Summary
Detta protokoll beskriver i detalj hur man bygger ett fluorescensmikroskop med ett enda objektiv och dess användning för att visualisera cytoskelettnätverk.
Abstract
Rekonstituerade cytoskelettkompositer har visat sig vara ett värdefullt modellsystem för att studera mjuk materia som inte är i jämvikt. Den verklighetstrogna avbildningen av dynamiken i dessa 3D-täta nätverk kräver optisk snittning, som ofta förknippas med fluorescenskonfokalmikroskop. Den senaste utvecklingen inom fluorescensmikroskopi (LSFM) har dock etablerat det som ett kostnadseffektivt och ibland överlägset alternativ. För att göra LSFM tillgängligt för cytoskelettforskare som är mindre bekanta med optik presenterar vi en steg-för-steg-guide för nybörjare för att bygga ett mångsidigt fluorescensmikroskop av standardkomponenter. För att möjliggöra provmontering med traditionella objektsglasprover följer denna LSFM SOLS-designen (single-objective light-sheet), som använder ett enda objektiv för både excitations- och emissionsinsamlingen. Vi beskriver funktionen för varje komponent i SOLS tillräckligt detaljerat för att läsarna ska kunna modifiera instrumenteringen och designa den för att passa deras specifika behov. Slutligen demonstrerar vi användningen av detta anpassade SOLS-instrument genom att visualisera astrar i kinesindrivna mikrotubulinätverk.
Introduction
Fluorescensmikroskopi (LSFM) är en familj av högupplösande fluorescensavbildningstekniker där excitationsljuset formas till ett ark 1,2, inklusive selektiv planbelysningsmikroskopi (SPIM), svept konfokalt inriktad plan excitation (SCAPE) och snedplanmikroskopi (OPM)3,4,5,6,7. Till skillnad från andra mikroskopimodaliteter som epi-fluorescens, total intern reflektionsfluorescensmikroskopi (TIRFM) eller konfokalmikroskopi, är fototoxiciteten minimal i LSFM och prover kan avbildas över längre tidsskalor eftersom endast planet för provet som avbildas aktivt belyses 8,9,10. Därför är LSFM-tekniker extremt användbara för att avbilda 3D-prover under längre tidsperioder, särskilt de som är för tjocka för konfokalmikroskopitekniker. På grund av dessa skäl har LSFM sedan sin ursprungliga utveckling 2004 blivit den avbildningsteknik som många fysiologer, utvecklingsbiologer och neuroforskare väljer för visualisering av hela organismer som levande zebrafiskar och Drosophila-embryon 3,4,6,11 . Under de senaste två decennierna har fördelarna med LSFM utnyttjats för att visualisera struktur och dynamik på progressivt mindre skalor, inklusive vävnad11,12, cellulär och subcellulär skala, både in vivo och in vitro13,14,15,17.
Trots rapporterna om framgångsrika användningsfall i litteraturen förhindrar den höga kostnaden för kommersiella LSFM-system (~0,25 miljoner USD i skrivande stund)18,19 en utbredd användning av tekniken. För att göra DIY-byggen till ett genomförbart alternativ för forskare har flera byggguider publicerats 8,13,20,21, inklusive open access-satsningen OpenSPIM 22. Hittills har dock forskare med minimal erfarenhet av optik endast kunnat använda tidigare LSFM-konstruktioner, som är inkompatibla med traditionella diabildsmonterade prover (figur 1A). I den senaste implementeringen av SOLS (single-objective light-sheet) används ett enda mål för både excitation och detektion (figur 1C), vilket övervinner begränsningen relaterad till kompatibilitet 5,6,8,13,20. Kostnaden för mångsidigheten i SOLS-designen är dock en betydande ökning av konstruktionens komplexitet på grund av kravet på ytterligare två objektiv för att vidarebefordra, luta och avbilda objektplanet på kameran för avbildning (figur 1D). För att underlätta åtkomsten till de komplexa SOLS-liknande uppställningarna presenterar detta dokument steg-för-steg-guide om design, konstruktion, inriktningsprocess och användning av ett glidkompatibelt SOLS-system, vilket skulle vara användbart för forskare med kunskap om endast en nybörjarkurs i optik.
Även om själva protokollet är kortfattat måste läsarna hänvisa till andra resurser under förberedelsestegen för att lära sig mer om särskilda delar av designen eller maskinvaruöverväganden. Men om en läsare har för avsikt att följa specifikationerna för denna design, kanske det inte är nödvändigt att förstå hur man väljer vissa optiska komponenter.
Figur 1: Egenskaper hos olika LSFM-konfigurationer. (A) Uppställningen med två ortogonala mål som är vanliga i tidiga LSFM-konstruktioner. I denna konfiguration används ett kapillärrör eller en cylinder av gel för att innesluta provet, vilket inte är kompatibelt med traditionella glidmonteringstekniker. B) En schematisk bild av en SOLS-konstruktion av lätta plåtar som visar följande: C) Det enda objektiv som används för både excitations- och emissionsinsamlingen vid provplanet (O1). detta gör att en traditionell rutschkana kan monteras ovanpå, och (D) relämålsystemet i SOLS-emissionsvägen. O2 samlar in emissionsljuset och avmagiserar bilden. O3 avbildar planet i rätt lutningsvinkel på kamerasensorn. Förkortningar: LSFM = light-sheet fluorescensmikroskopi; SOLS = ljusark med ett enda objektiv; O1-O3 = mål. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Protocol
1. Förberedelse för anpassning
- Innan du påbörjar bygget, utför alla nödvändiga litteraturgenomgångar för att få en klar uppfattning om det avsedda användningsfallet (t.ex. de fluoroforer som ska avbildas, den nödvändiga bildvolymen, upplösningskraven). Se särskilt avsnittet om representativa resultat nedan för att avgöra om det är lämpligt att följa den exakta designen som beskrivs här. Om så är fallet går du vidare till steg 1.2. Om inte, hitta förslag och vägledning för val av hårdvara på Sheunglab SOLS Build Guide23.
OBS: Användaren kan hitta mer information om specifikationerna för just detta system i diskussionsavsnittet. - Samla alla nödvändiga optiska, optomekaniska och elektriska komponenter enligt beskrivningen i materialförteckningen. För användare som modifierar systemet, samla alla motsvarande delar.
- Bygg inriktningslasern som visas i figur 2A. Kontrollera att balken är kollimerad med hjälp av skjuvplattan.
- Bygg den dubbla justeringsburen för skivor av frostat glas som visas i figur 2B.
- Bered det fluorescerande färgbelagda testprovet.
- Skapa en mättad rhodaminfärgämneslösning genom att gradvis tillsätta 1 ml destillerat vatten till 0,2 g frystorkat pulver tills allt är upplöst. Virvel för att homogenisera.
OBS: Denna lösning är ljuskänslig. Även om det inte finns några nödvändiga försiktighetsåtgärder under beredningen, se till att lösningen förvaras på ett mörkt område efter att den har beretts.
VARNING: Använd alltid handskar och mask vid hantering av rodaminpulver. - Pipettera 10 μL på mitten av ett provglas.
- Placera ett 22 mm x 22 mm täckglas ovanpå vätskan och se till att fluorescensskiktet är så tunt som möjligt.
- Försegla med genomskinligt nagellack.
OBS: Detta sample är ljuskänsligt. För att maximera provets livslängd, se till att objektglaset förvaras i ett mörkt område när det inte används.
- Skapa en mättad rhodaminfärgämneslösning genom att gradvis tillsätta 1 ml destillerat vatten till 0,2 g frystorkat pulver tills allt är upplöst. Virvel för att homogenisera.
- Förbered 3D-pärlprovet (1 μm pärlor inbäddade i gel).
- Använd dubbelhäftande tejp för att skapa en 4-5 mm bred vertikal kanal på en provskiva med tre lager tejp på höjden.
- Placera ett 22 mm x 22 mm täckglas ovanpå tejpen i mitten av objektglaset. Tryck ordentligt på de tejpade områdena för att säkerställa en bra tätning mellan tejpen och täckglaset.
- Använd ett rakblad för att ta bort överflödig tejp.
- Bered 125 ml mättad gellangummilösning genom att gradvis tillsätta DI-vatten till 1 g gellangummipulver. Denna lösning kommer att vara fast vid rumstemperatur och flytande vid 65 °C.
- Tillsätt 1 ml gellangummilösning i ett mikrocentrifugrör. Värm en behållare med vatten på en värmeplatta vid 65 °C och värm mikrocentrifugröret tills gellangummit är synligt trögflytande.
- Bered 10 μL av en 1:1 000 utspädning av pärlor i uppvärmd gellangummilösning.
- Pipettera försiktigt lösningen i kammaren tills den är full. Använd en tandpetare för att dutta en liten mängd epoxi på båda sidor av kanalen, täck öppningarna helt för att täta. För att säkerställa korrekt tätning, inspektera båda ändarna visuellt för att säkerställa att epoxin har trängt in något i varje ände av kanalen.
Figur 2: Foton av justeringsverktygen. (A) Kollimerad inriktningslaser. AL1: Inriktningslins 1, −50 mm; AL2: Justeringslins 2, 100 mm (B) Dubbel justeringsbur av frostat glas. Förkortningar: RMS CP = RMS gängad hållarplatta; SM1 CP = SM1 gängad korgplatta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Justera excitationsvägen
- Skissa upp mikroskopets layout på ytan av det optiska bordet. Mät alla avstånd så noggrant som möjligt.
OBS: Se figur 3 för placeringen av komponenterna i systemet. - Montera excitationslasern på bordet. Ställ in två iris på den avsedda höjden på lasern och montera dem 2-3 fot från varandra på önskad hållinje bakom platsen för spegel 1 (M1). Använd dessa iris för att säkerställa att strålen är i nivå med bordsytan och centrerad på hållinjen på det optiska bordet.
OBS: Använd laserskyddsglasögon för ögonskydd och blockera eventuella lösa laserstrålar med lasersäkerhetsskärmar som en säkerhetsåtgärd. Tills alla komponenter är permanent fastklämda är drift i storleksordningen timmar möjlig. Ställ in en iris längst bort i inriktningen i slutet av varje dag som en snabb visuell kontroll av drift när du återvänder till bygget. Vibrationer, ett felaktigt flytande optiskt bord och luftströmmar är de vanligaste orsakerna till optisk drift. - Montera laserslutaren så nära excitationslasern som möjligt. Använd denna slutare för att snabbt blockera laserljuset under inriktning, istället för att upprepade gånger slå på och stänga av lasern.
- Montera ND-filtren i ND-filterhjulet (ND 0.5, 1.0. 2.0, 3.0, 4.0 och en tom plats) och montera efter laserslutaren.
- Växla det motoriserade ställdonet till en translation stage (TS1) och sätt sedan in stage under platsen för M1. Se till att stage översätts axiellt längs samma hållinje som laserljuset följer. Ställ in scenen i mitten av dess intervall för den första placeringen.
- I följande steg 2.6-2.10, sätt in de reflekterande optiska komponenterna i strålbanan en i taget för att rikta lasern längs banan som ritas på bordet. Använd paret iris inställd på exakt höjd för att definiera önskad utgångsstrålbana och styra placeringen och inriktningen av varje reflekterande element. För varje element, justera höjden och positionen för fästet för att säkerställa att den inkommande strålen träffar mitten. Vrid sedan basen på fästet för att rikta strålen längs den utdragna strålbanan på bordet så att den passerar genom båda irisarna, och finjustera lutningen på den utgående strålen med rattarna på baksidan av varje fäste.
OBS: När varje element är inriktat på rätt höjd, lägg till en slip-on-krage på stolpen för att säkra höjden.
- I följande steg 2.6-2.10, sätt in de reflekterande optiska komponenterna i strålbanan en i taget för att rikta lasern längs banan som ritas på bordet. Använd paret iris inställd på exakt höjd för att definiera önskad utgångsstrålbana och styra placeringen och inriktningen av varje reflekterande element. För varje element, justera höjden och positionen för fästet för att säkerställa att den inkommande strålen träffar mitten. Vrid sedan basen på fästet för att rikta strålen längs den utdragna strålbanan på bordet så att den passerar genom båda irisarna, och finjustera lutningen på den utgående strålen med rattarna på baksidan av varje fäste.
- Montera och rikta in M1 ovanpå TS1.
- Montera och rikta in dikroiken på bordet.
- Följ tillverkarens instruktioner, anslut galvo till strömförsörjningen och funktionsgeneratorn.
- Montera galvoen så att lasern faller på spegelns exakta mitt. Slå på galvoen och tryck sedan på och håll ned AM-knappen på vågformsgeneratorn för att ställa in spegellutningen på 0 V DC-ström (mitten av intervallet). Rikta nu in galvoen mot irisen.
- Montera och rikta in spegel 2 (M2).
- Sätt in den stora cylindriska spegeln i det cylindriska spegelfästet. Använd 1 tums burstänger för att fästa en 30-60 mm buradapter ovanför spegel 3 (M3). Använd rattarna på spegelfästet för att platta till lutningen på M3-spegeln för den första placeringen.
- Montera den dubbla frostade glasinriktningsburen i buradaptern ovanför M3; Var noga med att dra åt ställskruvarna på buradaptern som håller inriktningsburen på plats varje gång den används för inriktning. Montera M3 på bordet och justera höjden och positionen tills strålen är ungefär centrerad på båda inriktningsskivorna av frostat glas. Clamp M3 till bordet och använd ett stolpfäste, 3 i stolpe, 90° clamp och 2 i stolpe på båda sidor av M3 för att lägga till stöd med hjälp av de tejpade hålen på vardera sidan av spegelfästet. Använd rattarna på baksidan av spegeln för att finjustera strålen.
OBS: Alla reflekterande element i excitationsvägen är nu inställda och bör inte vidröras. - Montera lins 1 (L1) på bordet. För alla initiala linsplaceringar, använd ett skruvat linsmål för att centrera den inkommande strålen på linsens framsida. Justera lutningen och sidopositionen för lins 1 (L1) tills strålen är centrerad på båda de frostade glasplattorna på inriktningsburen ovanför M3.
- Montera lins 2 (L2) i sin respektive position för att skapa ett 4f-system med L1. Flytta L2 axiellt för att få en kollimerad stråle och använd excitationslasern och skjuvplattan för att kontrollera kollimeringen. Justera lutningen och sidopositionen för L2 för att centrera strålen på båda de frostade glasskivorna ovanför M3.
- Montera nålhålet i ett xy-översättningsfäste. Montera detta ovanpå ett 1D-förflyttningssteg för att ge fin axiell förflyttning. Montera nålhålet och stage på en stolpe och stolpfäste och placera den vid den delade fokuspunkten mellan L1 och L2. Justera nålhålet för hand tills laserljuset kan ses genom nålhålet.
- Montera effektmätarsensorn omedelbart efter nålhålet och använd våglängdsknappen på effektmätarens digitala konsol för att välja våglängd för excitationslasern. Justera hålets xy-position för att maximera transmissionen och få en nära TEM00-strålprofil. Justera sedan nålhålet axiellt med 1D-steget för att ytterligare maximera överföringen.
- Montera lins 4 (L4) på bordet i dess position och justera fästet till rätt höjd. Justera L4 axiellt så att excitationsstrålen fokuseras på galvos yta. Justera lutningen och sidoläget för L4 för att centrera strålen på båda de frostade glasskivorna ovanför M3.
- Montera lins 3 (L3) på bordet i dess position och justera fästet till rätt höjd. Använd excitationslasern och skjuvplattan för att kontrollera kollimeringen av L3 och L4. Justera lutningen och sidopositionen för L3 för att centrera strålen på båda de frostade glasskivorna ovanför M3.
- Ta bort L3 tillfälligt. Montera skanningslins 1 (SL1) på bordet och justera det axiella avståndet för att bilda ett kollimerat teleskop med L4, mätt med skjuvplattan. Justera lutningen och sidoläget för SL1 för att centrera strålen på båda de frostade glasskivorna ovanför M3.
- Sätt tillbaka L3. Montera rörlins 1 (TL1) och använd excitationsstrålen och skjuvplattan för att kollimera SL1 och TL1. Justera lutningen och sidopositionen för TL1 för att centrera strålen på båda de frostade glasskivorna ovanför M3.
- Använd en adapterring och skruva fast mål 1 (O1) i burplattan ovanför M3. Ta bort SL1 tillfälligt och låt balken slå i taket. Justera höjden (axiellt avstånd) på O1 på bursystemet tills strålen bildar en luftig skiva i taket, och fortsätt sedan justera tills skivans storlek minimeras.
- Med O1 på plats, montera sample stage i lämpligt läge.
Figur 3: Komponenternas placering i SOLS-systemet. (A) Schematisk layout av SOLS-systemet med alla komponenter märkta. (B) Foto uppifrån och ned av det fysiska SOLS-systemet på det optiska bordet, exklusive provstegsområdet. (C) Foto uppifrån och ned av provetappområdet (tillägg till figur 3B). Excitationsvägen visas i grönt. Utsläppsbanan visas i rött. Objektivens brännvidder: L1: 100 mm; L2: 45 mm; CL1: 50 mm; CL2: 200 mm; CL3: 100 mm; L3:150 mm; L4: 100 mm; SL1: 75 mm; TL1: 200 mm; SL2: 150 mm; TL2: 125 mm; TL3: 200 mm. Se materialtabellen för mer detaljerade delspecifikationer. Förkortningar: SOLS = single-objective light-sheet; ND-hjul = filterhjul med variabel neutral densitet; L1-L4 = plana konkava akromatlinser; CL1-CL3 = cylindriska linser; M1-M3 = speglar; TS1-TS2 = översättningssteg; DM = dikroisk spegel; Galvo = svepande galvanometer; SL1-SL2 = scannade linser; TL1-TL2 = rörlinser; O1-O3 = mål; EF = emissionsfilter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Anpassning av utsläppsbanan
- Ställ in inriktningslasern.
- Montera två tomma hållarplattor bredvid magnetiseringslasern på samma höjd som lasern. Använd dessa hållarplattor för att montera inriktningslasern genom att skjuta in inriktningslaserns hållstänger i de tomma hålen i de två hållarplattorna. Se till att lasern kan ställas in i på-läget, antingen genom att tejpa runt strömknappen eller genom att koppla en på/av-knapp.
- Ta bort O1 och sätt tillbaka den frostade glasjusteringsburen. Använd ett kinematisk spegelfäste och en nedrullningsbar spegel för att rikta in inriktningsstrålen mot excitationsstrålens bana.
- Använd effektmätaren för att maximera signalen från inriktningsbalken efter nålhålet genom att finjustera de två speglarna. Se till att strålen förblir centrerad på den frostade glasinriktningsburen.
- Ta bort inriktningsburen och sätt tillbaka O1. Placera den fyrkantiga spegeln på sample stage av O1 och justera spegeln axiellt tills storleken på strålprofilen minimeras efter dikroiken.
- Montera en iris i emissionsbanan och tillräckligt långt bak så att skanningslins 2 (SL2), rörlins 2 (TL2) och objektiv 2 (O2) kan sättas in utan störningar. Rikta in denna iris mot inriktningslasern. Montera en frostad glasskiva minst 1 tum bakom irisen och se till att denna också är i linje med laserljuset.
- Sätt in SL2 på rätt avstånd, mätt från galvo med en linjal. Justera lutningen och sidoläget för SL2 så att den inkommande inriktningsbalken är centrerad på SL2 och den utgående strålen passerar genom bländaren och den frostade glasskivan.
- Sätt in TL2 på rätt avstånd, mätt från SL2 med en linjal. Justera lutningen och sidopositionen för TL2 så att den inkommande inriktningsstrålen är centrerad på TL2 och den utgående strålen passerar genom bländaren och den frostade glasskivan.
- Montera TS2 på bordet. Se till att stage översätts längs den optiska axeln för O2.
- Skruva fast O2 på ett xy-översättningsfäste. Anslut en stolpe under xy-fästet för att montera O2 på översättningssteget. Använd ett skruvat mål för att centrera baksidan av O2 på den röda lasern.
- Justera xy-rattarna och lutningen på O2 så att den röda inriktningsstrålen passerar genom bländaren och den frostade glasskivan.
- Flytta inriktningslasern till över O1 och riktad nedåt i emissionsbanan. Slå på lasern och se till att denna stråle är centrerad på alla linser i emissionsbanan.
- Konjugera pupillplanen för O1 och O2 genom att öppna iris och ta bort den frostade glasskivan så att inriktningsbalken som lämnar O2 fortsätter obehindrat till en avlägsen yta eller vägg (>0,5 m) (figur 4). Justera TS2 tills strålen bildar en liten Airy-skiva på ytan och fortsätt sedan att justera TS2 för att minimera storleken på Airy-skivan.
OBS: En starkt divergerande stråle indikerar felaktig placering av O2. Men eftersom denna stråle passerar genom två mål är en liten avvikelse inneboende. Som sådan är Airy-skivan den bästa guiden. - Optimera galvoen för lutningsinvariant skanning: Tryck på FSK-knappen på vågformsgeneratorn för att välja en triangelvågsignal för galvoen och ställ in på en låg frekvens (~1 Hz). Observera inriktningsbalken på samma avlägsna yta eller vägg.
OBS: Om galvoen är felaktigt placerad kommer strålen att svepa horisontellt på ytan tillsammans med galvorörelsen. Detta kan lösas genom finjusteringar (för hand) av galvobasens lutning och xy-position tills strålförskjutningen inte kan upptäckas med ögat. - Kontrollera systemets kvalitet genom att avbilda vid 0°.
- Skruva fast O3 i ett xy-översättningsfäste. Skruva fast en 1 tums linsrör i buren översättning stage och skruva xy translation stage i röret. Använd två burstänger för att ansluta framsidan av buröversättningssteget till en burplatta och montera burplattan på en stolpe. Montera objektiv 3 (O3) nära framsidan av O2 (~4-5 mm) vid 0° och justera höjden så att den matchar.
- Montera en justeringsskiva av frostat glas i det delade fokalplanet mellan SL2 och TL2, mätt med en linjal. Montera den fluorescerande testglaset i akryl på scenen och belys objektglaset med excitationslasern. Titta genom baksidan av O3, justera både höjden och den axiella positionen för O3 för att hitta emissionsljuset och justera sedan O3 axiellt tills emissionsljuset fyller den bakre öppningen (Figur 5).
- Skruva fast två 8-tums burstavar på baksidan av O3-översättningssteget. Skjut en burplatta med en monterad frostad glasskiva på stavarna och finjustera sedan O3 med xy-fästet för att säkerställa att emissionsljuset lämnar O3 centrerat. Ta sedan bort burstängerna.
- Montera en skiva av frostat glas i det grova läget för kamerasensorn och rikta in skivans höjd och position mot emissionsljuset.
- Skruva fast rörlins 3 (TL3) i en burplatta och montera den omedelbart bakom O3. Centrera TL3 på den inkommande emissionslampan och justera sedan lutningen på TL3 för att rikta in det utgående ljuset mot den frostade glasskivan.
- Montera kameran på rätt avstånd från rörlinsen, mätt med en linjal.
- Skruva fast både 2 i linsrören och emissionsfiltret på kameran.
- Sätt tillbaka inriktningsskivan för frostat glas i det delade fokalplanet mellan SL2 och TL2. Montera det fluorescerande färgprovet och belys provet med excitationsstrålen.
- Slå på kameran och öppna sedan Micromanager-programmet på den anslutna datorn. Klicka på Live för att komma till livevyn. Klicka på Auto en gång för att ställa in de initiala exponeringsinställningarna och återställ sedan exponeringen efter behov vid bildtagning.
OBS: Micromanager fungerar inte korrekt om den inte öppnas efter att kameran har slagits på. - Justera xy-överföringsrattarna på O3-fästet tills det lilla hålet i glasjusteringsskivan är centrerat inom fältet (FoV). Justera O3 axiellt med burens översättningssteg tills hålet är i fokus; kanterna ska vara skarpa (Figur 6).
- Bild fluorescerande pärlor för att kontrollera systemets kvalitet.
- Ta bort justeringsskivan för frostat glas, montera 3D-pärlprovet och belysa provet med excitationsstrålen.
- Justera höjden på sample i förhållande till O1 tills de fluorescerande pärlorna fyller ett cirkulärt område i mitten av FoV.
- Finjustera positionen för O3 med hjälp av xy-steget och det axiella translationssteget tills punktspridningsfunktionerna (PSF) är runda (indikerar minimala aberrationer) och ljusa (indikerar ett bra signal-brusförhållande) (figur 7). Om detta inte kan uppnås genom att justera O3 är det mycket troligt att det optiska systemet mellan komponenterna O1 och O2 är suboptimalt inriktat; Följ diagnostiska kontroller i steg 3.13 nedan.
- Om runda PSF:er kan erhållas, hoppa över diagnostiksteget och gå vidare till att luta bildsystemet.
- Utför diagnostiska kontroller om det behövs.
OBS: När bra PSF:er har erhållits kan resten av diagnostikstegen hoppas över.- Montera ljusfältsljuset (BF) ovanför O1. Montera det positiva gallertestmålet på provsteget på samma axiella höjd som inriktningsspegeln. Centrera 10 μm-gallret och lys upp gallret med BF-lampan.
- Ta en bild av rutnätet på kameran och översätt exemplet tills rutnätet är i fokus. Använd rutnätsbilden för att bekräfta att fältet över synfältet är platt: om inte, kommer rutnätet att se förvrängt och böjt ut. För att korrigera för en dålig rutnätsbild, justera xyz-positionen och lutningen för O3 och justera sedan TL3 och kameran därefter.
ANM.: Om ett platt rutnät kan uppnås, upprepa steg 3.12.10 och gå sedan vidare till att luta bildsystemet. - Ställ in inriktningskameran eller bildkameran på rätt avstånd så att SL2 fokuserar bilden på sensorn. Föreställ dig rutnätsmålet i mellanplanet (figur 8). Om detta rutnät också är skevt är det mycket troligt att det optiska systemet mellan komponenterna O1 och SL2 är suboptimalt inriktat och bör ses över. Optimera justeringen efter behov innan du fortsätter.
OBS: Om kameran inte passar in mellan SL2 och TL2, använd en extra spegel för att studsa bilden 90° efter SL2 och på kameran. - Kontrollera PSF:erna på mellanplanet: Efter att ha kontrollerat nätet är en annan bra diagnostisk kontroll att kontrollera PSF:erna på samma mellanplan. En bra bild på detta plan, som liknar figur 7 men med en annan förstoring (figur 9), indikerar bra inriktning genom SL2.
ANM.: Om ett platt rutnät och runda PSF:er kan uppnås i mellanplanet, upprepa steg 3.13.2, sedan steg 3.12.10 och gå sedan vidare till att luta bildsystemet.
- Luta O3-bildsystemet till 30°.
- Ta bort O3, TL3 och kameran.
- Sätt tillbaka O3 i 30° till den optiska axeln på O2 med hjälp av linjerna på bordet som vägledning.
- Montera en justeringsskiva av frostat glas i det delade fokalplanet mellan SL2 och TL2. Montera den fluorescerande testglaset i akryl på scenen och belys objektglaset med excitationslasern. Återigen, titta igenom baksidan av O3, justera både höjden och den axiella positionen för O3 för att hitta emissionsljuset vid 30° och justera sedan O3 axiellt tills emissionsljuset fyller den bakre öppningen.
- Ta bort justeringsskivan för frostat glas mellan SL2 och TL2 för att få en starkare emissionssignal.
- Skruva fast två 8-tums burstavar på baksidan av O3-översättningssteget. Skjut en burplatta med en monterad frostad glasskiva på stavarna och finjustera sedan O3 med xy-fästet för att säkerställa att emissionsljuset lämnar O3 centrerat. Ta sedan bort burstängerna.
- Montera en skiva av frostat glas i det grova läget för kamerasensorn och rikta in skivans höjd och position mot emissionsljuset.
- Montera TL3 omedelbart bakom O3. Centrera TL3 på den inkommande emissionslampan och justera sedan lutningen på TL3 för att rikta in det utgående ljuset mot den frostade glasskivan.
- För att ställa in TL3-kameraavståndet mer exakt, skruva försiktigt loss O3 och montera inriktningslasern så att den fokuseras av TL3 på kameran. Använd ND-filter vid behov så att laserintensiteten är <1 mW. Starta kamerans livevisning och justera TL3 axiellt för att minimera laserpunkten på kameran.
- Sätt tillbaka inriktningsskivan för frostat glas i det delade fokalplanet mellan SL2 och TL2. Montera det fluorescerande färgprovet och belys provet med excitationsstrålen. Justera xy-överföringsrattarna på O3-fästet tills det lilla hålet i glasjusteringsskivan är inom FoV på kameran. Justera burens översättningssteg för att flytta O3 axiellt tills hålet är i fokus; Se till att hålet ser ut som det gjorde vid 0°.
- Montera tillbaka det positiva gallertestmålet på samma axiella höjd och lys upp gallret med BF-lampan. Kontrollera att endast en vertikal sektion är i fokus (på grund av 30° lutning). Återigen, använd rutnätsbilden för att bekräfta att fältet över FoV är platt, även när det inte är i fokus. När bilden översätts axiellt kontrollerar du att den del av synfältet (rutnätsmålet) som är i fokus sveper horisontellt över skärmen, medan rutnätsrutorna behåller en konsekvent storlek (figur 10).
OBS: På grund av lutningen av bildplanet vid sample, kan rutnätet verka något sträckt i x-planet.
Figur 4: Laser-in-laser-ut-teknik. Skickar en kollimerad teststråle genom framsidan av O1 och observerar strålen som lämnar O2 på en avlägsen yta. Om alla komponenter är inriktade på rätt avstånd kommer strålen att bilda en liten luftig skiva på den avlägsna ytan. Alla förkortningar är desamma som i figur 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Använda emissionsljus för inriktning. (A) Emissionsljus från en fluorescerande akrylbild på ett skruvat mål bakom BFP för O2. (B) Hitta emissionsljuset genom att se genom baksidan av O3. Förkortningar: O2-O3 = mål; BFP = bakre fokalplanet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Bild på kameran av den korrekt fokuserade justeringsskivan för frostat glas. Disken placerades i mellanplanet mellan SL2 och TL2. Skalstapel = 50 μm. Förkortningar: SL2 = scannade lins; TL2 = rörlins. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Kamerabild av 3D-pärlprovet. Bilden visar 1 nm-pärlor med bildbehandlingsmodulen inställd på 0° och belyst av en cirkulär stråle innan de cylindriska linserna sätts in. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Positivt rutnätstestmål korrekt fokuserat på mellanplanet mellan SL2 och TL2. De plana rutnäten över hela fältet indikerar god inriktning av komponenterna SL2 och tidigare. Skalstapel = 30 μm. Förkortningar: SL2 = scannade lins; TL2 = rörlins. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Kamerabild av 3D-pärlprovet. Bilden visar 1 nm-pärlor korrekt fokuserade på mellanplanet mellan SL2 och TL2. Skalstapel = 30 μm. Förkortningar: SL2 = scannade lins; TL2 = rörlins. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Positivt rutnätstestmål med en gul fyrkant av konsekvent storlek överlagrad för att matcha rutnätets rutor. (A) Rutnät i fokus på vänster sida. (B) Rutnät i fokus på höger sida. Den gula fyrkanten matchar storleken på rutnätsrutorna på båda sidor av FoV. Skalstreck = 30 μm. Förkortning = FoV = synfält. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Rikta in det sneda ljusarket
- Ta bort O1 och sätt tillbaka den dubbla frostade glasinriktningsburen på plats. Kontrollera att strålen är kollimerad och centrerad på båda frostade glasskivorna.
- Skruva fast den cylindriska linsen 1 (CL1) i ett roterande objektivfäste. Montera CL1 i den optiska vägen och vrid fästet så att strålen expanderar i vertikal riktning mot det optiska bordet. Justera lutningen och sidoläget för CL1 så att strålen är centrerad på framsidan och bibehåller en centrerad position på båda frostade glasskivorna.
- Skruva fast cylindrisk lins 2 (CL2) i ett roterande linsfäste och montera CL2 i den optiska vägen på rätt avstånd för att bilda ett 4f-system med CL1. Vrid CL2 till samma riktning som CL1 så att strålen sträcks i riktningen vertikalt mot det optiska bordet och kollimeras. Använd ett testkort för att mäta höjden på den cylindriska balkprofilen på flera ställen för att säkerställa att balken kollimeras. Justera lutningen och sidopositionen för CL2, som utfördes i steg 4.2.
- Skruva fast cylindrisk lins 3 (CL3) i ett roterande linsfäste och montera CL3 i den optiska vägen på rätt avstånd för att bilda ett 4f-system med L3. Vrid CL3 till samma orientering som både CL1 och CL2 så att strålen fokuseras ner till en horisontell plåtprofil vid fokalplanet. Justera lutningen och sidopositionen för CL3, som utfördes i steg 4.2.
- Sätt i skåran: Använd fyra 4-tums burstänger och CL3-burfästet, montera slitsen i vertikal orientering vid fokalplanet mellan CL3 och L3, mätt med en linjal. Använd den sträckta excitationsstrålen profile för att justera höjden och sidopositionen för slitsen tills den är centrerad på strålen.
- Sätt tillbaka O1, montera det fluorescerande färgprovet och belys sample med excitationsljusarket. Vid kamerasensorn, kontrollera att 0° ljusarket visas som ett tunt vertikalt ark (Figur 11A).
- Ta bort det fluorescerande färgämnestestample och torka av O1 ren. Låt ljusarket expandera över O1 obehindrat. Använd den motoriserade översättningsstegskontrollen och översätt M1 mot de cylindriska linserna för att ställa in ljusplåtens vinkel till ungefär 60° i förhållande till den optiska axeln för O1.
OBS: Det är viktigt att ljusarket lutas i rätt riktning för att passa in med det liknande lutande bildplanet (figur 12); Om ett system är upplagt på ett annat sätt än denna specifika design kan den korrekta lutningsriktningen beräknas genom geometrisk strålspårning.
OBS: Som referens, genom att översätta M1 2.647 mm mot skåran ställer du in ljusplåten på rätt lutning i denna inställning. - Sätt tillbaka det fluorescerande färgprovet för att avbilda det lutande arket. Se till att ljusarket har bibehållit en vertikal strålform på kameran men är bredare och svagare (Figur 11B).
- Översätt provet axiellt med stage så att det fluorescerande färgämnet belyses av ljusarket på fem olika djup mellan mitten av FoV och skärmens högra sida. Spara varje bild.
- Öppna bilderna i Fiji. För varje bild väljer du linjeverktyget och ritar en horisontell linje från mitten av synfältet till mitten av det ljusa arket. Om du vill mäta förskjutningen går du till Analysera | Mät för att se längden på linjerna. Plotta sedan förskjutningen av ljusplåten som en funktion av provdjupet för att beräkna vinkeln på ljusplåten över O1.
- Översätt M1 något. Upprepa steg 4.9 och steg 4.10 tills ljusplåtens vinkel är 60° från den optiska axeln för O1 och matchar bildplanets vinkel.
Figur 11: Kamerabilder av provet med fluorescerande färgämne belysta av en korrekt formad ljusskiva. (A) Plåten i 90°, rakt upp längs den optiska axeln för O1, och (B) lutad till 30° (60° mot den optiska axeln för O1). Skalstreck = 50 μm. Förkortning: O1 = mål. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 12: Rätt riktning för ljusplåtens lutning för att passa in med bildplanet för O1. Förkortning: O1-O3 = mål. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Finjustering av systemet för bildtagning och datainsamling
- Montera 3D-pärlglaset och översätt provet axiellt med scenen tills pärlorna fyller synfältet på kameran.
- Justera O3 med hjälp av xy-steget och buröversättningssteget, i syfte att minimera aberrationer och optimera signal-brusförhållandet i bilden (figur 13).
- Justera korrigeringskragen för O1, i syfte att minimera aberrationer och optimera signal-brusförhållandet i bilden.
Figur 13: Kamerabilder av 3D-pärlprovet (1 μm pärlor) belysta av en korrekt formad ljusplåt. (A) Arket i 90°, rakt upp längs den optiska axeln för O1, och (B) lutat till 30° mot den optiska axeln för O1. Den gula rutan anger den del av synfältet som är platt, konsekvent och användbar (80 μm x 80 μm) och där tillförlitliga data kan samlas in. Skalstreck = 50 μm. Förkortningar: O1 = mål; FoV = synfält. Klicka här för att se en större version av denna figur.
6. Kalibrera systemets förstoring
- Montera det positiva gallertestmålet på provsteget och lys upp med ljusfältsljuset.
- Översätt rutnätsbilden axiellt med scenen för att få rutnätsbilden i fokus. Sätt mitten av rutnätet i fokus.
- Ta och spara bilden och öppna den sedan på Fiji.
- Använd linjeverktyget och mätfunktionen i Fiji för att noggrant mäta avståndet mellan två rutnätslinjer i pixlar. Dividera detta värde med det kända avståndet (10 μm) för att bestämma pixel-till-mikron-kalibreringen.
- Beräkna systemets förstoring (M) med hjälp av den uppmätta storleken på pixeln och den kända storleken på en pixel med ekvation (1).
Nej (1)
Nej (1)7. Skaffa volymetriska skanningar
- Placera provet.
- Slå på kameran preview, galvo, funktionsgenerator, strömförsörjning, stage och excitationslaser.
- Montera provet och klicka sedan på FSK-knappen på funktionsgeneratorn för att ställa in en triangelvåg. För att hitta sample, använd funktionsgeneratorn för att ställa in följande: 400 mV topp-till-topp amplitud (med ampl. knapp), 0 offset (med offset-knappen ) och 200 mHz frekvens. Använd Micromanager-fönstret för att ställa in en exponeringstid på 100 ms.
- Bläddra i z manuellt tills exempelplanet nås. Optimera z-inställningen så att det önskade området för den volymetriska skanningen passerar genom skärmen under en cykel.
- Välj genomsökningsparametrar.
- Se till att amplituden från topp till topp är korrekt inställd genom att visuellt kontrollera att förhandsgranskningen ser ut att vara i fokus under hela skanningen. Om bildkvaliteten försämras tidigare när du närmar dig den ena änden av skanningen än den andra, redigerar du förskjutningen på funktionsgeneratorn för att flytta mitten av skanningen mot det bättre området.
- I Micromanager-programmet väljer du en exponeringstid och klickar på Multi-D Acq. för att öppna fönstret Multi-Dimensional Acquisition. Använd rutan Antal för att välja antalet bildrutor, vilket ställer in den totala förvärvstiden. Intervallet mellan bildrutorna (bildhastigheten) ställs in av exponeringstiden om inte ett längre intervall anges i rutan Intervall. På funktionsgeneratorn ställer du in frekvensen för att skapa en fullständig volymskanning med hälften av perioden för triangelvågsfunktionen (linjär skanning i en riktning).
OBS: Om bildfrekvensen och frekvensen är för låg kommer för få bildrutor att förvärvas för en volymskanning, och det låga bildnumret kommer att skapa synliga artefakter i efterbehandlingen. Som referens bestod bild 13 av ~100 bildrutor i skanningen och bild 14 bestod av ~800. Det är också viktigt att ta hänsyn till själva provet när du väljer parametrarna. Se till att exponeringstiden är inställd så att sample är tillräckligt exciterad men inte mättad. Excitationslaserns intensitet kan också justeras för detta ändamål. Om användaren hämtar en serie volymetriska skanningar för att karakterisera en tidsvarierande process i 3D, se till att skanningstidsskalan överskrider systemets tidsskaledynamik.
- Samla in videor: Skaffa en time-lapse som fångar åtminstone varaktigheten av en full ramp upp eller ner av triangelvågen, vilket motsvarar en fullständig genomsökning av volymen.
8. Förfaranden för efterbehandling
- Förvrängning av volymetriska bildstaplar
- Räta upp volymskanningarna för att konvertera högen med bilder i lutande plan till en serie bilder i verkliga xyz-koordinater.
OBS: Det finns många utmärkta guider om efterbehandling av light-sheet-bilder och programvara med öppen källkod för att utföra upprätning av befintliga volymskanningar, samt för att utföra upprätning och spara snedställda bilder under förvärv24. - För att räta upp volymskanningarna, erhåll följande två parametrar: det verkliga avståndet mellan två bildrutor i pixlar (d) och vinkeln mellan bildruteplanet och xy-planet (θ ställs in av vinkeln på det sneda ljusarket (i detta system 30°). Avståndet mellan bilderna beror på bildoptiken och exponeringsinställningarna.
- Räta upp volymskanningarna för att konvertera högen med bilder i lutande plan till en serie bilder i verkliga xyz-koordinater.
- Hitta d-parametern
- Kalibrera avståndet mellan bildrutorna för varje gång systemet justeras väsentligt. Utför denna kalibrering med en bunt bilder av fluorescerande pärlor, eftersom dessa är de enklaste att använda för att diagnostisera problem.
- Hämta en stapel med bilder och kör korrigeringskoden med hjälp av en första gissning för d-parametern . Öppna den räta bildstapeln i ImageJ och bläddra igenom stapeln. Om d har ställts in väsentligt långt från sitt verkliga värde, observera att pärlorna kommer att se artificiellt långsträckta ut i x eller y, och enskilda pärlor kommer att se ut att röra sig i xy-planet när användaren bläddrar genom ramarna i z (i stället för att fokusera och defokusera från samma centrala punkt). Iterera över parametern d flera gånger tills dessa problem inte längre är uppenbara.
- När d-parametern verkar vara någorlunda nära det sanna värdet beräknar du projektioner med maximal intensitet för bildstapeln längs x- och y-riktningarna. Observera att pärlor med en diameter nära diffraktionsgränsen kan se långsträckta ut i z, men de bör helst inte se koniska ut eller vara långsträckta diagonalt. Finjustera korrigeringsparametrarna tills dessa kriterier inte förbättras avsevärt med nya iterationer. Som referens kan nämnas att de data som visas i figur 13 rätades upp vid d = 2,50 pixlar och data i figur 14 rätades upp vid d = 1,0 pixlar.
OBS: Avståndet mellan bildrutorna beror linjärt på skanningen amplitud, frekvens och bildhastighet.
Representative Results
Vi utförde volymetriska skanningar av 1 μm kulor inbäddade i gellangummi. Figur 14 visar de maximala intensitetsprojektionerna för de uppskruvade volymetriska skanningarna längs x-, y- och z-riktningarna.
Figur 14: Volymetrisk avbildning av 1 μm fluorescerande pärlor i gellangummi. Maximala intensitetsprojektioner av uppskruvade volymetriska skanningar visas. Skalstreck = 30 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Vi har demonstrerat användningen av mikroskopet med ett enda objektiv för att karakterisera rekonstituerade cytoskelettnätverk genom att utföra volymetriska skanningar av prover av mikrotubuliastrar. I korthet polymeriserades rodaminmärkta, taxolstabiliserade mikrotubuli från rekonstituerade dimerer av GTP; sedan, efter polymerisation, blandades streptavidinbaserade kinesinmotorkluster i prover tillsammans med ATP för slutliga koncentrationer av 6 μM mikrotubuli, 0,5 μM kinesindimerer och 10 mM ATP. Omfattande protokoll och guider för beredning av taxolstabiliserade mikrotubuli och kinesinmotoriska kluster finns på Mitchson Labs och Dogic Labs webbplatser25,26. Proverna pipetterades försiktigt in i objektglas, förseglades och fick sitta i 8 timmar före avbildning för att tillåta motorisk aktivitet att upphöra så att proverna nådde ett stabilt strukturellt tillstånd som liknade astrar.
Studier av rekonstituerade cytoskelettsystem använder oftast konfokal- eller epifluorescensmikroskopi för att avbilda märkta filament. Båda dessa tekniker är dock begränsade i sin förmåga att avbilda täta 3D-prover27. Även om stora framsteg har gjorts inom in vitro-cytoskelettbaserad forskning om aktiv materia genom att begränsa proverna till kvasi 2D28,29, är cytoskelettnätverk till sin natur 3D, och många nuvarande ansträngningar ligger i att förstå de effekter som bara kan uppstå i 3D-prover29,30, vilket skapar ett behov av högupplöst 3D-avbildning.
Figur 15: Underlättande av 3D-visualisering av rekonstituerade cytoskelettprover med enkelobjektiv light-sheet-mikroskopi. (A) Bilder av fluorescerande mikrotubuli som tagits med ett Leica DMi8 laserskannat konfokalmikroskop. Bilderna visar olika plan från en z-scan. Skalstapel = 30 μm. (B) Dekonvolverade uppdelade uppdelade bilder från en volymetrisk skanning utförd på en ljusarksuppställning med ett enda objektiv av samma prov. Skalstapel = 30 μm. Det räta bildområdet här motsvarar det användbara synfältet (gul låda) som visas i figur 13B. Medan konfokalen utmärker sig vid avbildning av enstaka plan nära täckglaset, introducerar densiteten hos det fluorescerande provet komplikationer vid avbildning vid högre plan på grund av den extra signalen från undersidan av avbildningsplanet. Ljusarket kringgår detta problem genom att endast belysa bildplanet, vilket möjliggör enhetligt skarp avbildning på olika plan i z. Förkortningar: SOLS = single-objective light-sheet; FoV = synfält. Klicka här för att se en större version av denna figur.
I figur 15 visar vi den volymetriska avbildningen av ett rekonstruerat mikrotubulinätverk som är sammandraget till asterliknande strukturer av kinesinmotorkluster. Som visats i tidigare forskning 28,31 tenderar dessa 3D-strukturer att växa tätt mot mitten, vilket resulterar i ljusa områden av fluorescens som dominerar i signalen. I avbildningsplan nära täckglaset (låg z-nivå) kan konfokalmikroskopi (Figur 15A) upplösa enstaka filament runt asterns periferi, med ytterligare bakgrund mot mitten på grund av oskarpa fluorescenssignaler ovanifrån. Att flytta några mikrometer i z minskar dock snabbt kvaliteten på bilderna på grund av att de oskarpa täta delarna av astern dominerar i signalen i bildplanet. Ljusplåtens enplansbelysning (figur 15B) eliminerar de oskarpa signalerna från de täta delarna av astern ovanför och under bildplanet, vilket möjliggör jämförbar bildkvalitet mellan planen. Light Sheet's förmåga att producera högkvalitativa, tillförlitliga volymetriska skanningsdata öppnar upp möjligheten att visualisera och karakterisera 3D-fenomen i rekonstituerade cytoskelettsystem.
Discussion
Två viktiga detaljer om det här protokollet är den totala kostnaden för systemet och den förväntade bygg- och justeringstiden. Även om den exakta kostnaden varierar, kan vi bekvämt uppskatta att kostnaden för denna SOLS eller ett liknande gör-det-själv-system skulle ligga i intervallet 85 000 USD. Vi noterar att denna uppskattning tar hänsyn till detaljhandelspriset för alla komponenter, så detta totala pris kan sänkas kraftigt genom att köpa begagnade komponenter. När det gäller byggtiden skulle det vara rimligt att förvänta sig att en användare med liten erfarenhet av optik ska bygga och justera hela detta SOLS-system inom 1-2 månader, förutsatt att alla komponenter är tillgängliga och klara. Trots protokollets längd och komplexitet anser vi att mängden detaljer i det skrivna manuskriptet, i kombination med videoprotokollet, bör göra detta protokoll enkelt och snabbt att följa.
Det finns två viktiga steg i det här protokollet. För det första bestämmer placeringen av galvo placeringen av många linser eftersom den är en del av tre separata 4f-linspar. Det är avgörande att galvoen både är konjugerad med de bakre fokalplanen för O1 och O2 och centrerad korrekt för att säkerställa lutningsinvariant skanning. För det andra är bildkvaliteten extremt känslig för inriktningen av O2 och O3 i förhållande till varandra. Här måste man se till att inriktningsvinkeln för O3 till O2 för det första matchar lutningen på excitationsljusarket, vilket ger maximalt platt belysning över den på samma sätt lutande FoV. För det andra måste O3 placeras på rätt axiellt avstånd för att bibehålla en platt FoV med så stor yta som möjligt. För det tredje måste O3 placeras på rätt sidoavstånd från O2 för att maximera signalen som passerar genom O2-O3-gränssnittet.
När det gäller användbar synfält uppnådde detta system ett platt, tillförlitligt fält med konsekvent belysning över ett område på 80 μm x 80 μm. Detta område är mindre än det maximala FoV som tillhandahålls av kameran, så den användbara FoV indikeras av den gula rutan i figur 13. När det gäller upplösningsförmågan uppnådde detta system ett minsta lösbart avstånd på 432 nm längs x-axeln och 421 nm längs y-axeln, vilket mättes genom att hitta det genomsnittliga sigma x och y för Gaussiska passningar till punktspridningsfunktioner (PSF) i bra FoV och multiplicera med två. Vi noterar att detta system inte var optimerat när det gäller dess totala NA, vilket innebär att det finns utrymme för betydande förbättringar om användarna önskar en upplösningsförmåga som är högre än vad detta system uppnådde. Det finns en mängd kompatibla målalternativ för denna typ av SOLS-bygge, av vilka många skulle bidra till en högre systemupplösning men med nackdelarna med en högre kostnad, en mindre FoV eller mer komplicerade inriktningstekniker vid relägränssnittet 8,11,13,20. Separat, om användare önskar en större FoV, skulle införlivande av en andra galvo för att möjliggöra 2D-skanning uppnå detta mål, men skulle kräva att ytterligare optik och kontrollmekanik integreras i designen32. Vi har tillhandahållit mer information om ändringar av systemet på vår webbplats, tillsammans med länkar till andra användbara resurser om designprocessen23.
Utöver att förbättra de specifika komponenterna för just denna design, skulle det vara mycket möjligt att lägga till andra högupplösta mikroskopitekniker eller modaliteter till denna konstruktion. En sådan förbättring skulle vara att införliva belysning med flera våglängder, vilket skulle innebära att ytterligare excitationslasrar anpassas till den ursprungliga excitationsvägen8. Dessutom, eftersom denna typ av SOLS-design lämnar provet tillgängligt, är det relativt enkelt att lägga till ytterligare funktioner till mikroskopet, inklusive men begränsat till optisk pincett, mikrofluidik och reometri.
Jämfört med de otaliga light-sheet-guider som har publicerats, ger detta protokoll instruktioner på en nivå av förståelse som en användare utan betydande optikerfarenhet kan ha nytta av. Genom att göra en användarvänlig SOLS-byggnad med traditionella provmonteringsmöjligheter tillgänglig för en större publik, hoppas vi kunna möjliggöra en ytterligare expansion av tillämpningarna av SOLS-baserad forskning inom alla områden där instrumentet har eller kan användas. Även med tillämpningar av SOLS-instrument som snabbt växer i antal 2,34,35, tror vi att många fördelar och användningsområden för instrument av SOLS-typ fortfarande är outforskade och uttrycker entusiasm över möjligheterna för denna typ av instrument framöver.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja. All forskning har bedrivits i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation (NSF) RUI Award (DMR-2203791) till J.S. Vi är tacksamma för den vägledning som Dr. Bin Yang och Dr. Manish Kumar gav under anpassningsprocessen. Vi tackar Dr. Jenny Ross och K. Alice Lindsay för förberedelseinstruktionerna för kinesinmotorerna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1" Plano-Concave Lens f = -50 mm | Thorlabs | LC1715-A-ML | For alignment laser Estimated Cost: $49.5 |
| 1" Achromatic Doublet f = 100 mm (x3) | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L2, L4 and alignment laser Estimated Cost: $342.42 |
| 1" Achromatic Doublet f = 125 mm | Thorlabs | AC254-125-A-ML | SL2 Estimated Cost: $114.14 |
| 1" Achromatic Doublet f = 150 mm | Thorlabs | AC254-150-A-ML | L3 Estimated Cost: $114.14 |
| 1" Achromatic Doublet f = 150 mm | Thorlabs | AC254-150-A-ML | TL2 Estimated Cost: $114.14 |
| 1" Achromatic Doublet f = 45 mm | Thorlabs | AC254-045-A-ML | L1 Estimated Cost: $114.14 |
| 1" Achromatic Doublet f = 75 mm | Thorlabs | AC254-075-A-ML | SL1 Estimated Cost: $114.14 |
| 1" Cylindrical Lens f = 100 mm | Thorlabs | LJ1567RM | CL3 Estimated Cost: $117.62 |
| 1" Cylindrical Lens f = 200 mm | Thorlabs | LJ1653RM | CL2 Estimated Cost: $111.22 |
| 1" Cylindrical Lens f = 50 mm | Thorlabs | LJ1695RM | CL1 Estimated Cost: $117.62 |
| 1" Mounted Pinhole, 30 µm Pinhole Diameter | Thorlabs | P30K | Estimated Cost: $77.08 |
| 1" Silver Mirror (x3) | Thorlabs | PF10-03-P01 | M1, M2, one for alignment Estimated Cost: $168.78 |
| 2" Elliptical Mirror | Thorlabs | PFE20-P01 | M3 Estimated Cost: $179.98 |
| 2" Post Holder (x11) | Thorlabs | PH2 | For custom laser mount, ND wheel, safety screens Estimated Cost: $98.45 |
| 2" Posts (x47) | Thorlabs | TR2 | For custom laser mount and optical components Estimated Cost: $277.3 |
| 3" Posts (x4) | Thorlabs | TR3 | For M3 supports and other mounts Estimated Cost: $24.6 |
| 3" Post Holder (x4) | Thorlabs | PH3 | Estimated Cost: $38.48 |
| 30 to 60 mm Cage Adapter | Thorlabs | LCP33 | To mount O1 Estimated Cost: $45.42 |
| 30mm Cage Filter Wheel | Thorlabs | CFW6 | To mount ND filters Estimated Cost: $172.36 |
| 30mm Cage Plate (x6) | Thorlabs | CP33 | To build alignment cage and alignment laser Estimated Cost: $114.54 |
| 30mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount (x3) | Thorlabs | KCB1 | To mount M1 and M2 and for alignment laser Estimated Cost: $463.95 |
| 4" Post Holder (x30) | Thorlabs | PH4 | Estimated Cost: $320.1 |
| 561 nm Laser and Power Supply | Opto Engine LLC | MGL-FN-561-100mW | Excitation laser Estimated Cost: $6000 |
| 60mm Cage Plate (x2) | Thorlabs | LCP01 | To mount TL1 and M3 mount Estimated Cost: $88.52 |
| 60mm Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB2 | To mount M3 Estimated Cost: $187.26 |
| 90° Flip Mount | Thorlabs | TRF90 | For alignment laser Estimated Cost: $95.5 |
| Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A9 | To connect lens tube to camera Estimated Cost: $20.96 |
| Adapter with External SM1 Threads and Internal C-Mount Threads | Thorlabs | SM1A10 | To connect tube lens to lens mount Estimated Cost: $21.82 |
| Adapter with External SM1 Threads and Internal M25 Threads (x2) | Thorlabs | SM1A12 | To mount O1 and O2 Estimated Cost: $47.06 |
| Adapter with External SM1 Threads and Internal M26 Threads | Thorlabs | SM1A27 | To mount O3 Estimated Cost: $22.38 |
| Alignment Disk | Thorlabs | SM1A7 | Estimated Cost: $20.45 |
| Alignment Laser | BISKEE | https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Estimated Cost: $16.98 |
|
| Autoluorescent Plastic Slide, Red | Chroma | 92001 | Estimated Cost: $20 |
| Beam Shutter | Thorlabs | SM1SH1 | To block laser light Estimated Cost: $65.8 |
| Cage Rotation Mount (x3) | Thorlabs | CRM1T | To mount CL1-3 Estimated Cost: $282.15 |
| Cage System Rods 1" (x8) | Thorlabs | ER1 | To mount M3 and O1 Estimated Cost: $44.8 |
| Cage System Rods 3" (x2) | Thorlabs | ER3 | To mount O3 Estimated Cost: $14.28 |
| Cage System Rods 4" (x4) | Thorlabs | ER4 | To mount slit Estimated Cost: $30.76 |
| Cage System Rods 8" (x2) | Thorlabs | ER8 | For tube lens alignment Estimated Cost: $25.3 |
| Cage System Rods 12" (x8) | Thorlabs | ER12 | For alignment cage Estimated Cost: $145.36 |
| Camera | Andor | Zyla 4.2 sCMOS | Estimated Cost: ~$14,000 |
| Clamping Fork (x35) | Thorlabs | CF125 | To clamp down post mounts Estimated Cost: $338.8 |
| Cover Glass, 22 x 22 mm | Corning | 2850-22 | For slide samples Estimated Cost: $265 |
| Dichroic | AVR | DI01-R405/488/561/635-25x36 | To split exciation/emission paths Estimated Cost: $965 |
| Dovetail Translation Stage | Thorlabs | DT12 | To translate pinhole Estimated Cost: $90.55 |
| Emission Filter | Thorlabs | FELHO600 | Estimated Cost: $140.99 |
| Frosted Glass Alignment Disk (x2) | Thorlabs | DG10-1500-H1 | For alignment cage and intermediate plane Estimated Cost: $75.14 |
| Function Generator | Hewlett-Packard | HP 33120A 15 MHz | To control galvo Estimated Cost: $900 |
| Galvanometer - 1D Large Beam Diameter System | Thorlabs | GVS011 | Estimated Cost: $1715.78 |
| Galvanometer Power Supply | Siglent | SPD3303C | Estimated Cost: $300 |
| Gelrite | Research Products International | G35020-100.0 | Gellan gum for 3D bead sample Estimated Cost: $68.25 |
| FIJI Software | Open-source | Download from https://imagej.net/software/fiji/downloads Estimated Cost: Free |
|
| Hot Plate/ Stirrer | Corning | 6795-220 | For preparing sample solutions Estimated Cost: $550 |
| K-Cube Brushed Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Drives Z825B Estimated Cost: $757.51 |
| Kinematic Mount | Thorlabs | KM100S | To mount dichroic Estimated Cost: $92.01 |
| Kinesis Software | Thorlabs | Download from https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Estimated Cost: Free |
|
| Laser Light Blocker | Thorlabs | LB1 | For ND filter reflections Estimated Cost: $57.65 |
| Laser Mount | custom made | 3D printed Estimated Cost: N/A |
|
| Laser Safety Screen (x2) | Thorlabs | TPS4 | For blocking stray laser light Estimated Cost: $92.02 |
| Laser Scanning Tube Lens | Thorlabs | TTL200MP | TL1 Estimated Cost: $1491 |
| Lens Mount (x10) | Thorlabs | LMR1 | To mount all lens and extra alignment mirror. Estimated Cost: $164.7 |
| Magnetic Ruler | Thorlabs | BHM4 | To check alignment Estimated Cost: $52.74 |
| Micro-Manager Software | Open-source | Download from https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Estimated Cost: Free |
|
| Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12550400 | For slide samples Estimated Cost: $123.9 |
| Microscope Stage | ASI | FTP-2000 with custom parts | To fine-translate samples Estimated Cost: ~$16,000 |
| Mini Vortex Mixer | VWR | 10153-688 | For sample preparation Estimated Cost: $152.64 |
| Motorized Actuator | Thorlabs | Z825B | To fine-translate M1 Estimated Cost: $729.07 |
| Mounted Standard Iris (x2) | Thorlabs | ID20 | At least 2 for alignment Estimated Cost: $118.02 |
| ND Filter Set | Thorlabs | NDK01 | To reduce excitation intensity Estimated Cost: $726.73 |
| Objective Lens 1 | Nikon | Plan Apo 60X/ 1.20 WI | O1 Estimated Cost: ~$15,000 |
| Objective Lens 2 | Nikon | TU Plan Fluor 100X/0.90 | O2 Estimated Cost: ~$6,000 |
| Objective Lens 3 | Mitutoyo | Plan Apo HR 50X/0.75 | O3 Estimated Cost: ~$6,800 |
| OPM Deskewing Software | Open-source | For image processing. Download from https://github.com/QI2lab/OPM Estimated Cost: Free |
|
| Photodiode Power Sensor | Thorlabs | S121C | For measuring laser intensity Estimated Cost: $379.68 |
| Positive Grid Distortion Target | Thorlabs | R1L3S3P | Brightfield alignment Estimated Cost: $267.87 |
| Power Meter Digital Console | Thorlabs | PM100D | For measuring laser intensity Estimated Cost: $1245.48 |
| Rhodamine 6G | Thermo Scientific | J62315.14 | For fluorescent coated slide sample Estimated Cost: $27.7 |
| Right-Angle Clamp for Posts | Thorlabs | RA90 | For M3 support and flip down mirror Estimated Cost: $32.46 |
| RMS-Threaded Cage Plate (x2) | Thorlabs | CP42 | For alignment laser Estimated Cost: $70.56 |
| Shear Plate 2.5-5.0 mm | Thorlabs | SI050P | Estimated Cost: $182.85 |
| Shear Plate 5.0-10.0 mm | Thorlabs | SI100P | Estimated Cost: $201.47 |
| Shear Plate 10.0-25.4 mm | Thorlabs | SI254P | Estimated Cost: $236.42 |
| Shear Plate Viewing Screen | Thorlabs | SIVS | Estimated Cost: $337.74 |
| Shearing Interferometer with 1-3 mm Plate | Thorlabs | SI035 | For checking collimation Estimated Cost: $465.85 |
| Slip-On Post Collar (x35) | Thorlabs | R2 | To maintain post height Estimated Cost: $208.25 |
| Slit | Thorlabs | VA100 | Estimated Cost: $294.64 |
| Slotted Lens Tube, 3" | Thorlabs | SM1L30C | For alignment laser Estimated Cost: $77.45 |
| Square Mirror, 1 x 1" | https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069&hvpos=&hvne tw=g&hvrand=1336734911900437 4691&hvpone=&hvptwo=&hvqmt= &hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=& hvlocphy=9031212&hvtargid=pla-1 943952718742&gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB&th=1 Estimated Cost: $14.76 |
||
| Stackable Lens Tube 1/2" (x3) | Thorlabs | SM1L05 | To mount CL1-3 Estimated Cost: $40.86 |
| Stackable Lens Tube 1" | Thorlabs | SM1L10 | To mount O3 Estimated Cost: $15.41 |
| Stackable Lens Tube 2" (x2) | Thorlabs | SM1L20 | For camera path Estimated Cost: $35.7 |
| Studded Pedestal Base Adapter (x37) | Thorlabs | BE1 | To attach post mounts to table Estimated Cost: $400.71 |
| Translating Lens Mount (x3) | Thorlabs | LM1XY | To fine-translate pinhole, O2 and O3 Estimated Cost: $441 |
| Translation Stage with Standard Micrometer (x2) | Thorlabs | PT1/M | TS1-2 Estimated Cost: $647.54 |
| Travel Manual Translation Stage | Thorlabs | CT1A | O3 cage translation mount Estimated Cost: $497.3 |
| Tube Lens | Nikon | MXA20696 | TL3 Estimated Cost: $359 |
| White Mounted LED | Thorlabs | MNWHL4 | Brightfield light source Estimated Cost: $171.28 |
| TOTAL ESTIMATED COST: $84,858.98 | |||
| The authors note that many parts were bought used. Here, we have attempted to reflect the retail price of all items, so the total cost can be greatly reduced by buying particular items used, especially the more expensive ones. | |||
| OPTIONAL COMPONENTS | |||
| Grasshopper3 USB3 | FLIR | GS3-U3-23S6C-C | For diagnostic checks during alignment. Acquisiton camera can be used instead, but requires realignment afterwards. Estimated Cost: $1089 |
References
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T.
- You, R., McGorty, R. Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter. Frontiers in Physics. 9, 760834 (2021).
- Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography. Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Dunsby, C. Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy. Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).
- Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
- Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy. Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).
- Yang, B., et al. Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution. Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).
- Wu, Y., et al. Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy. Optica. 3 (8), 897-910 (2016).
- Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization. Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).
- Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging. Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).
- Kim, J., et al. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).
- Sapoznik, E., et al. A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics. eLife. 9, e57681 (2020).
- Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).
- Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. Focusing super resolution on the cytoskeleton. F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).
- Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), (2019).
- Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites. Frontiers in Physics. 10, 1055441 (2022).
- Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html (2023).
- Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html (2023).
- Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform. bioRxiv. , (2021).
- Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P.
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
- Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols (2023).
- Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data. Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).
- Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: https://mitchison.hms.harvard.edu/home (2023).
- Research at Dogic Lab. , Available from: http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/ (2023).
- Watkins, S. C., St. Croix, C. M. Light sheet imaging comes of age. Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).
- Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S.
- Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
- Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119 (2022).
- Kim, K., et al. Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors. Physical Biology. 13 (5), 056002 (2016).
- Millett-Sikking, A., et al. High NA single-objective lightsheet. , (2019).
- Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. 3D adaptive optics in a light sheet microscope. Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).
- Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy. Scientific Reports. 12 (1), 1969 (2022).
- Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N.
