В Планте Экспрессия генов и редактирование генов в листьях бамбука мосо
Summary
В этом исследовании был разработан новый метод экспрессии генов in planta и редактирования генов, опосредованный агробактериями , в бамбуке. Этот метод значительно повысил эффективность валидации функций генов у бамбука, что имеет значительные последствия для ускорения процесса размножения бамбука.
Abstract
Для бамбука был разработан новый метод трансформации генов in planta , который позволяет избежать необходимости в длительных и трудоемких процессах индукции и регенерации каллуса. Этот метод включает в себя экспрессию генов, опосредованную агробактериями, через ранение и вакуум для саженцев бамбука. Он успешно продемонстрировал экспрессию экзогенных генов, таких как репортер RUBY и ген Cas9 , в листьях бамбука. Наибольшая эффективность трансформации для накопления беталаина в проростках RUBY была достигнута при использовании штамма GV3101, с процентом 85,2% после заражения. Несмотря на то, что чужеродная ДНК не интегрировалась в геном бамбука, метод оказался эффективным в экспрессии экзогенных генов. Кроме того, с использованием этого метода была разработана система редактирования генов, из которой был получен мутант in situ , сгенерированный отредактированным геном бамбуковой виолаксантиндеэпоксидазы (PeVDE) в листьях бамбука с частотой мутаций 17,33%. Мутация гена PeVDE привела к снижению значений нефотохимического тушения (NPQ) при сильном освещении, что может быть точно обнаружено флуориметром. Это делает отредактированный PeVDE потенциальным нативным репортером как для экзогенных, так и для эндогенных генов бамбука. С помощью репортера PeVDE был успешно отредактирован ген циннамоил-КоА-редуктазы с частотой мутаций 8,3%. Эта операция позволяет избежать процесса культивирования тканей или индукции каллуса, что является быстрым и эффективным для экспрессии экзогенных генов и эндогенного редактирования генов в бамбуке. Этот метод может повысить эффективность верификации функций генов и поможет выявить молекулярные механизмы ключевых метаболических путей в бамбуке.
Introduction
Исследование функции генов бамбука имеет большие перспективы для углубленного понимания бамбука и раскрытия его потенциала для генетической модификации. Эффективный способ достижения этой цели может быть достигнут с помощью процесса агробактериальной инфекции в листьях бамбука, при котором фрагмент Т-ДНК, содержащий экзогенные гены, вводится в клетки, что впоследствии приводит к экспрессии генов в клетках листьев.
Бамбук является ценным и возобновляемым ресурсом с широким спектром применения в производстве, искусстве и исследованиях. Бамбук обладает превосходными свойствами древесины, такими как высокая механическая прочность, ударная вязкость, умеренная жесткость и гибкость1, который в настоящее время широко используется в различных бытовых и промышленных расходных материалах, включая зубные щетки, соломинки, пуговицы, одноразовую посуду, подземные трубопроводы и наполнители градирен для выработки тепловой энергии. Таким образом, разведение бамбука играет решающую роль в получении сортов бамбука с отличными свойствами древесины для замены пластика и сокращения использования пластика, защиты окружающей среды и борьбы с изменением климата, а также создания значительной экономической ценности.
Тем не менее, традиционное разведение бамбука сталкивается с проблемами из-за длительной стадии вегетативного роста и неопределенного периода цветения. Несмотря на то, что методы молекулярной селекции были разработаны и применены для селекции бамбука, процесс трансформации гена бамбука является трудоемким, трудоемким и сложным из-за процессов индукции и регенерации каллуса 2,3,4,5. Стабильная генетическая трансформация часто требует агробактериальных методов, которые включают процессы культивирования тканей, такие как индукция и регенерация каллуса. Однако бамбук обладает низкой способностью к регенерации каллусов, что значительно ограничивает применение стабильной генетической трансформации в бамбуке. После того, как Agrobacterium заражает растительные клетки, фрагмент Т-ДНК проникает в растительные клетки, при этом большинство фрагментов Т-ДНК остаются неинтегрированными в клетках, что приводит к транзиторной экспрессии. Лишь небольшая часть фрагментов Т-ДНК случайным образом интегрируется в ее хромосому, что приводит к стабильной экспрессии. Уровни транзиторной экспрессии показывают кривую накопления, которая может варьироваться для каждого гена, экспрессируемого из Т-ДНК, доставляемой агробактериями. В большинстве случаев самые высокие уровни экспрессии возникают через 3-4 дня после инфильтрации и быстро снижаются через 5-6 дней 6,7. Предыдущие исследования показали, что более 1/3 мутаций в генетически отредактированных растениях, полученных без давления отбора на резистентность, происходят от транзиторной экспрессии CRISPR/Cas9, в то время как оставшиеся менее 2/3 происходят от стабильной экспрессии после интеграции ДНК в геном8. Это указывает на то, что интеграция Т-ДНК в геном растения не является необходимой для редактирования генов. Более того, давление отбора на резистентность значительно ингибирует рост нетрансгенных клеток, непосредственно влияя на процесс регенерации инфицированных эксплантов. Таким образом, используя переходную экспрессию без давления отбора для резистентности у бамбука, можно добиться неинтегрированной экспрессии экзогенных генов и изучать функцию генов непосредственно в органах растений. Таким образом, можно разработать простой и экономящий время метод экспрессии и редактирования экзогенных генов в бамбуке9.
Разработанный метод экзогенной экспрессии генов и редактирования генов характеризуется простотой, экономичностью, отсутствием дорогостоящего оборудования и сложных процедур9. В этом методе бамбуковый эндогенный ген виолаксантиндеэпоксидазы (PeVDE) был использован в качестве репортера для экзогенной экспрессии генов без давления отбора. Это связано с тем, что отредактированный PeVDE в листьях бамбука снижает способность к фотозащите при сильном освещении и демонстрирует снижение значения нефотохимического гашения (NPQ), которое может быть обнаружено с помощью флуоресцентной визуализации хлорофилла. Чтобы продемонстрировать эффективность этого метода, с помощью этой системы был нокаутирован еще один эндогенный ген бамбука — ген циннамоил-КоА-редуктазы (PeCCR5)9 и успешно сгенерирован мутант этого гена. Этот метод может быть использован для функциональной характеристики генов, выполняющих функции в листьях бамбука. Путем гиперэкспрессии этих генов в листьях бамбука можно повысить уровень их экспрессии, а путем редактирования генов их экспрессия может быть снижена, что позволяет изучать уровни экспрессии генов, фенотипы листьев и состав продукта. Это обеспечивает более эффективный и осуществимый подход к исследованию функции генов в бамбуке. Этот метод может быть применен для функциональной характеристики генов, которые функционируют в листьях бамбука. Путем гиперэкспрессии этих генов в листьях бамбука можно повысить уровень их экспрессии, а путем редактирования генов их экспрессия может быть снижена, что позволяет изучать уровни экспрессии генов, фенотипы листьев и состав продукта. Кроме того, важно отметить, что из-за обширной полиплоидизации большинство коммерчески важных генов в геномах бамбука присутствуют в нескольких копиях, что приводит к генетической избыточности. Это создает проблему для выполнения мультиплексного редактирования генома в бамбуке. Прежде чем применять методы стабильной генетической трансформации или редактирования генов, крайне важно быстро проверить функции генов. При решении проблемы множественных копий генов один из подходов заключается в анализе профилей экспрессии транскриптома для выявления генов, которые активно экспрессируются на определенных стадиях. Кроме того, нацеливание на консервативные функциональные домены этих копий генов позволяет создавать общие целевые последовательности или включать несколько сайтов-мишеней в один и тот же вектор CRISPR/Cas9, обеспечивая одновременный нокаут этих генов. Это обеспечивает более эффективный и осуществимый подход к исследованию функции генов в бамбуке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод значительно сокращает необходимое время по сравнению с традиционными методами генетической трансформации, которые обычно занимают 1-2 года, и обеспечивает транзиторную экспрессию экзогенных генов и редактирование генов эндогенных генов в течение 5 дней. Тем не менее, этот м?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность за финансовую поддержку Национальной программе ключевых исследований и разработок Китая (грант No 2021YFD2200502), Национальному фонду естественных наук Китая (грант No 31971736).
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
References
- Jiang, Z. H. . World Bamboo and Rattan (in Chinese). , (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant. Frontiers in Plant Science. 8, 1298 (2017).
- Ye, S., et al. Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro). Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).
- Xiang, M., et al. Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis. Planta. 254 (3), 50 (2021).
- Huang, B., et al. An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis). Frontiers in Plant Science. 13, 822022 (2022).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Chen, L., et al. A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants. Horticulture Research. 5, 13 (2018).
- Sun, H., et al. A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves. Plant Methods. 19 (1), 20 (2023).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice. Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).
- McCormick, S., et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).
- Lou, Y., et al. a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light. Frontiers in Plant Science. 13, 927949 (2022).
- Zhou, R., et al. Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).
- De Roeck, A., et al. Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).
