Em Planta Expressão Gênica e Edição Gênica em Folhas de Bambu Moso
Summary
Neste estudo, um novo método de expressão gênica e edição gênica mediado por Agrobacterium foi desenvolvido em bambu. Este método melhorou muito a eficiência da validação da função gênica em bambu, o que tem implicações significativas para acelerar o processo de criação de bambu.
Abstract
Um novo método de transformação gênica em plantas foi desenvolvido para o bambu, o que evita a necessidade de processos demorados e trabalhosos de indução e regeneração de calos. Este método envolve a expressão gênica mediada por Agrobacterium via ferimento e vácuo para mudas de bambu. Demonstrou com sucesso a expressão de genes exógenos, como o RUBY reporter e o gene Cas9 , em folhas de bambu. A maior eficiência de transformação para o acúmulo de betalaína em mudas de RUBI foi obtida com o uso da linhagem GV3101, com percentual de 85,2% após a infecção. Embora o DNA estranho não tenha se integrado ao genoma do bambu, o método foi eficiente na expressão dos genes exógenos. Além disso, um sistema de edição genética também foi desenvolvido com um repórter nativo usando esse método, a partir do qual um mutante in situ gerado pelo gene editado da violaxantina desepoxidase de bambu (PeVDE) em folhas de bambu, com uma taxa de mutação de 17,33%. A mutação do PeVDE resultou na diminuição dos valores de têmpera não fotoquímica (NPQ) sob luz alta, que pode ser detectada com precisão por um fluorômetro. Isso torna o PeVDE editado um potencial repórter nativo para genes exógenos e endógenos em bambu. Com o repórter do PeVDE, um gene da cinamoil-CoA redutase foi editado com sucesso com uma taxa de mutação de 8,3%. Esta operação evita o processo de cultura de tecidos ou indução de calos, que é rápido e eficiente para expressar genes exógenos e edição de genes endógenos em bambu. Este método pode melhorar a eficiência da verificação da função gênica e ajudará a revelar os mecanismos moleculares das principais vias metabólicas no bambu.
Introduction
A investigação da função gênica no bambu é uma grande promessa para a compreensão avançada do bambu e para o desvendamento de seu potencial de modificação genética. Uma maneira eficaz disso pode ser alcançada através do processo de infecção mediada por Agrobacterium em folhas de bambu, pelo qual o fragmento de T-DNA contendo genes exógenos é introduzido nas células, levando posteriormente à expressão dos genes dentro das células foliares.
O bambu é um recurso valioso e renovável com uma ampla gama de aplicações na fabricação, arte e pesquisa. O bambu possui excelentes propriedades da madeira, como alta resistência mecânica, tenacidade, rigidez moderada e flexibilidade1, que agora é amplamente utilizado em uma variedade de suprimentos domésticos e industriais, incluindo escovas de dentes, canudos, botões, louças descartáveis, tubulações subterrâneas e enchimentos de torre de resfriamento para geração de energia térmica. Portanto, a criação de bambu desempenha um papel crucial na obtenção de variedades de bambu com excelentes propriedades de madeira para substituir plásticos e reduzir o uso de plástico, proteger o meio ambiente e combater as mudanças climáticas, além de gerar valor econômico significativo.
No entanto, a criação tradicional de bambu enfrenta desafios devido ao longo estágio de crescimento vegetativo e ao período de floração incerto. Embora técnicas de melhoramento molecular tenham sido desenvolvidas e aplicadas ao melhoramento do bambu, o processo de transformação do gene do bambu é demorado, trabalhoso e complicado devido aos processos de indução e regeneração do calo 2,3,4,5. A transformação genética estável frequentemente requer métodos mediados por Agrobacterium, que envolvem processos de cultura de tecidos, como indução e regeneração de calos. No entanto, o bambu tem uma baixa capacidade de regeneração de calos, limitando muito a aplicação de transformação genética estável no bambu. Depois que a Agrobacterium infecta as células vegetais, o fragmento de T-DNA entra nas células vegetais, com a maioria dos fragmentos de T-DNA permanecendo não integrada nas células, resultando em expressão transitória. Apenas uma pequena porção de fragmentos de T-DNA se integra aleatoriamente ao seu cromossomo, levando a uma expressão estável. Os níveis de expressão transitória mostram uma curva de acumulação que pode variar para cada gene expresso a partir de um T-DNA liberado por Agrobacterium. Na maioria dos casos, os níveis mais elevados de expressão ocorrem 3-4 dias após a infiltração e diminuem rapidamente após 5-6 dias 6,7. Estudos anteriores mostraram que mais de 1/3 das mutações em plantas editadas por genes obtidas sem pressão de seleção para resistência provêm da expressão transitória de CRISPR/Cas9, enquanto os restantes menos de 2/3% vêm da expressão estável após a integração do DNA no genoma8. Isso indica que a integração do T-DNA no genoma da planta não é necessária para a edição de genes. Além disso, a pressão de seleção para resistência inibe significativamente o crescimento de células não-transgênicas, afetando diretamente o processo de regeneração de explantes infectados. Portanto, usando a expressão transiente sem pressão de seleção para resistência em bambu, é possível obter expressão não integrada de genes exógenos e estudar a função gênica diretamente em órgãos vegetais. Assim, um método fácil e que economiza tempo pode ser desenvolvido para expressão e edição de genes exógenos em bambu9.
O método desenvolvido de expressão gênica exógena e edição gênica é caracterizado por sua simplicidade, custo-efetividade e ausência de equipamentos caros ou procedimentos complexos9. Neste método, o gene da violaxantina desepoxidase endógena de bambu (PeVDE) foi usado como repórter para a expressão gênica exógena sem pressão de seleção. Isso ocorre porque o PeVDE editado em folhas de bambu reduz a capacidade de fotoproteção sob alta luminosidade e demonstra uma diminuição no valor de têmpera não fotoquímica (NPQ), que pode ser detectado através de imagens de fluorescência da clorofila. Para demonstrar a eficácia desse método, outro gene endógeno de bambu, o gene da cinamoil-CoA redutase (PeCCR5)9, foi nocauteado usando esse sistema e gerou mutantes desse gene com sucesso. Esta técnica pode ser utilizada para a caracterização funcional de genes que possuem funções em folhas de bambu. Ao superexpressar esses genes transitoriamente em folhas de bambu, seus níveis de expressão podem ser aumentados, ou por edição de genes, sua expressão pode ser derrubada, permitindo o estudo dos níveis de expressão gênica a jusante, fenótipos foliares e conteúdo do produto. Isso fornece uma abordagem mais eficiente e viável para a pesquisa da função gênica em bambu. Esta técnica pode ser aplicada na caracterização funcional de genes que funcionam em folhas de bambu. Ao superexpressar esses genes transitoriamente em folhas de bambu, seus níveis de expressão podem ser aumentados, ou por edição de genes, sua expressão pode ser derrubada, permitindo o estudo dos níveis de expressão gênica a jusante, fenótipos foliares e conteúdo do produto. Além disso, é importante notar que, devido à poliploidização extensa, a maioria dos genes comercialmente importantes em genomas de bambu está presente em múltiplas cópias, resultando em redundância genética. Isso representa um desafio para a realização de edição do genoma multiplex em bambu. Antes da aplicação de técnicas de transformação genética estável ou edição de genes, é crucial validar rapidamente as funções do gene. Ao abordar a questão das cópias múltiplas de genes, uma abordagem é analisar perfis de expressão do transcriptoma para identificar genes que são ativamente expressos durante estágios específicos. Além disso, o direcionamento dos domínios funcionais conservados dessas cópias gênicas permite o planejamento de seqüências-alvo comuns ou a incorporação de múltiplos sítios alvo no mesmo vetor CRISPR/Cas9, permitindo o knockout simultâneo desses genes. Isso fornece uma abordagem mais eficiente e viável para a pesquisa da função gênica em bambu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método reduz significativamente o tempo necessário em comparação com os métodos tradicionais de transformação genética, que normalmente levam 1-2 anos, e alcança a expressão transitória de genes exógenos e edição gênica de genes endógenos dentro de 5 dias. No entanto, este método tem limitações, pois só pode transformar uma pequena proporção de células, e as folhas editadas por genes são quiméricas e não têm a capacidade de se regenerar em plantas completas. No entanto, esta tecnologia de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (Grant No. 2021YFD2200502), à National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31971736) pelo apoio financeiro.
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
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