플란타에 위치 Moso Bamboo Leaves의 유전자 발현 및 유전자 편집
Summary
본 연구에서는 대나무에서 아그로박테리움(Agrobacterium)을 매개로 하는 식물 유전자 발현 및 유전자 편집 방법의 새로운 방법을 개발하였다. 이 방법은 대나무의 유전자 기능 검증의 효율성을 크게 향상시켰으며, 이는 대나무 번식 과정을 가속화하는 데 중요한 의미를 갖습니다.
Abstract
대나무에 대한 새로운 식물 유전자 형질 전환 방법이 개발되어 시간이 많이 걸리고 노동 집약적인 굳은살 유도 및 재생 과정이 필요하지 않습니다. 이 방법은 대나무 묘목에 대한 상처 및 진공을 통한 Agrobacterium 매개 유전자 발현을 포함합니다. 대나무 잎에서 RUBY 리포터 및 Cas9 유전자와 같은 외인성 유전자의 발현을 성공적으로 입증했습니다. 루비 묘목에서 베타린 축적에 대한 가장 높은 형질전환 효율은 GV3101 균주를 사용하여 감염 후 85.2%의 비율로 달성되었습니다. 외래 DNA는 대나무 게놈에 통합되지 않았지만 이 방법은 외인성 유전자를 발현하는 데 효율적이었습니다. 또한, 이 방법을 사용하여 토착 리포터와 함께 유전자 편집 시스템도 개발되었는데, 이 방법에서 대나무 잎에서 편집된 대나무 비올라잔틴 탈에폭시다제 유전자(PeVDE)에 의해 생성된 in situ 돌연변이가 17.33%의 돌연변이율을 보입니다. PeVDE의 돌연변이로 인해 형광계로 정확하게 감지할 수 있는 높은 조명 하에서 비광화학적 담금질(NPQ) 값이 감소했습니다. 이것은 편집된 PeVDE를 대나무의 외인성 및 내인성 유전자 모두에 대한 잠재적인 네이티브 리포터로 만듭니다. PeVDE의 리포터와 함께 cinnamoyl-CoA reductase 유전자를 8.3%의 돌연변이율로 성공적으로 편집했습니다. 이 수술은 조직 배양 또는 굳은살 유도 과정을 피하여 대나무에서 외인성 유전자 및 내인성 유전자 편집을 빠르고 효율적으로 발현합니다. 이 방법은 유전자 기능 검증의 효율성을 향상시킬 수 있으며 대나무의 주요 대사 경로의 분자 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
대나무의 유전자 기능에 대한 연구는 대나무에 대한 이해를 높이고 유전자 변형의 가능성을 여는 데 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이것의 효과적인 방법은 대나무 잎에 있는 Agrobacterium-mediated 감염의 과정을 통해 달성될 수 있다, 외인성 유전자를 포함하는 T-DNA 파편이 세포로 소개되는, 이어서 잎 세포 내의 유전자의 발현으로 이끌어 내는.
대나무는 제조, 예술 및 연구 분야에서 광범위하게 응용되는 귀중하고 재생 가능한 자원입니다. 대나무는 높은 기계적 강도, 인성, 적당한 강성 및 유연성1과 같은 우수한 목재 특성을 가지고 있으며 현재 칫솔, 빨대, 단추, 일회용 식기, 지하 파이프 라인 및 화력 발전용 냉각탑 충진재를 포함한 다양한 가정 및 산업 용품에 널리 사용됩니다. 따라서 대나무 육종은 플라스틱을 대체하고 플라스틱 사용량을 줄이며 환경을 보호하고 기후 변화에 대처할 수 있는 우수한 목재 특성을 가진 대나무 품종을 확보하고 상당한 경제적 가치를 창출하는 데 중요한 역할을 합니다.
그러나 전통적인 대나무 육종은 긴 식물 성장 단계와 불확실한 개화 기간으로 인해 어려움에 직면해 있습니다. 분자 육종 기술이 개발되어 대나무 육종에 적용되었지만, 대나무 유전자 형질전환 과정은 굳은살 유도 및 재생 과정 2,3,4,5로 인해 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 복잡합니다. 안정적인 유전자 형질전환을 위해서는 굳은살 유도 및 재생과 같은 조직 배양 과정을 포함하는 아그로박테리움 매개 방법이 필요한 경우가 많습니다. 그러나 대나무는 굳은살 재생 능력이 낮아 대나무에서 안정적인 유전자 변형의 적용을 크게 제한합니다. 아그로박테리움이 식물 세포를 감염시킨 후, T-DNA 단편은 식물 세포로 들어가고, 대부분의 T-DNA 단편은 세포에 통합되지 않은 상태로 남아 일시적인 발현을 초래합니다. T-DNA 단편의 작은 부분만이 염색체에 무작위로 통합되어 안정적인 발현을 유도합니다. 일시적인 발현 수준은 Agrobacterium-delivered T-DNA에서 발현된 각 유전자에 대해 달라질 수 있는 축적 곡선을 보여줍니다. 대부분의 경우, 가장 높은 발현 수준은 침윤 후 3-4일 후에 발생하고 5-6일 후에 빠르게 감소한다 6,7. 이전 연구에 따르면 내성에 대한 선택 압력 없이 얻은 유전자 편집 식물의 돌연변이 중 1/3 이상은 CRISPR/Cas9의 일시적인 발현에서 비롯되는 반면, 나머지 2/3 미만은 게놈8에 DNA가 통합된 후 안정적인 발현에서 비롯됩니다. 이것은 식물 게놈에 T-DNA를 통합하는 것이 유전자 편집에 필요하지 않다는 것을 나타냅니다. 더욱이, 내성에 대한 선택 압력은 유전자 변형되지 않은 세포의 성장을 현저히 억제하여 감염된 외식물의 재생 과정에 직접적인 영향을 미칩니다. 따라서 대나무에서 저항성에 대한 선택 압력이 없는 일시적 발현을 사용함으로써 외인성 유전자의 비통합적 발현을 달성하고 식물 기관에서 직접 유전자 기능을 연구할 수 있습니다. 따라서 대나무에서 외인성 유전자 발현 및 편집을 위한 쉽고 시간 절약적인 방법을 개발할 수 있다9.
개발된 외인성 유전자 발현 및 유전자 편집 방법은 단순성, 비용 효율성, 고가의 장비나 복잡한 절차가 없는 것이 특징이다9. 이 방법에서는 대나무 내인성 비올라잔틴 탈에폭시다제 유전자(PeVDE)를 선택 압력 없이 외인성 유전자 발현을 위한 리포터로 사용하였다. 이는 대나무 잎에서 편집된 PeVDE 가 높은 조명 하에서 광보호 능력을 감소시키고 엽록소 형광 이미징을 통해 검출할 수 있는 비광화학 담금질(NPQ) 값의 감소를 보여주기 때문입니다. 이 방법의 효과를 입증하기 위해 또 다른 대나무 내인성 유전자인 cinnamoyl-CoA 환원효소 유전자(PeCCR5)9를 이 시스템을 사용하여 녹아웃하고 이 유전자의 돌연변이를 성공적으로 생성했습니다. 이 기술은 대나무 잎에서 기능을 하는 유전자의 기능적 특성 분석에 사용할 수 있습니다. 대나무 잎에서 이러한 유전자를 일시적으로 과발현시킴으로써 발현 수준을 향상시키거나 유전자 편집을 통해 발현을 낮출 수 있어 다운스트림 유전자 발현 수준, 잎 표현형 및 제품 함량을 연구할 수 있습니다. 이는 대나무의 유전자 기능 연구를 위한 보다 효율적이고 실현 가능한 접근 방식을 제공합니다. 이 기술은 대나무 잎에서 기능하는 유전자의 기능적 특성화에 적용될 수 있습니다. 대나무 잎에서 이러한 유전자를 일시적으로 과발현시킴으로써 발현 수준을 향상시키거나 유전자 편집을 통해 발현을 낮출 수 있어 다운스트림 유전자 발현 수준, 잎 표현형 및 제품 함량을 연구할 수 있습니다. 또한 광범위한 배수체화로 인해 대나무 게놈에서 상업적으로 중요한 유전자의 대부분이 여러 사본에 존재하여 유전적 중복이 발생한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이것은 대나무에서 다중 게놈 편집을 수행하는 데 어려움을 제기합니다. 안정적인 유전자 형질전환 또는 유전자 편집 기술을 적용하기 전에 유전자 기능을 신속하게 검증하는 것이 중요합니다. 다중 유전자 복제 문제를 해결하는 데 있어 한 가지 접근 방식은 전사체 발현 프로파일을 분석하여 특정 단계에서 활발하게 발현되는 유전자를 식별하는 것입니다. 또한, 이러한 유전자 복제의 보존된 기능 도메인을 표적으로 삼으면 공통 표적 염기서열을 설계하거나 동일한 CRISPR/Cas9 벡터에 여러 표적 부위를 통합할 수 있어 이러한 유전자를 동시에 knockout할 수 있습니다. 이는 대나무의 유전자 기능 연구를 위한 보다 효율적이고 실현 가능한 접근 방식을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법은 일반적으로 1-2년이 소요되는 기존의 유전자 형질전환 방법에 비해 소요 시간을 크게 단축하고 5일 이내에 외인성 유전자의 일시적인 발현과 내인성 유전자의 유전자 편집을 달성합니다. 그러나 이 방법은 극히 일부의 세포만 변형시킬 수 있고, 유전자 편집 잎은 키메라성이며 완전한 식물로 재생되는 능력이 부족하기 때문에 한계가 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 식물 유?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 재정 지원을 해준 중국 국가 중점 연구 개발 프로그램(보조금 번호 2021YFD2200502), 중국 국립 자연과학 재단(보조금 번호 31971736)에 감사의 뜻을 전합니다.
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
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