Genotypering van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen in het mitochondriale genoom door pyrosequencing

Summary

Pyrosequencing assays maken de robuuste en snelle genotypering van mitochondriaal DNA single nucleotide polymorfismen in heteroplasmatische cellen of weefsels mogelijk.

Abstract

Mutaties in het mitochondriale genoom (mtDNA) zijn in verband gebracht met maternaal overgeërfde genetische ziekten. De belangstelling voor mtDNA-polymorfismen is de afgelopen jaren echter toegenomen vanwege het recent ontwikkelde vermogen om modellen te produceren door mtDNA-mutagenese en een nieuwe waardering van de associatie tussen mitochondriale genetische afwijkingen en veel voorkomende leeftijdsgerelateerde ziekten zoals kanker, diabetes en dementie. Pyrosequencing is een sequencing-by-synthesis-techniek die op grote schaal wordt gebruikt in het mitochondriale veld voor routinematige genotyperingsexperimenten. De relatieve betaalbaarheid in vergelijking met massale parallelle sequencingmethoden en het gemak van implementatie maken het een onschatbare techniek op het gebied van mitochondriale genetica, waardoor de snelle kwantificering van heteroplasmie met verhoogde flexibiliteit mogelijk is. Ondanks de praktische bruikbaarheid van deze methode, vereist de implementatie ervan als een middel voor mtDNA-genotypering de observatie van bepaalde richtlijnen, met name om bepaalde vooroordelen van biologische of technische oorsprong te voorkomen. Dit protocol schetst de noodzakelijke stappen en voorzorgsmaatregelen bij het ontwerpen en implementeren van pyrosequencing assays voor gebruik in de context van heteroplasmiemeting.

Introduction

Het mitochondriale genoom bestaat in de vorm van kleine (16,5 kb) circulaire moleculen (mtDNA) aanwezig in het binnenste compartiment van de mitochondriën genaamd de matrix en codeert voor 13 subeenheden van de mitochondriale ademhalingsketen, evenals de tRNA’s en rRNA’s die nodig zijn voor hun vertaling in situ door het mitochondriale ribosoom¹. Dit genoom vertegenwoordigt ongeveer 1% van alle eiwitten die nodig zijn voor de mitochondriale functie, waarvan de rest wordt gecodeerd door het nucleaire DNA (nDNA). Algemeen wordt aangenomen dat mitochondriën zijn afgeleid van een endosymbiotische fusiegebeurtenis tussen een alfa-proteobacteriële voorouder en een voorouderlijke eukaryote cel. Zodra deze hypothetische symbiose plaatsvond, werd de genetische informatie van de mitochondriën geleidelijk overgebracht naar de kern gedurende eonen, wat de bovengenoemde compactheid van het mtDNA verklaart in vergelijking met de genomen van moderne cyanobacteriën². Een dergelijke overdracht van genen wordt het sterkst aangetoond door het bestaan van lange stukken nDNA die zeer homoloog zijn voor de sequenties in mtDNA. Deze nucleaire mitochondriale sequenties (NUT’s) zijn een veel voorkomende bron van verkeerde interpretatie tijdens genotypering en bepaalde voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om nucleaire vooroordelen te voorkomen bij het genotyperen van mtDNA³ (figuur 1A).

Een ander onderscheidend kenmerk van mtDNA is dat het aantal kopieën varieert afhankelijk van het celtype, met een aantal van tienduizenden tot duizenden kopieën per cel⁴. Vanwege deze multi-copy aard kan mtDNA een breed scala aan genotypen binnen een enkele cel herbergen, wat kan resulteren in een meer continue verdeling van allelen in tegenstelling tot de discrete allelen geassocieerd met nucleaire genen bij het overwegen van de zygositeit van chromosomen. Deze heterogeniteit van mitochondriale allelen wordt mitochondriale heteroplasmie genoemd, die meestal wordt uitgedrukt in de procentuele prevalentie van een bepaalde mutatie als een percentage van het totale mtDNA in een bepaalde cel. Heteroplasmie kan worden vergeleken met homoplasmie, wat verwijst naar een unieke soort mtDNA die in een cel aanwezig is.

Het meten van mitochondriale heteroplasmie is van bijzonder belang bij het kwantificeren van het aandeel mtDNA-moleculen dat pathogene varianten herbergt. Dergelijke varianten komen voor in de vorm van single nucleotide polymorphisms (SNP’s), kleine indebellen of grootschalige deleties⁵. De meeste mensen zijn heteroplasmatisch voor pathogene varianten; ze vertonen echter geen klinische fenotypen, die zich vaak alleen manifesteren bij hogere heteroplasmieniveaus van pathogeen mtDNA in een fenomeen dat het drempeleffect⁶ wordt genoemd. Hoewel de waarden geassocieerd met pathogeniciteit sterk afhankelijk zijn van de aard van de pathogene mutatie en het weefsel waarin deze optreedt, liggen ze meestal boven 60% heteroplasmie⁷.

Er zijn verschillende onderzoeksgebieden waarin mitochondriale genotypering veel voorkomt. Op medisch gebied kan het testen op of kwantificeren van mtDNA-mutaties dienen als een diagnostisch criterium voor mitochondriale ziekten, waarvan vele mtDNA-afwijkingen als oorsprong hebben⁵. Naast de studie van menselijke pathogene mutaties, zal de prevalentie van diermodellen met pathogene SNP’s in het mtDNA waarschijnlijk toenemen, gezien de recente komst van mitochondriale basenbewerking mogelijk gemaakt door mitochondriaal gerichte DddA-afgeleide cytosine-base editors (DdCBEs)⁸ en TALE-gebaseerde deaminasen (TALEDs) voor adenine base editing⁹. Deze benadering zal een belangrijke rol spelen bij het begrijpen van de wisselwerking tussen afwijkende mitochondriale genotypen en de resulterende disfuncties. Er is ook lopend wetenschappelijk onderzoek naar het hermodelleren van het mitochondriale genoom voor ultiem gebruik als een therapeutische strategie bij menselijke mitochondriale ziekten via een benadering die bekend staat als heteroplasmieverschuiving. Dit onderzoeksgebied omvat voornamelijk het richten van mutatiespecifieke nucleasen op de mitochondriale matrix; dit resulteert in de preferentiële afbraak van pathogeen mtDNA, wat leidt tot reddingen in fenotype^10,11,12,13. Alle experimenten met betrekking tot de remodellering van het mitochondriale genotype vereisen een robuuste kwantitatieve methode om heteroplasmieverschuivingen te beoordelen.

Een breed scala aan methoden wordt gebruikt om mtDNA te genotyperen, en deze variëren afhankelijk van de aard van de mutatie. Next-generation sequencing (NGS) methoden zijn nauwkeuriger als het gaat om het kwantificeren van SNP’s in mtDNA; Deze methoden blijven echter onbetaalbaar voor de routinematige kwantificering van mitochondriale heteroplasmie, vooral als het aantal monsters klein is. Sanger-sequencing kan ook de detectie van SNP’s mogelijk maken; Deze benadering is echter niet kwantitatief en slaagt er vaak niet in om lage niveaus van heteroplasmie te detecteren of kan onnauwkeurig zijn bij het schatten van hoge heteroplasmieën. Pyrosequencing, als een test die minimale voorbereiding vereist en de snelle kwantificering van heteroplasmie voor elk mtDNA-monster mogelijk maakt, wordt voorgesteld als een geschikt compromis tussen deze twee uitersten. Deze methode is routinematig gebruikt om mitochondriale SNP’s te kwantificeren door tal van onderzoekers in verschillende contexten, waaronder forensische analyse 14,15^, klinische diagnose¹⁶ of de genotypering van mtDNA uit afzonderlijke cellen¹⁷.

Deze test omvat een eerste PCR-preamplificatiestap van een gebied dat de SNP in het mtDNA flankeert, gevolgd door een sequencing-by-synthesis assay met behulp van één streng van het eerder gegenereerde amplicon. Een van de twee primers die in de voorversterkerstap worden gebruikt, moet aan het 5′-uiteinde worden gebiotinyleerd, waardoor het pyrosequencing-apparaat de enkele DNA-streng kan isoleren om als sjabloon voor de sequencingreactie te worden gebruikt. Een derde sequencing primer wordt vervolgens uitgegloeid op de vastgehouden gebiotinyleerde streng, waardoor ontluikende DNA-synthese als deoxynucleotiden in een vooraf gedefinieerde volgorde in de reactiekamer kan worden gedoseerd. De pyrosequencer registreert de hoeveelheid van elke opgenomen base op basis van een luminescerende uitlezing, waardoor de relatieve kwantificering van mutante en wild-type mitochondriale allelen bij DNA-synthese mogelijk is (figuur 1B). De luminescentie wordt gegenereerd door een luciferase-enzym, dat licht uitzendt in aanwezigheid van ATP dat een ATP-zwavelylase de novo synthetiseert bij elke incorporatiegebeurtenis van de pyrofosfaten die door elk nucleotide worden vrijgegeven. Deze twee reacties kunnen als volgt worden samengevat:

1. PP_i (van nucleotide-incorporatie) + APS → ATP + sulfaat (ATP-zwavelylase)

2. ATP + luciferine + O 2 → AMP + PP_i + oxyluciferine + CO₂ + licht (luciferase)

Het detecteren van adeninebasen door de pyrosequencer zonder ATP-kruisreactie met de luciferase in de tweede reactie is een uitdaging. Dit wordt echter opgelost door een adenine-analoog te gebruiken voor DNA-synthese, namelijk dATPαS. Ondanks dat het geen perfect substraat is voor luciferase, produceert het een sterkere luminescentie in vergelijking met de drie andere nucleotiden, die digitaal wordt aangepast door de pyrosequencer en ingesteld op een factor 0,9. Vanwege deze inherente variabiliteit wordt voorgesteld om sequencing adenine op de SNP-positie te vermijden (zie de discussie voor meer informatie).

Het volgende protocol beschrijft de methode van mtDNA-heteroplasmiebeoordeling door pyrosequencing en schetst de nodige voorzorgsmaatregelen bij het ontwerpen van de amplificatieprimers om biologische of technische vertekening te voorkomen bij het genotyperen van SNP’s in mtDNA. Dit laatste omvat het digitaal inmeten en selecteren van de primersets, het optimaliseren van de pcr voor voorversterking en ten slotte het sequencen en verfijnen van de test. Twee toegepaste voorbeeldtests worden gedemonstreerd: ten eerste, de optimalisatie van de meest voorkomende menselijke pathogene variant m.3243A>G¹⁸, en ten tweede, de genotypering van muis embryonale fibroblast (MEF) cellen die heteroplasmieverschuiving hebben ondergaan met behulp van technologieën ontwikkeld in het Minczuk-laboratorium in Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.

Protocol

Geïnformeerde toestemming werd gegeven voor het gebruik van de menselijke 3243A>G cybride cellen en de onsterfelijke m.5024C>T MEF’s die in deze studie werden gebruikt. Ethische goedkeuring was in dit geval niet vereist, omdat de cellen van de patiënt niet werden verzameld aan de Universiteit van Cambridge. Het gebruik van menselijke fibroblasten kan echter ethische goedkeuring vereisen. Het wordt ten zeerste aanbevolen om de beste praktijken voor PCR-instellingen te volgen bij het voorbereiden van het monster-DNA voor…

Representative Results

Deze sectie presenteert een voorbeeld van optimalisatie van een pyrosequencing assay voor een humane pathogene mtDNA mutatie, evenals sequencing data van de genotypering van heteroplasmatische (m.5024C>T) muis embryonale fibroblasten (MEF’s) behandeld met mitochondriale zinkvinger nucleasen (mtZFN’s). Het optimaliseren van de test voor menselijke cellen en het vergelijken van twee verschillende assays laat zien hoe de meest nauwkeurige kan worden geselecteerd, terwijl genotypering van genetisch gemodificeerde MEF-cellen …

Discussion

Een cruciaal aspect voor het succes van het protocol is het vermijden van verontreinigingen, vooral bij het gebruik van lage hoeveelheden uitgangsmateriaal. Het wordt aanbevolen om waar mogelijk een UV-kap en gefilterde pipetpunten te gebruiken bij het voorbereiden van de monsters, en om de voorversterkings- en naversterkingsgebieden gescheiden te houden. Blancometingen en monsters van bekende heteroplasmie (zoals wild-type DNA) moeten altijd worden opgenomen om te worden gebruikt als benchmarks om te controleren op tech…

Materials

KOD Hot Start DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	71086
PyroMark Assay Design 2.0	QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips	QIAGEN	974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)	QIAGEN	974022
Pyromark Q48 Autoprep	QIAGEN	9002470
PyroMark Q48 Cartridge Set	QIAGEN	9024321
Pyromark Q48 Disks	QIAGEN	974901
Pyromark Q48 Magnetic beads	QIAGEN	974203
PyroMark Q48 Software License (1)	QIAGEN	9024325