在普兰塔 毛竹叶片基因表达与基因编辑
Summary
本研究以农杆菌为研究对象，研究了一种新型的农杆菌介导的植物基因表达和基因编辑方法。该方法大大提高了竹子基因功能验证的效率，对加快竹子育种进程具有重要意义。
Abstract
开发了一种针对竹子的植物基因转化方法，避免了费时费力的愈伤组织诱导和再生过程。该方法涉及农杆菌介导的基因表达，通过刺伤和真空对竹苗进行。它成功地证明了外源基因的表达，如RUBY报告基因和Cas9基因在竹叶中的表达。使用GV3101菌株对红宝石幼苗中甜菜碱的积累转化效率最高，感染后转化率为85.2%。虽然外源DNA没有整合到竹基因组中，但该方法在表达外源基因方面是有效的。此外，利用该方法，利用天然报告基因开发了一种基因编辑系统，从中编辑的竹叶黄质去环氧化酶基因（PeVDE）在竹叶中产生了原位突变体，突变率为17.33%。PeVDE的突变导致高光下非光化学猝灭（NPQ）值降低，荧光计可以准确检测。这使得编辑后的PeVDE成为竹子中外源和内源基因的潜在天然报告基因。利用PeVDE的报告基因，成功编辑了一个肉桂酰辅酶A还原酶基因，突变率为8.3%。该操作避免了组织培养或愈伤组织诱导的过程，对于竹子中表达外源基因和内源基因编辑是快速有效的。该方法可以提高基因功能验证的效率，有助于揭示竹子关键代谢途径的分子机制。
Introduction
对竹子基因功能的研究为进一步了解竹子和释放其基因改造潜力带来了巨大的希望。一种有效的方法可以通过 农杆菌介导的竹叶感染过程来实现，其中含有外源基因的T-DNA片段被引入细胞中，随后导致基因在叶细胞内的表达。
竹子是一种宝贵的可再生资源，在制造、艺术和研究方面有着广泛的应用。竹子具有机械强度高、韧性好、刚度适中、柔韧性好等优良的木材性能1，现已广泛应用于各种家用和工业用品中，包括牙刷、吸管、纽扣、一次性餐具、地下管道、火力发电用冷却塔填料等。因此，竹子育种对于获得具有优良木材特性的竹子品种，在替代塑料、减少塑料使用、保护环境、应对气候变化以及产生重大经济价值方面发挥着至关重要的作用。
然而，传统的竹子育种由于营养生长阶段长、开花期不确定而面临挑战。虽然分子育种技术已经发展并应用于竹子育种，但由于愈伤组织诱导和再生过程，竹子基因转化过程耗时、劳动密集且复杂2,3,4,5。稳定的遗传转化通常需要农杆菌介导的方法，其中涉及组织培养过程，如愈伤组织诱导和再生。然而，竹子的愈伤组织再生能力较低，极大地限制了稳定遗传转化在竹子中的应用。农杆菌感染植物细胞后，T-DNA片段进入植物细胞，大部分T-DNA片段未整合在细胞中，导致瞬时表达。只有一小部分T-DNA片段随机整合到其染色体中，导致稳定表达。瞬时表达水平显示一个积累曲线，该曲线可能因从农杆菌递送的 T-DNA 表达的每个基因而异。在大多数情况下，最高表达水平发生在浸润后 3-4 天，并在 5-6 天后迅速下降 6,7。先前的研究表明，在没有抗性选择压力的情况下获得的基因编辑植物中，超过1/3的突变来自CRISPR/Cas9的瞬时表达，而其余不到2/3的突变来自DNA整合到基因组中的稳定表达8。这表明T-DNA整合到植物基因组中对于基因编辑不是必需的。此外，抗性的选择压力显著抑制了非转基因细胞的生长，直接影响了感染外植体的再生过程。因此，通过在竹子中利用无选择压力的瞬时表达抗性，可以实现外源基因的非整合表达，并直接在植物器官中研究基因功能。因此，可以开发一种简单且省时的竹子外源基因表达和编辑方法9。
开发的外源基因表达和基因编辑方法的特点是简单、经济高效，无需昂贵的设备或复杂的程序9.该方法以竹子内源性紫黄质脱环氧化酶基因（PeVDE）作为外源基因表达的报告基因，无选择压力。这是因为编辑后的竹叶 PeVDE 降低了高光下的光保护能力，并表现出非光化学猝灭（NPQ）值的降低，这可以通过叶绿素荧光成像来检测。为了证明该方法的有效性，利用该系统敲除了另一个竹子内源基因肉桂酰辅酶A还原酶基因（PeCCR5）9，并成功产生了该基因的突变体。该技术可用于竹叶中具有功能的基因的功能表征。通过在竹叶中瞬时过表达这些基因，可以提高它们的表达水平，或者通过基因编辑，可以敲低它们的表达，从而可以研究下游基因表达水平、叶表型和产品含量。这为竹子的基因功能研究提供了一种更加高效可行的方法。该技术可应用于竹叶中起作用的基因的功能表征。通过在竹叶中瞬时过表达这些基因，可以提高它们的表达水平，或者通过基因编辑，可以敲低它们的表达，从而可以研究下游基因表达水平、叶表型和产品含量。此外，需要注意的是，由于广泛的多倍体化，竹基因组中大多数具有商业重要性的基因都存在于多个拷贝中，导致遗传冗余。这给在竹子中进行多重基因组编辑带来了挑战。在应用稳定的遗传转化或基因编辑技术之前，快速验证基因功能至关重要。在解决多个基因拷贝的问题时，一种方法是分析转录组表达谱，以识别在特定阶段活跃表达的基因。此外，靶向这些基因拷贝的保守功能域允许设计共同的靶序列或将多个靶位点掺入同一 CRISPR/Cas9 载体中，从而能够同时敲除这些基因。这为竹子的基因功能研究提供了一种更加高效可行的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
与通常需要1-2年的传统基因转化方法相比，该方法显著缩短了所需的时间，并在5天内实现了外源基因的瞬时表达和内源基因的基因编辑。然而，这种方法有局限性，因为它只能转化一小部分细胞，而且基因编辑的叶子是嵌合的，缺乏再生成完整植物的能力。然而，这种 植物 基因表达和基因编辑技术为竹子内源基因的功能验证提供了有力的途径。
目前，在植物中基因?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢国家重点研发计划（批准号：2021YFD2200502）和国家自然科学基金（批准号：31971736）的资助。
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
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