ב Planta ביטוי גנים ועריכת גנים בעלי במבוק מוסו
Summary
במחקר זה פותח בבמבוק רומן בשיטת ביטוי גנים של צמחים ובשיטת עריכת גנים בתיווך אגרובקטריום . שיטה זו שיפרה מאוד את יעילות אימות תפקוד הגנים בבמבוק, דבר שיש לו השלכות משמעותיות על האצת תהליך גידול הבמבוק.
Abstract
שיטה חדשנית בטרנספורמציה גנטית של צמחים פותחה עבור במבוק, אשר מונעת את הצורך בתהליכי השראת יבלות והתחדשות הגוזלים זמן רב ודורשים עבודה. שיטה זו כוללת ביטוי גנים בתיווך אגרובקטריום באמצעות פציעה ואקום עבור שתילי במבוק. הוא הדגים בהצלחה ביטוי של גנים אקסוגניים, כגון כתב רובי וגן Cas9 , בעלי במבוק. יעילות הטרנספורמציה הגבוהה ביותר להצטברות בטאליין בשתילי רובי הושגה באמצעות זן GV3101, עם אחוז של 85.2% לאחר ההדבקה. למרות שהדנ”א הזר לא השתלב בגנום הבמבוק, השיטה הייתה יעילה בביטוי הגנים האקסוגניים. יתר על כן, פותחה גם מערכת עריכה גנטית עם כתב יליד בשיטה זו, ממנה מוטציה באתרה הנוצרת על ידי הגן הערוך ויולקסנטין דה-אפוקסידז (PeVDE) בעלי במבוק, עם שיעור מוטציות של 17.33%. המוטציה של PeVDE גרמה לירידה בערכי המרווה הלא-פוטוכימית (NPQ) תחת אור גבוה, אשר ניתן לזהות במדויק על ידי פלואורומטר. זה הופך את PeVDE הערוך לכתב מקומי פוטנציאלי עבור גנים אקסוגניים ואנדוגניים בבמבוק. עם הכתב של PeVDE, גן cinnamoyl-CoA רדוקטאז נערך בהצלחה עם שיעור מוטציה של 8.3%. פעולה זו מונעת את התהליך של תרבית רקמה או השראת יבלות, שהוא מהיר ויעיל לביטוי גנים אקסוגניים ועריכת גנים אנדוגניים בבמבוק. שיטה זו יכולה לשפר את היעילות של אימות תפקוד גנים ותסייע לחשוף את המנגנונים המולקולריים של מסלולים מטבוליים מרכזיים בבמבוק.
Introduction
חקירת תפקוד הגנים בבמבוק טומנת בחובה הבטחה גדולה להבנה מתקדמת של במבוק ולמימוש הפוטנציאל שלו לשינוי גנטי. דרך יעילה לכך יכולה להיות מושגת באמצעות תהליך של זיהום בתיווך אגרובקטריום בעלי במבוק, שבו מקטע T-DNA המכיל גנים אקסוגניים מוכנס לתוך התאים, מה שמוביל לאחר מכן לביטוי הגנים בתוך תאי העלה.
במבוק הוא משאב יקר ומתחדש עם מגוון רחב של יישומים בייצור, אמנות ומחקר. לבמבוק תכונות עץ מצוינות כגון חוזק מכני גבוה, קשיחות, קשיחות בינונית וגמישות1, הנמצא כיום בשימוש נרחב במגוון מוצרים ביתיים ותעשייתיים, כולל מברשות שיניים, קשיות, כפתורים, כלי שולחן חד פעמיים, צינורות תת קרקעיים ומילוי מגדל קירור לייצור חשמל תרמי. לכן, גידול במבוק ממלא תפקיד מכריע בהשגת זני במבוק בעלי תכונות עץ מצוינות להחלפת פלסטיק והפחתת השימוש בפלסטיק, הגנה על הסביבה והתמודדות עם שינויי אקלים, כמו גם יצירת ערך כלכלי משמעותי.
עם זאת, גידול הבמבוק המסורתי עומד בפני אתגרים בשל שלב הצמיחה הווגטטיבי הארוך ותקופת הפריחה הלא ודאית. למרות שטכניקות גידול מולקולריות פותחו ויושמו בגידול במבוק, תהליך השינוי של גן הבמבוק גוזל זמן, דורש עבודה רבה ומסובך בשל תהליכי השראת והתחדשות היבמבוק 2,3,4,5. טרנספורמציה גנטית יציבה דורשת לעתים קרובות שיטות בתיווך אגרובקטריום, המערבות תהליכי תרבית רקמה כגון השראת יבלות והתחדשות. עם זאת, לבמבוק יש יכולת נמוכה להתחדשות יבלות, מה שמגביל מאוד את היישום של טרנספורמציה גנטית יציבה בבמבוק. לאחר שאגרובקטריום מדביק תאי צמחים, מקטע T-DNA נכנס לתאי הצמח, כאשר רוב מקטעי T-DNA נותרים לא משולבים בתאים, וכתוצאה מכך נוצר ביטוי חולף. רק חלק קטן ממקטעי T-DNA משתלבים באופן אקראי בכרומוזום שלו, מה שמוביל לביטוי יציב. רמות הביטוי הארעי מראות עקומת הצטברות שיכולה להשתנות עבור כל גן המתבטא בדנ”א T המועבר על ידי אגרובקטריום. ברוב המקרים, רמות הביטוי הגבוהות ביותר מתרחשות 3-4 ימים לאחר החדירה ויורדות במהירות לאחר 5-6 ימים 6,7. מחקרים קודמים הראו כי יותר משליש מהמוטציות בצמחים ערוכים גנטית המתקבלות ללא לחץ ברירה לעמידות מגיעות מהביטוי הארעי של CRISPR/Cas9, בעוד שפחות מ-2/3 הנותרות מגיעות מביטוי יציב לאחר שילוב DNA בגנום8. הדבר מצביע על כך ששילוב T-DNA בגנום הצמח אינו הכרחי לעריכת גנים. יתר על כן, לחץ הבחירה להתנגדות מעכב באופן משמעותי את הצמיחה של תאים שאינם טרנסגניים, המשפיעים ישירות על תהליך התחדשות של צמחים נגועים. לכן, על ידי שימוש בביטוי חולף ללא לחץ ברירה לעמידות בבמבוק, ניתן להשיג ביטוי לא משולב של גנים אקסוגניים ולחקור את תפקוד הגנים ישירות באיברי הצמח. לפיכך, ניתן לפתח שיטה קלה וחוסכת זמן לביטוי ועריכה של גנים אקסוגניים בבמבוק9.
שיטת ביטוי הגנים האקסוגנית המפותחת ושיטת עריכת הגנים מאופיינת בפשטותה, בעלות-תועלתה ובהיעדר ציוד יקר או פרוצדורות מורכבות9. בשיטה זו, הגן האנדוגני ויולקסנטין דה-אפוקסידז (PeVDE) שימש ככתב לביטוי גנים אקסוגניים ללא לחץ ברירה. הסיבה לכך היא שה-PeVDE הערוך בעלי במבוק מפחית את יכולת ההגנה מפני אור באור גבוה ומדגים ירידה בערך המרווה הלא-פוטוכימית (NPQ), שניתן לזהות באמצעות הדמיית כלורופיל פלואורסצנטית. כדי להדגים את יעילותה של שיטה זו, גן אנדוגני נוסף מבמבוק, הגן cinnamoyl-CoA reductase (PeCCR5)9, הושמד באמצעות מערכת זו ויצר בהצלחה מוטנטים של גן זה. טכניקה זו יכולה לשמש לאפיון פונקציונלי של גנים שיש להם תפקידים בעלי במבוק. על ידי ביטוי יתר של גנים אלה באופן ארעי בעלי במבוק, ניתן לשפר את רמות הביטוי שלהם, או על ידי עריכת גנים, ניתן להפיל את הביטוי שלהם, מה שמאפשר לחקור את רמות ביטוי הגנים במורד הזרם, פנוטיפים של עלים, ותכולת המוצר. זה מספק גישה יעילה ואפשרית יותר לחקר תפקודי גנים בבמבוק. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לאפיון פונקציונלי של גנים המתפקדים בעלי במבוק. על ידי ביטוי יתר של גנים אלה באופן ארעי בעלי במבוק, ניתן לשפר את רמות הביטוי שלהם, או על ידי עריכת גנים, ניתן להפיל את הביטוי שלהם, מה שמאפשר לחקור את רמות ביטוי הגנים במורד הזרם, פנוטיפים של עלים, ותכולת המוצר. בנוסף, חשוב לציין כי בשל פוליפלואידיזציה נרחבת, רוב הגנים החשובים מבחינה מסחרית בגנום הבמבוק נמצאים במספר עותקים, וכתוצאה מכך יתירות גנטית. הדבר מציב אתגר לביצוע עריכת גנום מרובה בבמבוק. לפני היישום של טרנספורמציה גנטית יציבה או טכניקות עריכת גנים, חיוני לאמת במהירות את תפקודי הגנים. בהתמודדות עם הבעיה של עותקי גנים מרובים, גישה אחת היא לנתח פרופילי ביטוי שעתוק כדי לזהות גנים המתבטאים באופן פעיל בשלבים ספציפיים. יתר על כן, מיקוד התחומים הפונקציונליים השמורים של עותקי גנים אלה מאפשר תכנון של רצפי מטרה משותפים או שילוב של אתרי מטרה מרובים באותו וקטור CRISPR/Cas9, המאפשר נוקאאוט בו זמנית של גנים אלה. זה מספק גישה יעילה ואפשרית יותר לחקר תפקודי גנים בבמבוק.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו מפחיתה משמעותית את הזמן הנדרש בהשוואה לשיטות טרנספורמציה גנטית מסורתיות, אשר בדרך כלל אורכות 1-2 שנים, ומשיגה ביטוי חולף של גנים אקסוגניים ועריכת גנים של גנים אנדוגניים תוך 5 ימים. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות מכיוון שהיא יכולה להפוך רק חלק קטן מהתאים, והעלים הערוכים גנטית הם כימריים וח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (מענק מס’ 2021YFD2200502), לקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס’ 31971736) על התמיכה הכספית.
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
References
- Jiang, Z. H. . World Bamboo and Rattan (in Chinese). , (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant. Frontiers in Plant Science. 8, 1298 (2017).
- Ye, S., et al. Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro). Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).
- Xiang, M., et al. Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis. Planta. 254 (3), 50 (2021).
- Huang, B., et al. An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis). Frontiers in Plant Science. 13, 822022 (2022).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Chen, L., et al. A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants. Horticulture Research. 5, 13 (2018).
- Sun, H., et al. A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves. Plant Methods. 19 (1), 20 (2023).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice. Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).
- McCormick, S., et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).
- Lou, Y., et al. a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light. Frontiers in Plant Science. 13, 927949 (2022).
- Zhou, R., et al. Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).
- De Roeck, A., et al. Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).
