パイロシークエンシングによるミトコンドリアゲノムの一塩基多型のジェノタイピング
Summary
パイロシーケンシングアッセイは、ヘテロプラズマ細胞または組織におけるミトコンドリアDNA一塩基多型の堅牢かつ迅速なジェノタイピングを可能にします。
Abstract
ミトコンドリアゲノム(mtDNA)の変異は、母性遺伝性の遺伝病と関連しています。しかし、近年、mtDNA変異誘発によるモデル作製能力が発達し、ミトコンドリアの遺伝子異常とがん、糖尿病、認知症などの一般的な加齢性疾患との関連が新たに認識されたため、mtDNA多型への関心が高まっています。パイロシーケンシングは、日常的なジェノタイピング実験のためにミトコンドリア分野全体で広く採用されている合成によるシーケンシング技術です。大規模な並列シーケンシング法と比較した場合の比較的手頃な価格と実装の容易さにより、ミトコンドリア遺伝学の分野で非常に貴重な技術となり、柔軟性を高めたヘテロプラスミーの迅速な定量が可能になります。この方法の実用性にもかかわらず、mtDNAジェノタイピングの手段としてのその実施は、特に生物学的または技術的起源の特定のバイアスを回避するために、特定のガイドラインの観察を必要とする。このプロトコルは、ヘテロプラスミー測定のコンテキストで使用するためのパイロシークエンシングアッセイを設計および実装する際に必要な手順と注意事項を概説します。
Introduction
ミトコンドリアゲノムは、マトリックスと呼ばれるミトコンドリアの最も内側のコンパートメントに存在する小さな(16.5kb)環状分子(mtDNA)の形で存在し、ミトコンドリア呼吸鎖の13のサブユニット、およびミトコンドリアリボソーム1によるその場での翻訳に必要なtRNAおよびrRNAをコードします。このゲノムは、ミトコンドリアの機能に必要なすべてのタンパク質の約1%を占め、残りは核DNA(nDNA)によってコードされています。ミトコンドリアは、アルファプロテオバクテリアの祖先と祖先の真核細胞との間の内部共生融合イベントに由来すると一般に考えられています。この仮説的な共生が起こると、ミトコンドリアの遺伝情報は長い年月をかけて徐々に核に移され、現代のシアノバクテリアのゲノムと比較した場合のmtDNAの前述のコンパクトさを説明しています2。このような遺伝子の伝達は、mtDNAに見られる配列と非常に相同なnDNAの長いストレッチの存在によって最も強く証明されます。これらの核ミトコンドリア配列(NMT)は、ジェノタイピング中の誤解の一般的な原因であり、mtDNA3をジェノタイピングする際に核バイアスを回避するために特定の予防措置を講じる必要があります(図1A)。
mtDNAのもう一つの特徴は、そのコピー数が細胞の種類によって異なり、細胞あたり数万コピーから数千のコピー数であることです4。このマルチコピーの性質により、mtDNAは単一細胞内に幅広い遺伝子型を保持することができ、染色体の接合性を考慮すると、核遺伝子に関連する個別の対立遺伝子とは対照的に、対立遺伝子のより連続的な分布をもたらす可能性があります。ミトコンドリア対立遺伝子のこの不均一性はミトコンドリアヘテロプラスミーと呼ばれ、通常、特定の細胞内の全mtDNAの割合としての特定の突然変異の有病率で表されます。ヘテロプラスミーは、細胞全体に存在するmtDNAのユニークな種を指すホモプラスミーとは対照的です。
ミトコンドリアヘテロプラスミーの測定は、病原性多様体を有するmtDNA分子の割合を定量する際に特に興味深い。このような変異体は、一塩基多型(SNP)、小さなインデル、または大規模な欠失の形で提供されます5。ほとんどの人間は病原性多様体に対して異質です。しかし、それらは臨床表現型を示さず、閾値効果6と呼ばれる現象において病原性mtDNAのより高いヘテロプラスミーレベルでのみ現れることがよくあります。病原性に関連する値は、病原性突然変異の性質とそれが発生する組織に大きく依存しますが、通常、60%を超えるヘテロプラスミー7にあります。
ミトコンドリアのジェノタイピングが一般的であるいくつかの研究分野があります。医療分野では、mtDNA変異の検査や定量化は、mtDNA異常を起源とするミトコンドリア病の診断基準となります5。ヒト病原性変異の研究に加えて、ミトコンドリアを標的とするDddA由来シトシン塩基エディター(DdCBE)8およびアデニン塩基編集のためのTALEベースのデアミナーゼ(TARED)9によって可能になったミトコンドリア塩基編集の最近の出現を考えると、mtDNAに病原性SNPを保持する動物モデルの有病率は増加する可能性があります.このアプローチは、異常なミトコンドリア遺伝子型と結果として生じる機能障害との間の相互作用を理解するのに役立ちます。ヘテロプラスミーシフトとして知られるアプローチを介して、ヒトミトコンドリア疾患の治療戦略として最終的に使用するためにミトコンドリアゲノムをリモデリングすることに関する科学的研究も進行中です。この研究分野は、主に突然変異特異的ヌクレアーゼをミトコンドリアマトリックスに向けることを含みます。これは病原性mtDNAの優先的な分解をもたらし、表現型10、11、12、13における救済をもたらす。ミトコンドリア遺伝子型のリモデリングを含む実験には、ヘテロプラスミーシフトを評価するための堅牢な定量的方法が必要です。
mtDNAの遺伝子形成にはさまざまな方法が使用されており、これらは突然変異の性質によって異なります。次世代シーケンシング(NGS)法は、mtDNA中のSNPの定量に関してはより正確です。しかしながら、これらの方法は、特にサンプル数が少ない場合、ミトコンドリアヘテロプラスミーの日常的な定量には法外に高価である。サンガーシーケンシングは、SNPの検出も可能にします。ただし、このアプローチは定量的ではなく、低レベルのヘテロプラスミーを検出できないか、高ヘテロプラスミーを推定するときに不正確になる可能性があります。パイロシーケンシングは、最小限の調製で、あらゆるmtDNAサンプルのヘテロプラスミーの迅速な定量を可能にするアッセイとして、これら2つの両極端の間の適切な妥協点として提案されています。この方法は、法医学的分析14,15、臨床診断16、または単一細胞からのmtDNAのジェノタイピング17など、さまざまな状況で多くの研究者によってミトコンドリアSNPを定量するために日常的に使用されてきました。
このアッセイでは、mtDNA中のSNPに隣接する領域の最初のPCR前増幅ステップが含まれ、その後、以前に生成されたアンプリコンの1本鎖を使用した合成によるシーケンシングアッセイが続きます。前増幅ステップで使用される2つのプライマーのうちの1つは、5’末端でビオチン化されている必要があり、これにより、パイロシーケンシング装置は、シーケンシング反応のテンプレートとして使用するDNAの一本鎖を単離することができます。次に、3番目のシーケンシングプライマーが保持されたビオチン化鎖上にアニーリングされ、デオキシヌクレオチドとしての新生DNA合成を事前定義された順序で反応チャンバーに分注することができます。パイロシーケンサーは、発光読み出しに基づいて組み込まれた各塩基の量を記録し、DNA合成時に変異型および野生型のミトコンドリア対立遺伝子の相対定量を可能にします(図1B)。発光はルシフェラーゼ酵素によって生成され、ATPの存在下で発光し、ATPスルフリラーゼは各ヌクレオチドによって放出されたピロリン酸から各取り込みイベントで de novo を合成します。これら2つの反応は次のように要約できます。
1. PPi (ヌクレオチドの取り込みから)+ APS → ATP +硫酸塩(ATPスルフリラーゼ)
2. ATP +ルシフェリン+ O 2 →AMP + PPi +オキシルシフェリン+ CO2 +光(ルシフェラーゼ)
2番目の反応でATPがルシフェラーゼと交差反応することなく、パイロシーケンサーによってアデニン塩基を検出することは課題です。しかしながら、これはDNA合成のためのアデニン類似体、すなわちdATPαSを使用することによって解決される。ルシフェラーゼの完全な基質ではありませんが、パイロシーケンサーによってデジタル調整され、0.9の係数に設定される他の3つのヌクレオチドと比較して、より強い発光を生成します。この固有の変動性のために、SNP位置でのアデニンの配列決定を避けることが示唆されている(詳細については議論を参照)。
以下のプロトコルは、パイロシーケンシングによるmtDNAヘテロプラスミー評価の方法を詳述し、mtDNA中のSNPをジェノタイピングする際の生物学的または技術的バイアスを回避するために増幅プライマーを設計する際に必要な予防措置を概説します。後者では、プライマーセットのデジタル調査と選択、前増幅PCRの最適化、そして最後にアッセイのシーケンシングと精製が行われます。2つの応用例のアッセイが実証されています:第一に、最も一般的なヒト病原性多様体m.3243A>G18の最適化、第二に、ケンブリッジのMinczuk研究所で開発された技術を使用してヘテロプラスミーシフトを受けたマウス胚性線維芽細胞(MEF)細胞のジェノタイピング10,11,12,19,20,21,22。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルの成功のための重要な側面は、特に少量の出発物質を使用する場合に、汚染を回避することです。サンプルを調製する際には、可能な限りUVフードとフィルター付きピペットチップを使用し、プリアンプとポストアンプの領域を分離することをお勧めします。ブランク測定値および既知のヘテロプラスミー(野生型DNAなど)のサンプルは、技術的または生物学的バイアスをチェックす…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルの実例として使用されるm.3243A>Gサイブリッド細胞を調製および提供してくれたSilvia MarchetとConstanza Lamperti(Istituto Neurologico “Carlo Besta”、Fondazione IRCCS、ミラノ)に感謝します。また、ミトコンドリア遺伝学グループ(MRC-MBU、ケンブリッジ大学)のメンバーに、この研究の過程で有益な議論をしていただき、感謝したいと思います。この研究は、英国医学研究評議会(MC_UU_00015/4およびMC_UU_00028/3)からのコア資金によってサポートされました。P.A.N. および P.S.-P.さらに、それぞれリリー財団とチャンプ財団によってサポートされています。
Materials
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
- Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
- Chinnery, P. F., Hudson, G. Mitochondrial genetics. British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).
- Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
- Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
- Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Recent advances in mitochondrial disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).
- Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
- Cho, S. -. I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
- Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
- Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
- Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
- Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
- Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
- Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
- Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
- Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
- El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
- Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
- Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
- Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
- Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
- Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
- Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
- Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
- Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).
