Polimorfismi genotidici a singolo nucleotide nel genoma mitocondriale mediante pirosequenziamento

Summary

I saggi di pirosequenziamento consentono la genotipizzazione robusta e rapida dei polimorfismi a singolo nucleotide del DNA mitocondriale in cellule o tessuti eteroplasmatici.

Abstract

Le mutazioni nel genoma mitocondriale (mtDNA) sono state associate a malattie genetiche ereditarie materne. Tuttavia, l’interesse per i polimorfismi del mtDNA è aumentato negli ultimi anni a causa della capacità recentemente sviluppata di produrre modelli mediante mutagenesi del mtDNA e di un nuovo apprezzamento dell’associazione tra aberrazioni genetiche mitocondriali e malattie comuni legate all’età come cancro, diabete e demenza. Il pirosequenziamento è una tecnica di sequenziamento per sintesi ampiamente impiegata in tutto il campo mitocondriale per esperimenti di genotipizzazione di routine. La sua relativa convenienza rispetto ai metodi di sequenziamento parallelo massiccio e la facilità di implementazione ne fanno una tecnica inestimabile nel campo della genetica mitocondriale, consentendo la rapida quantificazione dell’eteroplasmia con maggiore flessibilità. Nonostante la praticità di questo metodo, la sua implementazione come mezzo di genotipizzazione del mtDNA richiede l’osservanza di alcune linee guida, in particolare per evitare determinati pregiudizi di origine biologica o tecnica. Questo protocollo delinea i passaggi e le precauzioni necessarie nella progettazione e nell’implementazione di saggi di pirosequenziamento da utilizzare nel contesto della misurazione dell’eteroplasmia.

Introduction

Il genoma mitocondriale esiste sotto forma di piccole (16,5 kb) molecole circolari (mtDNA) presenti nel compartimento più interno dei mitocondri chiamato matrice e codifica 13 subunità della catena respiratoria mitocondriale, nonché i tRNA e gli rRNA necessari per la loro traduzione in situ dal ribosoma mitocondriale¹. Questo genoma rappresenta circa l’1% di tutte le proteine necessarie per la funzione mitocondriale, il resto delle quali sono codificate dal DNA nucleare (nDNA). Si presume comunemente che i mitocondri derivino da un evento di fusione endosimbiotica tra un antenato alfa-proteobatterico e una cellula eucariotica ancestrale. Una volta avvenuta questa ipotetica simbiosi, l’informazione genetica dei mitocondri è stata gradualmente trasferita al nucleo nel corso di eoni, il che spiega la suddetta compattezza del mtDNA rispetto ai genomi dei moderni cianobatteri². Tale trasferimento di geni è fortemente evidenziato dall’esistenza di lunghi tratti di nDNA che sono altamente omologhi alle sequenze trovate nel mtDNA. Queste sequenze mitocondriali nucleari (NUMT) sono una fonte comune di interpretazione errata durante la genotipizzazione e devono essere prese alcune precauzioni per evitare distorsioni nucleari durante la genotipizzazione del mtDNA³ (Figura 1A).

Un’altra caratteristica distintiva del mtDNA è che il suo numero di copie varia a seconda del tipo di cellula, numerando ovunque da decine a migliaia di copie per cellula⁴. A causa di questa natura multi-copia, il mtDNA può ospitare una vasta gamma di genotipi all’interno di una singola cellula, il che può comportare una distribuzione più continua degli alleli in contrasto con gli alleli discreti associati ai geni nucleari quando si considera la zigosità dei cromosomi. Questa eterogeneità degli alleli mitocondriali è indicata come eteroplasmia mitocondriale, che è tipicamente espressa nella prevalenza percentuale di una data mutazione in proporzione al mtDNA totale in una data cellula. L’eteroplasmia può essere contrastata con l’omoplasia, che si riferisce a una specie unica di mtDNA presente in una cellula.

La misurazione dell’eteroplasmia mitocondriale è di particolare interesse quando si quantifica la proporzione di molecole di mtDNA che ospitano varianti patogene. Tali varianti si presentano sotto forma di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), piccoli indel, o delezioni su larga scala⁵. La maggior parte degli esseri umani sono eteroplasmatici per le varianti patogene; tuttavia, non presentano alcun fenotipo clinico, che spesso si manifesta solo a livelli più elevati di eteroplasmia di mtDNA patogeno in un fenomeno indicato come effetto soglia⁶. Mentre i valori associati alla patogenicità dipendono fortemente dalla natura della mutazione patogena e dal tessuto in cui si verifica, in genere si trovano al di sopra del 60% di eteroplasmia⁷.

Ci sono diverse aree di ricerca in cui la genotipizzazione mitocondriale è comune. In campo medico, il test o la quantificazione delle mutazioni del mtDNA può servire come criterio diagnostico per le malattie mitocondriali, molte delle quali hanno aberrazioni del mtDNA come origine⁵. Oltre allo studio delle mutazioni patogene umane, è probabile che aumenti la prevalenza di modelli animali che ospitano SNP patogeni nel mtDNA, dato il recente avvento dell’editing della base mitocondriale abilitato dagli editor di base citosina derivati da DddA mitocondriali (DdCBE)⁸ e dalle deaminasi a base di TALE (TALEDs) per l’editing della base adenina⁹. Questo approccio sarà strumentale per comprendere l’interazione tra genotipi mitocondriali aberranti e le disfunzioni risultanti. C’è anche una ricerca scientifica in corso sul rimodellamento del genoma mitocondriale per l’uso finale come strategia terapeutica nelle malattie mitocondriali umane attraverso un approccio noto come spostamento dell’eteroplasmia. Questo campo di ricerca riguarda principalmente l’indirizzamento di nucleasi specifiche per mutazione alla matrice mitocondriale; ciò si traduce nella degradazione preferenziale del mtDNA patogeno, portando a salvataggi nel fenotipo^10,11,12,13. Qualsiasi esperimento che coinvolga il rimodellamento del genotipo mitocondriale richiede un robusto metodo quantitativo per valutare i cambiamenti dell’eteroplasmia.

Un’ampia varietà di metodi sono usati per genotipizzare il mtDNA, e questi variano a seconda della natura della mutazione. I metodi di sequenziamento di nuova generazione (NGS) sono più precisi quando si tratta di quantificare gli SNP nel mtDNA; Tuttavia, questi metodi rimangono proibitivamente costosi per la quantificazione di routine dell’eteroplasmia mitocondriale, in particolare se il numero di campioni è piccolo. Il sequenziamento con metodo Sanger può anche consentire il rilevamento di SNP; Tuttavia, questo approccio non è quantitativo e spesso non riesce a rilevare bassi livelli di eteroplasmia o può essere impreciso quando si stimano eteroplasmie elevate. Il pirosequenziamento, come saggio che comporta una preparazione minima e consente la rapida quantificazione dell’eteroplasmia per qualsiasi campione di mtDNA, si propone come un compromesso appropriato tra questi due estremi. Questo metodo è stato utilizzato di routine per quantificare SNP mitocondriali da numerosi ricercatori in vari contesti, tra cui l’analisi forense 14,15^, la diagnosi clinica¹⁶ o la genotipizzazione del mtDNA da singole cellule¹⁷.

Questo test prevede una prima fase di preamplificazione della PCR di una regione che fiancheggia l’SNP nel mtDNA, seguita da un test di sequenziamento per sintesi utilizzando un filamento dell’amplicone precedentemente generato. Uno dei due primer utilizzati nella fase di preamplificazione deve essere biotinilato all’estremità 5′, il che consentirà all’apparato di pirosequenziamento di isolare il singolo filamento di DNA da utilizzare come modello per la reazione di sequenziamento. Un terzo primer di sequenziamento viene quindi ricotto sul filamento biotinilato trattenuto, che consente di distribuire la sintesi del DNA nascente come desossinucleotidi in un ordine predefinito nella camera di reazione. Il pirosequenziatore registra la quantità di ciascuna base incorporata sulla base di una lettura luminescente, consentendo la quantificazione relativa degli alleli mitocondriali mutanti e wild-type sulla sintesi del DNA (Figura 1B). La luminescenza è generata da un enzima luciferasi, che emette luce in presenza di ATP che una ATP solforilasi sintetizza de novo ad ogni evento di incorporazione dai pirofosfati rilasciati da ciascun nucleotide. Queste due reazioni possono essere riassunte come segue:

1. PP_{i (dall’incorporazione} nucleotidica) + APS → ATP + solfato (ATP sulfurilasi)

2. ATP + luciferina + O 2 → AMP + PP_i + ossiluciferina + CO₂ + luce (luciferasi)

Rilevare le basi di adenina dal pirosequenziatore senza che l’ATP reagisca in modo incrociato con la luciferasi nella seconda reazione è una sfida. Tuttavia, questo è risolto utilizzando un analogo dell’adenina per la sintesi del DNA, vale a dire dATPαS. Nonostante non sia un substrato perfetto per la luciferasi, produce una luminescenza più forte rispetto agli altri tre nucleotidi, che viene regolata digitalmente dal pirosequenziatore e impostata su un fattore di 0,9. A causa di questa variabilità intrinseca, si suggerisce di evitare il sequenziamento dell’adenina nella posizione SNP (vedere la discussione per ulteriori dettagli).

Il seguente protocollo descrive in dettaglio il metodo di valutazione dell’eteroplasmia del mtDNA mediante pirosequenziamento e delinea le precauzioni necessarie nella progettazione dei primer di amplificazione per evitare pregiudizi biologici o tecnici durante la genotipizzazione degli SNP nel mtDNA. Quest’ultimo comporta il rilevamento digitale e la selezione dei set di primer, l’ottimizzazione della PCR di preamplificazione e, infine, il sequenziamento e il perfezionamento del test. Vengono dimostrati due saggi di esempio applicati: in primo luogo, l’ottimizzazione della più comune variante patogena umana m.3243A>G¹⁸ e, in secondo luogo, la genotipizzazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo (MEF) che hanno subito lo spostamento dell’eteroplasmia utilizzando tecnologie sviluppate presso il laboratorio Minczuk di Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.

Protocol

È stato fornito il consenso informato per l’uso delle cellule cibridi umane 3243A>G e dei MEF m.5024C>T immortalizzati utilizzati in questo studio. L’approvazione etica non era richiesta in questo caso poiché le cellule del paziente non sono state raccolte presso l’Università di Cambridge. L’uso di fibroblasti umani può, tuttavia, richiedere l’approvazione etica. Si raccomanda vivamente di seguire le migliori pratiche per la configurazione della PCR durante la preparazione del DNA campione per il pirosequenziamento. …

Representative Results

Questa sezione presenta un esempio di ottimizzazione di un saggio di pirosequenziamento per una mutazione patogena del mtDNA umano, nonché i dati di sequenziamento dalla genotipizzazione di fibroblasti embrionali di topo (MEF) eteroplasmatici (m.5024C>T) trattati con nucleasi mitocondriali a dita di zinco (mtZFN). L’ottimizzazione del test per le cellule umane e il confronto di due diversi saggi dimostra come selezionare quello più accurato, mentre la genotipizzazione delle cellule MEF geneticamente modificate nel seco…

Discussion

Un aspetto critico per il successo del protocollo è evitare contaminazioni, in particolare quando si utilizzano basse quantità di materiale di partenza. Si consiglia di utilizzare una cappa UV e punte di pipette filtrate durante la preparazione dei campioni, ove possibile, nonché di mantenere separate le aree di preamplificazione e post-amplificazione. Le misurazioni in bianco e i campioni di eteroplasmia nota (come il DNA wild-type) dovrebbero sempre essere inclusi da utilizzare come parametri di riferimento per veri…

Materials

KOD Hot Start DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	71086
PyroMark Assay Design 2.0	QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips	QIAGEN	974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)	QIAGEN	974022
Pyromark Q48 Autoprep	QIAGEN	9002470
PyroMark Q48 Cartridge Set	QIAGEN	9024321
Pyromark Q48 Disks	QIAGEN	974901
Pyromark Q48 Magnetic beads	QIAGEN	974203
PyroMark Q48 Software License (1)	QIAGEN	9024325