都市: Planta(プランタ) 孝宗竹葉の遺伝子発現と遺伝子編集
Summary
本研究では、アグロバクテリウムを媒介とするオオバコの遺伝子発現と遺伝子編集法の新規手法を竹で開発した。この手法は、竹の遺伝子機能検証の効率を大幅に向上させ、竹の育種プロセスを加速する上で重要な意味を持ちます。
Abstract
竹では、時間と労力のかかるカルスの誘導と再生プロセスの必要性を回避する新しいプランタ遺伝子形質転換法が開発されました。この方法では、竹の苗木の傷付けと真空によるアグロバクテリウムを介した遺伝子発現が含まれます。笹の葉において、RUBYレポーターやCas9遺伝子などの外因性遺伝子の発現を実証することに成功しました。RUBY苗木におけるベタレインの蓄積に対する最高の形質転換効率は、GV3101株を用いて達成され、感染後の比率は85.2%であった。外来DNAは竹のゲノムに組み込まれなかったが、外因性遺伝子の発現には効率的であった。さらに、この手法を用いてネイティブレポーターを用いた遺伝子編集システムも開発し、そこから笹の葉で編集された竹のビオラキサンチン脱エポキシダーゼ遺伝子(PeVDE)によって生成されたin situ変異体から、突然変異率17.33%を達成しました。PeVDEの変異により、高光下での非光化学的消光(NPQ)値が低下しましたが、これは蛍光光度計で正確に検出できます。これにより、編集されたPeVDEは、竹の外因性遺伝子と内因性遺伝子の両方のネイティブレポーターになる可能性があります。PeVDEのレポーターにより、シナモイルCoAレダクターゼ遺伝子の編集に成功し、突然変異率は8.3%でした。この操作により、組織培養やカルス誘導のプロセスが回避され、竹の外因性遺伝子や内在性遺伝子編集を迅速かつ効率的に発現させることができます。この手法は、遺伝子機能検証の効率を向上させ、竹の主要な代謝経路の分子メカニズムを明らかにするのに役立ちます。
Introduction
竹の遺伝子機能の研究は、竹の高度な理解と遺伝子組み換えの可能性を解き放つ上で大きな期待を寄せています。そのための有効な方法は、外因性遺伝子を含むT-DNA断片を細胞内に導入し、葉の細胞内で遺伝子を発現させるア グロバクテリウム感染のプロセスです。
竹は貴重で再生可能な資源であり、製造、芸術、研究など幅広い用途があります。竹は、高い機械的強度、靭性、適度な剛性、柔軟性※1などの優れた木材特性を有しており、現在では、歯ブラシ、ストロー、ボタン、使い捨て食器、地下パイプライン、火力発電用冷却塔充填材など、さまざまな家庭用品や工業用品に広く使用されています。したがって、竹育種は、プラスチックの代替やプラスチック使用量の削減、環境保護、気候変動への取り組み、および大きな経済的価値を生み出すための優れた木材特性を備えた竹品種を取得する上で重要な役割を果たします。
しかし、従来の竹の育種は、栄養成長段階が長く、開花期が不確実であるため、課題に直面しています。分子育種技術が開発され、竹の育種に応用されていますが、竹の遺伝子形質転換のプロセスは、カルスの誘導と再生のプロセスのために時間と労力がかかり、複雑です2,3,4,5。安定した遺伝子形質転換には、カルスの誘導や再生などの組織培養プロセスを含むアグロバクテリウムを介した方法が必要になることがよくあります。しかし、竹はカルスの再生能力が低いため、竹の安定した遺伝子組み換えの適用は大きく制限されています。アグロバクテリウムが植物細胞に感染した後、T-DNA断片は植物細胞に侵入し、T-DNA断片の大部分は細胞内に未統合のままであり、一過性の発現をもたらします。T-DNA断片のごく一部のみが染色体にランダムに統合され、安定した発現につながります。一過性の発現レベルは、アグロバクテリウムが送達したT-DNAから発現する遺伝子ごとに異なる蓄積曲線を示しています。ほとんどの場合、最高の発現レベルは浸潤後3〜4日で発生し、5〜6日後に急速に低下します6,7。これまでの研究で、遺伝子編集された植物の変異の1/3以上はCRISPR/Cas9の一過性発現に由来し、残りの2/3未満はDNAをゲノムに組み込んだ後の安定発現に由来することが示されています8。このことは、T-DNAの植物ゲノムへの組み込みが遺伝子編集に必要ではないことを示しています。さらに、耐性の選択圧は、非トランスジェニック細胞の増殖を有意に阻害し、感染した外植片の再生プロセスに直接影響します。そこで、竹において抵抗性に対する選択圧を伴わない一過性発現を用いることで、外来性遺伝子の非統合的発現を実現し、植物器官における遺伝子機能を直接研究することが可能となります。したがって、竹9における外因性遺伝子発現および編集のための簡単で時間を節約する方法を開発できる。
開発された外因性遺伝子発現および遺伝子編集法は、その簡便性、費用対効果、および高価な機器または複雑な手順の不在によって特徴付けられる9。この方法では、竹の内在性ビオラキサンチン脱エポキシダーゼ遺伝子(PeVDE)を、選択圧なしで外因性遺伝子発現のレポーターとして使用しました。これは、笹の葉で編集された PeVDE が、強い光の下での光保護能力を低下させ、クロロフィル蛍光イメージングで検出できる非光化学的消光(NPQ)値の低下を示すためです。この手法の有効性を実証するために、別の竹内在性遺伝子であるシナモイルCoAレダクターゼ遺伝子(PeCCR5)9をノックアウトし、この遺伝子の変異体を作製することに成功しました。この手法は、笹の葉に機能を持つ遺伝子の機能解析に利用することができます。これらの遺伝子を笹の葉で一過性に過剰発現させることで、その発現レベルを高めたり、遺伝子編集によってその発現をノックダウンしたりして、下流の遺伝子発現レベル、葉の表現型、および製品の内容を調べることができます。これにより、竹の遺伝子機能研究のためのより効率的で実現可能なアプローチが提供されます。この手法は、笹の葉で機能する遺伝子の機能解析に応用できます。これらの遺伝子を笹の葉で一過性に過剰発現させることで、その発現レベルを高めたり、遺伝子編集によってその発現をノックダウンしたりして、下流の遺伝子発現レベル、葉の表現型、および製品の内容を調べることができます。さらに、広範な倍数化により、竹のゲノムにおける商業的に重要な遺伝子の大部分が複数のコピーに存在し、遺伝的冗長性が生じることに注意することが重要です。これは、竹で多重ゲノム編集を行う上で課題を提起します。安定した遺伝子組み換えや遺伝子編集技術を適用する前に、遺伝子機能を迅速に検証することが重要です。複数の遺伝子コピーの問題に対処する場合、トランスクリプトームの発現プロファイルを解析して、特定の段階で活発に発現する遺伝子を特定する方法の1つが挙げられます。さらに、これらの遺伝子コピーの保存された機能ドメインを標的とすることで、共通の標的配列を設計したり、複数の標的部位を同じCRISPR/Cas9ベクターに組み込んだりすることができ、これらの遺伝子の同時ノックアウトが可能になります。これにより、竹の遺伝子機能研究のためのより効率的で実現可能なアプローチが提供されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この手法は、通常1〜2年かかる従来の遺伝子組み換え法と比較して、所要時間を大幅に短縮し、外因性遺伝子の一過性発現と内在性遺伝子のゲノム編集を5日以内に実現します。しかし、この方法では、ごく一部の細胞しか形質転換できず、遺伝子編集された葉はキメラ性であり、完全な植物に再生する能力に欠けるため、限界があります。しかし、オ オバコ の遺伝子発現と遺伝子編?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、中国国家重点研究開発プログラム(助成金番号2021YFD2200502)、中国国家自然科学基金会(助成金番号31971736)の財政的支援に感謝します。
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
References
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