A Planta Espressione genica e editing genico nelle foglie di bambù Moso

Summary

In questo studio, nel bambù è stato sviluppato un nuovo metodo di espressione genica e di editing genetico mediato da Agrobacterium . Questo metodo ha notevolmente migliorato l’efficienza della convalida della funzione genica nel bambù, il che ha implicazioni significative per l’accelerazione del processo di selezione del bambù.

Abstract

Per il bambù è stato sviluppato un nuovo metodo di trasformazione genica delle piante, che evita la necessità di processi di induzione e rigenerazione del callo che richiedono tempo e lavoro. Questo metodo prevede l’espressione genica mediata da Agrobacterium tramite ferimento e vuoto per le piantine di bambù. Ha dimostrato con successo l’espressione di geni esogeni, come il reporter RUBY e il gene Cas9, nelle foglie di bambù. La più alta efficienza di trasformazione per l’accumulo di betalaina nelle piantine RUBY è stata raggiunta utilizzando il ceppo GV3101, con una percentuale dell’85,2% dopo l’infezione. Sebbene il DNA estraneo non si sia integrato nel genoma del bambù, il metodo è stato efficiente nell’esprimere i geni esogeni. Inoltre, è stato sviluppato anche un sistema di editing genetico con un reporter nativo che utilizza questo metodo, da cui è stato generato un mutante in situ generato dal gene modificato della violaxantina de-epossidasi di bambù (PeVDE) in foglie di bambù, con un tasso di mutazione del 17,33%. La mutazione di PeVDE ha portato a una diminuzione dei valori di tempra non fotochimica (NPQ) in condizioni di luce elevata, che possono essere rilevati con precisione da un fluorimetro. Questo rende il PeVDE modificato un potenziale reporter nativo sia per i geni esogeni che per quelli endogeni nel bambù. Con il reporter di PeVDE, un gene della cinnamoil-CoA reduttasi è stato modificato con successo con un tasso di mutazione dell’8,3%. Questa operazione evita il processo di coltura tissutale o induzione del callo, che è rapido ed efficiente per l’espressione di geni esogeni e l’editing genetico endogeno nel bambù. Questo metodo può migliorare l’efficienza della verifica della funzione genica e aiuterà a rivelare i meccanismi molecolari delle principali vie metaboliche nel bambù.

Introduction

Lo studio della funzione genica nel bambù è molto promettente per la comprensione avanzata del bambù e per sbloccare il suo potenziale di modificazione genetica. Un modo efficace per raggiungere questo obiettivo può essere raggiunto attraverso il processo di infezione mediata da Agrobacterium nelle foglie di bambù, in cui il frammento di T-DNA contenente geni esogeni viene introdotto nelle cellule, portando successivamente all’espressione dei geni all’interno delle cellule fogliari.

Il bambù è una risorsa preziosa e rinnovabile con una vasta gamma di applicazioni nella produzione, nell’arte e nella ricerca. Il bambù possiede eccellenti proprietà del legno come elevata resistenza meccanica, tenacità, rigidità moderata e flessibilità¹, che ora è ampiamente utilizzato in una varietà di forniture domestiche e industriali, tra cui spazzolini da denti, cannucce, bottoni, stoviglie usa e getta, condutture sotterranee e riempitivi per torri di raffreddamento per la generazione di energia termica. Pertanto, la coltivazione del bambù svolge un ruolo cruciale nell’ottenere varietà di bambù con eccellenti proprietà del legno per sostituire la plastica e ridurre l’uso di plastica, proteggere l’ambiente e affrontare il cambiamento climatico, oltre a generare un valore economico significativo.

Tuttavia, l’allevamento tradizionale del bambù deve affrontare sfide a causa della lunga fase di crescita vegetativa e del periodo di fioritura incerto. Sebbene le tecniche di selezione molecolare siano state sviluppate e applicate all’allevamento del bambù, il processo di trasformazione genica del bambù richiede tempo, lavoro e complicazione a causa dei processi di induzione e rigenerazione del callo 2,3,4,5. La trasformazione genetica stabile richiede spesso metodi mediati da Agrobacterium, che coinvolgono processi di coltura tissutale come l’induzione e la rigenerazione del callo. Tuttavia, il bambù ha una bassa capacità di rigenerazione del callo, limitando notevolmente l’applicazione della trasformazione genetica stabile nel bambù. Dopo che l’Agrobacterium ha infettato le cellule vegetali, il frammento di T-DNA entra nelle cellule vegetali, con la maggior parte dei frammenti di T-DNA che rimangono non integrati nelle cellule, con conseguente espressione transitoria. Solo una piccola porzione di frammenti di T-DNA si integra in modo casuale nel suo cromosoma, portando a un’espressione stabile. I livelli di espressione transitori mostrano una curva di accumulo che può variare per ogni gene espresso da un T-DNA consegnato da Agrobacterium. Nella maggior parte dei casi, i livelli di espressione più elevati si verificano 3-4 giorni dopo l’infiltrazione e diminuiscono rapidamente dopo 5-6 giorni ^6,7. Studi precedenti hanno dimostrato che più di 1/3 delle mutazioni in piante geneticamente modificate ottenute senza pressione selettiva per la resistenza provengono dall’espressione transitoria di CRISPR/Cas9, mentre i restanti meno di 2/3 provengono dall’espressione stabile dopo l’integrazione del DNA nel genoma⁸. Ciò indica che l’integrazione del T-DNA nel genoma della pianta non è necessaria per l’editing genetico. Inoltre, la pressione selettiva per la resistenza inibisce significativamente la crescita di cellule non transgeniche, influenzando direttamente il processo di rigenerazione degli espianti infetti. Pertanto, utilizzando l’espressione transitoria senza pressione selettiva per la resistenza nel bambù, è possibile ottenere un’espressione non integrata di geni esogeni e studiare la funzione genica direttamente negli organi vegetali. Quindi, è possibile sviluppare un metodo semplice e rapido per l’espressione e l’editing genico esogeno nel bambù⁹.

Il metodo sviluppato per l’espressione genica esogena e l’editing genetico si caratterizzano per la semplicità, l’economicità e l’assenza di apparecchiature costose o procedure complesse⁹. In questo metodo, il gene endogeno della violaxantina de-epossidasi del bambù (PeVDE) è stato utilizzato come reporter per l’espressione genica esogena senza pressione selettiva. Questo perché il PeVDE modificato nelle foglie di bambù riduce la capacità di fotoprotezione in condizioni di luce intensa e dimostra una diminuzione del valore di tempra non fotochimica (NPQ), che può essere rilevato attraverso l’imaging a fluorescenza della clorofilla. Per dimostrare l’efficacia di questo metodo, un altro gene endogeno del bambù, il gene della cinnamoil-CoA reduttasi (PeCCR5)⁹, è stato eliminato utilizzando questo sistema e ha generato con successo mutanti di questo gene. Questa tecnica può essere utilizzata per la caratterizzazione funzionale di geni che hanno funzioni nelle foglie di bambù. Sovraesprimendo questi geni in modo transitorio nelle foglie di bambù, i loro livelli di espressione possono essere migliorati o, mediante l’editing genetico, la loro espressione può essere abbattuta, consentendo lo studio dei livelli di espressione genica a valle, dei fenotipi fogliari e del contenuto del prodotto. Ciò fornisce un approccio più efficiente e fattibile per la ricerca sulla funzione genica nel bambù. Questa tecnica può essere applicata alla caratterizzazione funzionale dei geni che funzionano nelle foglie di bambù. Sovraesprimendo questi geni in modo transitorio nelle foglie di bambù, i loro livelli di espressione possono essere migliorati o, mediante l’editing genetico, la loro espressione può essere abbattuta, consentendo lo studio dei livelli di espressione genica a valle, dei fenotipi fogliari e del contenuto del prodotto. Inoltre, è importante notare che, a causa dell’estesa poliploidizzazione, la maggior parte dei geni commercialmente importanti nei genomi di bambù sono presenti in più copie, con conseguente ridondanza genetica. Ciò rappresenta una sfida per l’esecuzione dell’editing del genoma multiplex nel bambù. Prima di applicare tecniche di trasformazione genetica stabile o di editing genetico, è fondamentale convalidare rapidamente le funzioni geniche. Nell’affrontare il problema delle copie multiple del gene, un approccio consiste nell’analizzare i profili di espressione del trascrittoma per identificare i geni che sono attivamente espressi durante fasi specifiche. Inoltre, il targeting dei domini funzionali conservati di queste copie geniche consente la progettazione di sequenze target comuni o l’incorporazione di più siti target nello stesso vettore CRISPR/Cas9, consentendo il knockout simultaneo di questi geni. Ciò fornisce un approccio più efficiente e fattibile per la ricerca sulla funzione genica nel bambù.

Protocol

1. Preparazione delle piantine di bambù Prepara piantine di bambù moso (Phyllostachys edulis) utilizzando semi raccolti a Guilin, Guangxi, Cina. Inizia immergendo i semi in acqua per 2-3 giorni, assicurandoti di cambiare l’acqua ogni giorno. Successivamente, crea un substrato mescolando terreno e vermiculite in un rapporto di 3:1. Semina i semi imbevuti nel substrato per la germinazione. Mantenere le piantine in condizioni di laboratorio, mantenendo la temperatura tra i 18-…

Representative Results

Agrobatterio-mediato nell’espressione genica delle piante nelle foglie di bambùÈ stato dimostrato che il gene reporter RUBY è efficace nella visualizzazione dell’espressione genica transitoria grazie alla sua capacità di produrre betalaina rossa vivida dalla tirosina10. In questo studio, la trasformazione mediata da Agrobacterium è stata utilizzata per esprimere transitoriamente il gene esogeno RUBY nelle foglie di bambù (<str…

Discussion

Questo metodo riduce significativamente il tempo necessario rispetto ai metodi di trasformazione genetica tradizionali, che in genere richiedono 1-2 anni, e raggiunge l’espressione transitoria dei geni esogeni e l’editing genetico dei geni endogeni entro 5 giorni. Tuttavia, questo metodo ha dei limiti in quanto può trasformare solo una piccola percentuale di cellule e le foglie geneticamente modificate sono chimeriche e non hanno la capacità di rigenerarsi in piante complete. Ciononostante, questa tecnologia di espress…

Materials

35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.