여기에서는 힘줄 기초 연구를 위한 유망한 도구이자 힘줄 조직 공학을 위한 잠재적인 스캐폴드 없는 방법을 제공하는 3단계 오가노이드 모델(2차원[2D] 확장, 2D 자극, 3차원[3D] 성숙)을 시연합니다.
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방법 논문
Human Dermal Fibroblast를 이용한 Self-Assembled Cell Sheet Culture 및 3D Tendon/Ligament-like Organoid의 수동 생성 시연
이 논문에서
요약
초록
힘줄과 인대(T/L)는 근골격계를 하나로 묶는 강력하고 계층적으로 조직된 구조입니다. 이 조직에는 주로 평행한 줄에 위치한 콜라겐 유형 I-rich 세포외 기질(ECM)과 T/L-계통 세포가 엄격하게 배열되어 있습니다. 부상 후 T/L은 고장 위험이 높고 종종 만족스럽지 않은 수리 결과로 재활에 오랜 시간이 필요합니다. 최근 T/L 생물학 연구의 발전에도 불구하고 남아 있는 과제 중 하나는 T/L 분야에는 여전히 체외에서 T/L 형성 과정을 재현할 수 있는 표준화된 분화 프로토콜이 부족하다는 것입니다. 예를 들어, 중간엽 전구체 세포의 뼈 및 지방 분화에는 표준 2차원(2D) 세포 배양과 특정 자극 매체의 추가만 필요합니다. 연골을 분화하기 위해서는 3차원(3D) 펠릿 배양 및 TGFß 보충이 필요합니다. 그러나 힘줄에 대한 세포 분화에는 매우 질서 정연한 3D 배양 모델이 필요하며, 이상적으로는 동적 기계적 자극도 받을 수 있어야 합니다. 3-step (Expansion, Stimulation, and Maturation) 오가노이드 모델을 구축하여 자체 조립된 세포장에서 3D 막대 형태의 구조를 형성하였으며, 이를 통해 자체 ECM, 자가분비, 측분비 인자를 가진 자연스러운 미세환경을 구현하였습니다. 이러한 막대 모양의 오가노이드는 풍부한 ECM 내에서 다층 세포 구조를 가지고 있으며 정전기적인 기계적 변형에 노출될 경우 매우 쉽게 처리할 수 있습니다. 여기에서는 시판되는 진피 섬유아세포를 사용하여 3단계 프로토콜을 시연했습니다. 우리는 이 세포 유형이 견고하고 ECM이 풍부한 오가노이드를 형성한다는 것을 보여줄 수 있습니다. 설명된 절차는 배양 배지 측면에서 더욱 최적화될 수 있고 동적 축방향 기계적 자극에 대해 최적화될 수 있습니다. 같은 방식으로, 대체 세포 소스가 T/L 오가노이드를 형성할 수 있는 잠재력을 테스트하여 T/L 분화를 거칠 수 있습니다. 요컨대, 확립된 3D T/L 오가노이드 접근 방식은 힘줄 기초 연구 및 스캐폴드가 없는 T/L 엔지니어링의 모델로 사용할 수 있습니다.
서론
힘줄과 인대(T/L)는 신체에 필수적인 지지와 안정성을 제공하는 근골격계의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 결합 조직은 중요한 역할에도 불구하고 퇴화와 손상이 발생하기 쉬워 통증과 이동성 장애를 유발합니다1. 더욱이, 제한된 혈액 공급과 느린 치유 능력은 만성 부상으로 이어질 수 있으며, 노화, 반복적인 움직임 및 부적절한 재활과 같은 요인은 퇴행 및 부상의 위험을 더욱 증가시킨다2. 휴식, 물리치료, 외과적 치료와 같은 기존의 치료법으로는 T/L 구조와 기능을 완전히 회복할 수 없습니다. 지난 몇 년 동안 연구자들은 T/L 장애에 대한 효과적인 치료법을 찾기 위해 T/L의 복잡한 특성을 더 잘 이해하기 위해 노력해 왔습니다 3,4,5. T/L은 주로 I형 콜라겐 섬유와 프로테오글리칸으로 구성된 계층적으로 조직화된 세포외 기질(ECM) 지배 구조로 구별되며, 이러한 특징은 시험관 내에서 복제하기 어려운 특징입니다 6. 기존의 2차원(2D) 세포 배양 모델은 T/L 조직의 특징적인 3차....
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프로토콜
알림: 모든 단계는 무균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.
1. NHDF의 문화와 사전 확장
- 성인 냉동 보존된 정상적인 인간 피부 섬유아세포(NHDF, 1 x 106 세포)가 들어 있는 cryo-vial을 거의 해동될 때까지 37°C에서 빠르게 해동합니다.
- 37°C에서 예열된 1% 페니실린/스트렙토마이신(펜/연쇄상구균)(NHDF 배지)이 보충된 예열된 섬유아세포 성장 배지 2(기저 배지, 2% 태아 송아지 혈청(FCS), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 인슐린을 포함한 즉시 사용 가능한 키트) 1mL를 세포에 천천히 추가합니다.
- 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 실온(RT)에서 5분 동안 300 x g 에서 셀을 원심분리합니다.
- 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 12mL의 예열된 NHDF 배지에 재현탁시킵니다.
- 세포를 T-75 플라스크에 옮기고 십자형으로 짧게 흔듭니다. T-75 플라스크를 37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에 넣습니다.
- 2일마다 매체를 교체하십시오. NHDF가 70% - 80%의 밀도에 도달할 때까지 현미경으로....
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결과
3D T/L 오가노이드 모델은 이전에 상업적으로 구매한 NHDF(n=3, 공여체당 3개의 오가노이드, NHDF는 5-8절에서 사용됨)를 구현하여 확립되고 시연되었습니다. 모델 워크플로는 그림 1에 요약되어 있습니다. 그림 2 는 T-75 플라스크의 사전 팽창 중(그림 2A)과 10cm 세포 배양 접시의 2D 확장 단계에서 5일 동안의 배양 시작 및 후 NHDF 배양의 대표적인 위상차 이미지를 보여줍니다(그림 2B). 그림 2C (대표적인 위상차 이미지)는 10cm 세포 배양 접시에서 14일 배양 후 2D 자극 중 NHDF의 합류도를 보여줍니다. 그 후, 세포 시트를 수동으로 분리하고 동시에 3D 막대 모양의 오가노이드(0일째, 오가노이드 길이는 약 6cm, 너비는 .......
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토론
이 연구에서 입증된 결과는 T/L 조직 연구를 위한 NHDF 3D 오가노이드 모델의 확립 및 특성화에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 3단계 프로토콜은 T/L 틈새의 전형적인 특징을 나타내는 3D 막대 모양의 오가노이드를 형성했습니다. 이 모델은 이전에 Kroner-Weigl et al. 20237 에 보고되었으며 여기에서 매우 자세히 시연되었습니다.
그림 2에 제시된 위상차 이미지는 확장 및 자극 단계 동안 NHDF 합류 및 시트 형성의 진행을 보여주었습니다. 3D 성숙 과정은 세포 시트를 3D 막대 모양의 오가노이드로 수동으로 롤링하여 수행한 다음 14일 동안 정적 장력 하에서 배양했습니다. 오가노이드는 14일째까지 반짝이는 흰색 외관과 밀도 증가를 보였는데, 이는 오가노이드 내에서 수축 및 구조적 재구성이 있었음을 시사합니다. 이는 성숙 기간이 보다 조직화되고 .......
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공개 사항
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
D.D. 및 S.M.-D. BMBF Grant "CellWiTaL: Reproducible cell systems for drug research - transfer layer-free laser printing of highly specific single cells in three-dimensional cellular structures" 제안 번호 13N15874를 인정합니다. D.D.와 V.R.A.는 EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS "Holistic training of next-generation Osteoarthritis researches", GA Nr. 101034412. 모든 저자는 기술 지원을 제공한 Mrs. Beate Geyer를 인정합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아스코르브산 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, 독일 | A8960 | |
| 10cm 접착 세포 배양 접시 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | ||
| 10cm 비접착 페트리 접시 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, 독일 | ||
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, 네덜란드 | 4583 | |
| 크라이오몰드 표준 | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, 네덜란드 | 4557 | |
| D(+)-설탕 | AppliChem Avantor VWR International GmbH, 다름슈타트, 독일 | A2211 | |
| DMEM 고혈당 매체 | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, 독일 | DMEM-HA | |
| DMEM 저혈당 | 염소자리 과학, Ebsdorfergrund, 독일 | DMEM-LPXA | |
| 소 태아 혈청 | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| 섬유아세포 성장 매체 2 | PromoCell, 하이델베르크, 독일 | C-23020 | |
| H& E 염색 키트 | Abcam | ab245880 | |
| 고해상도 카메라가 있는 반전 현미경 | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM 아미노산 | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, 독일 | NEAA-B | |
| 메탈 핀 | 엔토스핑크스, 파르두비체, 체코 | 04.31 | |
| 정상 인간 진피 섬유아세포 | PromoCell, 하이델베르크, 독일 | C-12302 | |
| 파라포름알데히드 | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Gibco, Thermo Fisher Scientific, 다름슈타트, 독일 | 15140122 | |
| 인산염 완충액 식염수 | Sigma-Aldrich, 독일 타우프키르헨 | P4417 | |
| TGF&츨리그; 3 | R& D Systems, 독일 비스바덴 | 8420-B3 | |
| 트립신-EDTA 0.05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, 독일 | 트라이-1B |
참고문헌
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D.
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재인쇄 및 허가
