante eones, lo que explica la compacidad antes mencionada del ADNmt en comparación con los genomas de las cianobacterias modernas2. Tal transferencia de genes se evidencia más fuertemente por la existencia de largos tramos de ADNn que son altamente homólogos a las secuencias que se encuentran en el ADNmt. Estas secuencias mitocondriales nucleares (NMT) son una fuente común de interpretación errónea durante el genotipado, y se deben tomar ciertas precauciones para evitar sesgos nucleares al genotipar el ADNmt3 (Figura 1A).
Otra característica distintiva del ADNmt es que su número de copias varía según el tipo de célula, numerando desde decenas hasta miles de copias por célula4. Debido a esta naturaleza de múltiples copias, el ADNmt puede albergar una amplia gama de genotipos dentro de una sola célula, lo que puede resultar en una distribución más continua de alelos en contraste con los alelos discretos asociados con genes nucleares cuando se considera la cigosidad de los cromosomas. Esta heterogeneidad de alelos mitocondriales se conoce como heteroplasmia mitocondrial, que generalmente se expresa en el porcentaje de prevalencia de una mutación dada como proporción del ADNmt total en una célula dada. La heteroplasmia se puede contrastar con la homoplasmia, que se refiere a una especie única de ADNmt presente en una célula.
La medición de la heteroplasmia mitocondrial es de particular interés cuando se cuantifica la proporción de moléculas de ADNmt que albergan variantes patogénicas. Tales variantes vienen en forma de polimorfismos de nucleótido único (SNP), pequeños indeles o deleciones a gran escala5. La mayoría de los seres humanos son heteroplásmicos para variantes patogénicas; sin embargo, no exhiben fenotipos clínicos, que a menudo sólo se manifiestan a niveles más altos de heteroplasmia de ADNmt patógeno en un fenómeno denominado efecto umbral6. Si bien los valores asociados con la patogenicidad dependen en gran medida de la naturaleza de la mutación patogénica y del tejido en el que ocurre, generalmente se encuentran por encima del 60% de heteroplasmia7.
Hay varias áreas de investigación en las que el genotipado mitocondrial es común. En el campo de la medicina, las pruebas o cuantificaciones de mutaciones en ADNmt pueden servir como criterio diagnóstico para enfermedades mitocondriales, muchas de las cuales tienen como origen las aberraciones del ADNmt5. Además del estudio de las mutaciones patogénicas humanas, es probable que aumente la prevalencia de modelos animales que albergan SNP patógenos en el ADNmt, dado el reciente advenimiento de la edición de bases mitocondriales habilitada por los editores de bases de citosina derivados de DddA (DdCBE)8 y las desaminasas basadas en TALE (TALED) para la edición de bases de adenina9. Este enfoque será fundamental para comprender la interacción entre los genotipos mitocondriales aberrantes y las disfunciones resultantes. También hay investigaciones científicas en curso sobre la remodelación del genoma mitocondrial para su uso final como estrategia terapéutica en enfermedades mitocondriales humanas a través de un enfoque conocido como desplazamiento de heteroplasmia. Este campo de investigación consiste principalmente en dirigir nucleasas específicas de mutación a la matriz mitocondrial; esto resulta en la degradación preferencial del ADNmt patógeno, lo que lleva a rescates en el fenotipo10,11,12,13. Cualquier experimento que implique la remodelación del genotipo mitocondrial requiere un método cuantitativo robusto para evaluar los cambios de heteroplasmia.
Se utiliza una amplia variedad de métodos para genotipar el ADNmt, y estos varían según la naturaleza de la mutación. Los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) son más precisos cuando se trata de cuantificar SNP en ADNmt; Sin embargo, estos métodos siguen siendo prohibitivamente caros para la cuantificación rutinaria de la heteroplasmia mitocondrial, particularmente si el número de muestras es pequeño. La secuenciación de Sanger también puede permitir la detección de SNP; Sin embargo, este enfoque no es cuantitativo y a menudo no detecta niveles bajos de heteroplasmia o puede ser inexacto al estimar heteroplasmias altas. La pirosecuenciación, como un ensayo que implica una preparación mínima y permite la cuantificación rápida de la heteroplasmia para cualquier muestra de ADNmt, se propone como un compromiso adecuado entre estos dos extremos. Este método ha sido utilizado rutinariamente para cuantificar SNPs mitocondriales por numerosos investigadores en diversos contextos, incluyendo análisis forenses 14,15, diagnóstico clínico16, o el genotipado de ADNmt a partir de células individuales17.
Este ensayo implica un primer paso de preamplificación por PCR de una región que flanquea el SNP en el ADNmt, que es seguido por un ensayo de secuenciación por síntesis utilizando una hebra del amplicón generado previamente. Uno de los dos cebadores utilizados en la etapa de preamplificación debe ser biotinilado en el extremo 5′, lo que permitirá que el aparato de pirosecuenciación aísle la cadena única de ADN que se utilizará como plantilla para la reacción de secuenciación. Luego se recocece un tercer cebador de secuenciación en la hebra biotinilada retenida, lo que permite la síntesis de ADN naciente como desoxinucleótidos que se dispensan en un orden predefinido en la cámara de reacción. El pirosecuenciador registra la cantidad de cada base incorporada en base a una lectura luminiscente, permitiendo la cuantificación relativa de alelos mitocondriales mutantes y de tipo salvaje sobre la síntesis de ADN (Figura 1B). La luminiscencia es generada por una enzima luciferasa, que emite luz en presencia de ATP que una ATP sulfurilasa sintetiza de novo en cada evento de incorporación a partir de los pirofosfatos liberados por cada nucleótido. Estas dos reacciones se pueden resumir de la siguiente manera:
1. PPi (de incorporación de nucleótidos) + APS → ATP + sulfato (ATP sulfurilasa)
2. ATP + luciferina +O2 → AMP + PPi + oxiluciferina + CO2 + luz (luciferasa)
La detección de bases de adenina por el pirosecuenciador sin reacción cruzada de ATP con la luciferasa en la segunda reacción es un desafío. Sin embargo, esto se resuelve mediante el uso de un análogo de adenina para la síntesis de ADN, a saber, dATPαS. A pesar de no ser un sustrato perfecto para la luciferasa, produce una luminiscencia más fuerte en comparación con los otros tres nucleótidos, que se ajusta digitalmente mediante el pirosecuenciador y se establece en un factor de 0,9. Debido a esta variabilidad inherente, se sugiere evitar la secuenciación de adenina en la posición SNP (ver la discusión para más detalles).
El siguiente protocolo detalla el método de evaluación de heteroplasmia de ADNmt mediante pirosecuenciación y describe las precauciones necesarias en el diseño de los cebadores de amplificación para evitar sesgos biológicos o técnicos al genotipar SNP en ADNmt. Este último implica inspeccionar digitalmente y seleccionar los conjuntos de cebadores, optimizar la PCR de preamplificación y, finalmente, secuenciar y refinar el ensayo. Se demuestran dos ensayos de ejemplo aplicados: primero, la optimización de la variante patógena humana más común m.3243A>G18, y segundo, el genotipado de células de fibroblastos embrionarios (MEF) de ratón que han sufrido un cambio de heteroplasmia utilizando tecnologías desarrolladas en el laboratorio Minczuk en Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un aspecto crítico para el éxito del protocolo es evitar contaminaciones, particularmente cuando se utilizan bajas cantidades de material de partida. Se recomienda utilizar una campana UV y puntas de pipeta filtradas al preparar las muestras siempre que sea posible, así como mantener separadas las áreas de preamplificación y postamplificación. Siempre deben incluirse mediciones en blanco y muestras de heteroplasmia conocida (como ADN de tipo salvaje) para ser utilizadas como puntos de referencia para verificar el s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Silvia Marchet y Constanza Lamperti (Istituto Neurologico “Carlo Besta”, Fondazione IRCCS, Milán) por preparar y proporcionar las células cíbridas m.3243A>G utilizadas como ejemplos ilustrativos para este protocolo. También nos gustaría agradecer a los miembros del Grupo de Genética Mitocondrial (MRC-MBU, Universidad de Cambridge) por su útil discusión durante el curso de esta investigación. Este trabajo fue apoyado por fondos básicos del Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (MC_UU_00015/4 y MC_UU_00028/3). P.A.N. y P.S.-P. cuentan además con el apoyo de The Lily Foundation y The Champ Foundation, respectivamente.
Materials
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
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