Burada: Planta Moso Bambu Yapraklarında Gen İfadesi ve Gen Düzenleme
Summary
Bu çalışmada, bambuda Agrobacterium’un aracılık ettiği planta gen ekspresyonu ve gen düzenleme yönteminde yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem, bambu ıslah sürecini hızlandırmak için önemli etkileri olan bambuda gen fonksiyon doğrulamasının verimliliğini büyük ölçüde artırdı.
Abstract
Bambu için, zaman alıcı ve emek yoğun kallus indüksiyonu ve rejenerasyon işlemlerine olan ihtiyacı ortadan kaldıran yeni bir planta gen dönüşüm yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntem, bambu fideleri için yaralama ve vakum yoluyla Agrobacterium aracılı gen ekspresyonunu içerir. Bambu yapraklarında RUBY raportörü ve Cas9 geni gibi eksojen genlerin ekspresyonunu başarıyla gösterdi. RUBY fidelerinde betalain birikimi için en yüksek dönüşüm verimliliği, enfeksiyondan sonra% 85.2’lik bir yüzde ile GV3101 suşu kullanılarak elde edildi. Yabancı DNA, bambu genomuna entegre olmamasına rağmen, yöntem eksojen genleri ifade etmede etkiliydi. Ayrıca, bu yöntem kullanılarak doğal bir raportör ile bir gen düzenleme sistemi de geliştirilmiştir ve bundan, bambu yapraklarında düzenlenmiş bambu violaksantin de-epoksidaz geni (PeVDE) tarafından üretilen ve %17.33’lük bir mutasyon oranına sahip bir in situ mutant elde edilmiştir. PeVDE’nin mutasyonu, bir florometre ile doğru bir şekilde tespit edilebilen, yüksek ışık altında fotokimyasal olmayan söndürme (NPQ) değerlerinin azalmasına neden oldu. Bu, düzenlenmiş PeVDE’yi bambudaki hem eksojen hem de endojen genler için potansiyel bir yerli raportör yapar. PeVDE raportörü ile bir sinnamoil-CoA redüktaz geni, %8.3’lük bir mutasyon oranıyla başarılı bir şekilde düzenlendi. Bu işlem, bambuda eksojen genleri ve endojen gen düzenlemesini eksprese etmek için hızlı ve verimli olan doku kültürü veya kallus indüksiyonu sürecini önler. Bu yöntem, gen fonksiyon doğrulamasının verimliliğini artırabilir ve bambudaki temel metabolik yolların moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olacaktır.
Introduction
Bambudaki gen fonksiyonunun araştırılması, bambunun ileri düzeyde anlaşılması ve genetik modifikasyon potansiyelinin ortaya çıkarılması için büyük umut vaat ediyor. Bunun etkili bir yolu, bambu yapraklarında Agrobacterium aracılı enfeksiyon süreci ile elde edilebilir, bu sayede eksojen genleri içeren T-DNA fragmanı hücrelere sokulur ve daha sonra yaprak hücreleri içindeki genlerin ekspresyonuna yol açar.
Bambu, imalat, sanat ve araştırmada geniş bir uygulama yelpazesine sahip değerli ve yenilenebilir bir kaynaktır. Bambu, yüksek mekanik mukavemet, tokluk, orta sertlik ve esneklik 1 gibi mükemmel ahşap özelliklerine sahiptir ve şu anda diş fırçaları, pipetler, düğmeler, tek kullanımlık sofra takımları, yeraltı boru hatları ve termal enerji üretimi için soğutma kulesi dolguları dahil olmak üzere çeşitli evve endüstriyel malzemelerde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, bambu yetiştiriciliği, plastiklerin yerini almak ve plastik kullanımını azaltmak, çevreyi korumak ve iklim değişikliğiyle mücadele etmek için mükemmel ahşap özelliklere sahip bambu çeşitlerinin elde edilmesinde ve ayrıca önemli ekonomik değer yaratmada çok önemli bir rol oynamaktadır.
Bununla birlikte, geleneksel bambu yetiştiriciliği, uzun vejetatif büyüme aşaması ve belirsiz çiçeklenme dönemi nedeniyle zorluklarla karşı karşıyadır. Moleküler ıslah teknikleri geliştirilmiş ve bambu ıslahına uygulanmış olsa da, bambu gen dönüşümü süreci, kallus indüksiyonu ve rejenerasyon süreçlerinedeniyle zaman alıcı, emek yoğun ve karmaşıktır 2,3,4,5. Stabil genetik dönüşüm genellikle kallus indüksiyonu ve rejenerasyonu gibi doku kültürü süreçlerini içeren Agrobacterium aracılı yöntemler gerektirir. Bununla birlikte, bambu, kallus rejenerasyonu için düşük bir yeteneğe sahiptir ve bambuda kararlı genetik dönüşümün uygulanmasını büyük ölçüde sınırlar. Agrobacterium bitki hücrelerini enfekte ettikten sonra, T-DNA fragmanı bitki hücrelerine girer ve T-DNA fragmanlarının çoğu hücrelere entegre olmadan kalır ve bu da geçici ekspresyona neden olur. T-DNA fragmanlarının sadece küçük bir kısmı rastgele kromozomuna entegre olur ve bu da kararlı ekspresyona yol açar. Geçici ekspresyon seviyeleri, Agrobacterium tarafından verilen bir T-DNA’dan eksprese edilen her gen için değişebilen bir birikim eğrisi gösterir. Çoğu durumda, en yüksek ekspresyon seviyeleri infiltrasyondan 3-4 gün sonra ortaya çıkar ve 5-6 gün sonra hızla azalır 6,7. Önceki çalışmalar, direnç için seleksiyon baskısı olmadan elde edilen gen düzenlenmiş bitkilerdeki mutasyonların 1/3’ünden fazlasının CRISPR/Cas9’un geçici ekspresyonundan geldiğini, geri kalan 2/3’ünden daha azının ise DNA’nın genom8’e entegrasyonundan sonra kararlı ekspresyondan geldiğini göstermiştir. Bu, gen düzenleme için T-DNA’nın bitki genomuna entegrasyonunun gerekli olmadığını gösterir. Ayrıca, direnç için seleksiyon baskısı, enfekte eksplantların rejenerasyon sürecini doğrudan etkileyen, transgenik olmayan hücrelerin büyümesini önemli ölçüde inhibe eder. Bu nedenle, bambuda direnç için seleksiyon baskısı olmadan geçici ekspresyon kullanarak, eksojen genlerin entegre olmayan ekspresyonunu elde etmek ve gen fonksiyonunu doğrudan bitki organlarında incelemek mümkündür. Bu nedenle, bambu9’da eksojen gen ekspresyonu ve düzenlenmesi için kolay ve zaman kazandıran bir yöntem geliştirilebilir.
Geliştirilen eksojen gen ekspresyonu ve gen düzenleme yöntemi, basitliği, maliyet etkinliği ve pahalı ekipman veya karmaşık prosedürlerin olmaması ile karakterize edilir9. Bu yöntemde, bambu endojen violaksantin de-epoksidaz geni (PeVDE), seleksiyon baskısı olmaksızın eksojen gen ekspresyonu için raportör olarak kullanıldı. Bunun nedeni, bambu yapraklarındaki düzenlenmiş PeVDE’nin yüksek ışık altında foto koruma yeteneğini azaltması ve klorofil floresan görüntüleme ile tespit edilebilen fotokimyasal olmayan söndürme (NPQ) değerinde bir azalma göstermesidir. Bu yöntemin etkinliğini göstermek için, başka bir bambu endojen geni olan sinnamoil-CoA redüktaz geni (PeCCR5)9, bu sistem kullanılarak nakavt edildi ve bu genin mutantlarını başarıyla üretti. Bu teknik, bambu yapraklarında işlevleri olan genlerin fonksiyonel karakterizasyonu için kullanılabilir. Bu genleri bambu yapraklarında geçici olarak aşırı eksprese ederek, ekspresyon seviyeleri arttırılabilir veya gen düzenleme ile ekspresyonları düşürülebilir, bu da aşağı akış gen ekspresyon seviyelerinin, yaprak fenotiplerinin ve ürün içeriklerinin incelenmesine izin verir. Bu, bambuda gen fonksiyonu araştırması için daha verimli ve uygulanabilir bir yaklaşım sağlar. Bu teknik, bambu yapraklarında işlev gören genlerin fonksiyonel karakterizasyonuna uygulanabilir. Bu genleri bambu yapraklarında geçici olarak aşırı eksprese ederek, ekspresyon seviyeleri arttırılabilir veya gen düzenleme ile ekspresyonları düşürülebilir, bu da aşağı akış gen ekspresyon seviyelerinin, yaprak fenotiplerinin ve ürün içeriklerinin incelenmesine izin verir. Ek olarak, kapsamlı poliploidizasyon nedeniyle, bambu genomlarındaki ticari açıdan önemli genlerin çoğunun birden fazla kopyada bulunduğunu ve bunun da genetik fazlalığa neden olduğunu belirtmek önemlidir. Bu, bambuda multipleks genom düzenlemesi yapmak için bir zorluk teşkil ediyor. Kararlı genetik transformasyon veya gen düzenleme tekniklerinin uygulanmasından önce, gen fonksiyonlarını hızlı bir şekilde doğrulamak çok önemlidir. Çoklu gen kopyaları konusunu ele alırken, bir yaklaşım, belirli aşamalarda aktif olarak eksprese edilen genleri tanımlamak için transkriptom ekspresyon profillerini analiz etmektir. Ayrıca, bu gen kopyalarının korunmuş fonksiyonel alanlarını hedeflemek, ortak hedef dizilerin tasarımına veya birden fazla hedef bölgenin aynı CRISPR / Cas9 vektörüne dahil edilmesine izin vererek, bu genlerin aynı anda nakavt edilmesini sağlar. Bu, bambuda gen fonksiyonu araştırması için daha verimli ve uygulanabilir bir yaklaşım sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem, tipik olarak 1-2 yıl süren geleneksel genetik transformasyon yöntemlerine kıyasla gereken süreyi önemli ölçüde azaltır ve 5 gün içinde eksojen genlerin geçici ekspresyonunu ve endojen genlerin gen düzenlemesini sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemin sınırlamaları vardır, çünkü hücrelerin yalnızca küçük bir kısmını dönüştürebilir ve gen düzenlenmiş yapraklar kimeriktir ve tam bitkilere dönüşme yeteneğinden yoksundur. Bununla birlikte, planta gen ekspresyonu ve gen düzen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, mali destek için Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programına (Hibe No. 2021YFD2200502), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’na (Hibe No. 31971736) teşekkür eder.
Materials
| 35S::RUBY | Addgene, United States | 160908 | Plamid construct |
| Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1 | Biomed, China | BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01 | For Agrobacterium infection |
| CTAB | Sigma-Aldrich, United States | 57-09-0 | DNA extraction |
| Imaging-PAM fluorometer | Walz, Effeltrich, Germany | Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves | |
| ImagingWin | Walz, Effeltrich, Germany | Software for Imaging-PAM fluorometer | |
| Paq CI or Aar I | NEB, United States | R0745S | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
| PrimeSTAR Max DNA polymerase | Takara, Japan | R045Q | For gene cloning |
| T4 DNA ligase | NEB, United States | M0202V | Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector. |
References
- Jiang, Z. H. . World Bamboo and Rattan (in Chinese). , (2002).
- Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) started from young shoot as explant. Frontiers in Plant Science. 8, 1298 (2017).
- Ye, S., et al. Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro). Plant Biotechnology Journal. 18 (7), 1501-1503 (2020).
- Xiang, M., et al. Production of purple Ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus Munro) with enhanced drought and cold stress tolerance by engineering anthocyanin biosynthesis. Planta. 254 (3), 50 (2021).
- Huang, B., et al. An efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing system for moso bamboo (Phyllostachys edulis). Frontiers in Plant Science. 13, 822022 (2022).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods in Molecular Biology. 323, 225-229 (2006).
- Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
- Chen, L., et al. A method for the production and expedient screening of CRISPR/Cas9-mediated non-transgenic mutant plants. Horticulture Research. 5, 13 (2018).
- Sun, H., et al. A new biotechnology for in-planta gene editing and its application in promoting flavonoid biosynthesis in bamboo leaves. Plant Methods. 19 (1), 20 (2023).
- He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Horticulture Research. 7 (1), 152 (2020).
- Wang, C., Shen, L., Fu, Y., Yan, C., Wang, K. A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice. Journal of Genetics and Genomics. 42 (12), 703-706 (2015).
- McCormick, S., et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports. 5 (2), 81-84 (1986).
- Lou, Y., et al. a violaxanthin de-epoxidase gene from moso bamboo, confers photoprotection ability in transgenic Arabidopsis under high light. Frontiers in Plant Science. 13, 927949 (2022).
- Zhou, R., et al. Distinct cinnamoyl CoA reductases involved in parallel routes to lignin in Medicago truncatula. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17803-17808 (2010).
- De Roeck, A., et al. Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 134 (3), 475-487 (2017).
