Summary
В данной работе мы демонстрируем трехступенчатую модель органоида (двумерное [2D] расширение, 2D-стимуляция, трехмерное [3D] созревание), предлагающую многообещающий инструмент для фундаментальных исследований сухожилий и потенциальный метод без каркасов для тканевой инженерии сухожилий.
Abstract
Сухожилия и связки (Т/Л) являются сильными иерархически организованными структурами, объединяющими опорно-двигательный аппарат. Эти ткани имеют строго организованный коллагеновый тип I-богатый внеклеточный матрикс (ECM) и клетки T/L-линии, в основном расположенные параллельными рядами. После травмы Т/Л требуют длительного времени для реабилитации с высоким риском неудачи и часто неудовлетворительными результатами восстановления. Несмотря на недавние достижения в исследованиях биологии Т/Л, одна из нерешенных проблем заключается в том, что в области Т/Л все еще отсутствует стандартизированный протокол дифференцировки, который способен повторить процесс образования Т/Л in vitro. Например, костная и жировая дифференцировка мезенхимальных клеток-предшественников требует только стандартной двумерной (2D) клеточной культуры и добавления специфических стимулирующих сред. Для дифференцировки в хрящи необходимо трехмерное (3D) культивирование гранул и добавление TGFß. Однако дифференцировка клеток в сухожилие требует очень упорядоченной 3D-модели культуры, которая в идеале также должна подвергаться динамической механической стимуляции. Мы создали 3-ступенчатую (расширение, стимуляция и созревание) органоидную модель для формирования 3D-палочковидной структуры из самоорганизующегося клеточного листа, которая обеспечивает естественную микросреду со своими собственными ECM, аутокринными и паракринными факторами. Эти палочковидные органоиды имеют многослойную клеточную архитектуру в богатой ВКМ и могут быть довольно легко обработаны для воздействия статической механической нагрузки. Здесь мы продемонстрировали 3-этапный протокол с использованием коммерчески доступных дермальных фибробластов. Мы смогли показать, что этот тип клеток образует крепкие и богатые ВКМ органоиды. Описанная процедура может быть дополнительно оптимизирована с точки зрения питательных сред и оптимизирована для динамической осевой механической стимуляции. Таким же образом альтернативные клеточные источники могут быть проверены на их способность образовывать органоиды Т/Л и, таким образом, подвергаться дифференцировке Т/Л. В целом, устоявшийся подход к 3D Т/Л органоидам может быть использован в качестве модели для фундаментальных исследований сухожилий и даже для безкаркасной инженерии Т/Л.
Introduction
Сухожилия и связки (T/L) являются жизненно важными компонентами опорно-двигательного аппарата, которые обеспечивают необходимую поддержку и стабильность организма. Несмотря на свою критическую роль, эти соединительные ткани склонны к дегенерации и травмам, вызывая боль и нарушение подвижности1. Более того, их ограниченное кровоснабжение и медленная способность к заживлению могут привести к хроническим травмам, в то время как такие факторы, как старение, повторяющиеся движения и неправильная реабилитация, еще больше увеличивают риск дегенерации и травм. Традиционные методы лечения, такие как отдых, физиотерапия и хирургические вмешательства, не могут полностью восстановить структуру и функцию T/L. В течение последних нескольких лет исследователи стремились лучше понять сложную природу T/L, чтобы найти эффективные методы лечения T/L-расстройств 3,4,5. T/L отличаются иерархически организованной структурой с преобладанием внеклеточного матрикса (ECM), состоящей в основном из коллагеновых волокон I типа и протеогликанов, особенность, которую трудно воспроизвести in vitro6. Традиционные двумерные (2D) модели клеточных культур не могут охватить характерную трехмерную (3D) организацию тканей Т/Л, что ограничивает их трансляционный потенциал, а также препятствует инновационному прогрессу в области регенерации Т/Л.
В последнее время разработка 3D-моделей органоидов открыла новые возможности для продвижения фундаментальных исследований и тканевой инженерии различных типов тканейбез каркасов 7,8,9,10,11,12,13. Например, для исследования миотендинозного соединения Larkin et al. 2006 разработали трехмерные конструкции скелетных мышц вместе с самоорганизующимися сегментами сухожилия, полученными из сухожилия10 крысиного хвоста. Более того, Schiele et al. 2013, используя микромашинные каналы роста, покрытые фибронектином, направили самосборку дермальных фибробластов человека для формирования клеточных волокон без помощи 3D-каркаса, подход, который может уловить ключевые чертыразвития эмбриональных сухожилий. В исследовании, проведенном Florida et al. 2016, стромальные клетки костного мозга сначала были расширены в линии костей и связок, а затем использованы для создания самоорганизующихся однослойных клеточных листов, которые затем были реализованы для создания многофазной конструкции «кость-связка-кость», имитирующей нативную переднюю крестообразную связку, модель, направленную на улучшение понимания регенерации связок12. Чтобы выяснить процессы механотрансдукции сухожилий, Mubyana et al. 2018 использовали методологию без каркасов, с помощью которой отдельные волокна сухожилия были созданы и подвергнуты протоколу механической нагрузки13. Органоиды — это самоорганизующиеся 3D-структуры, которые имитируют естественную архитектуру, микроокружение и функциональность тканей. 3D-культуры органоидов обеспечивают более физиологически релевантную модель для изучения биологии тканей и органов, а также патофизиологии. Такие модели также могут быть использованы для индуцирования тканеспецифической дифференцировки различных типов стволовых/прогениторных клеток14,15. Следовательно, реализация 3D-моделей органоидов в области биологии Т/Л и тканевой инженерии становится очень привлекательным подходом 9,16. Альтернативные клеточные источники могут быть реализованы для органоидной сборки и стимулированы к теногенной дифференцировке. Одним из релевантных типов клеток, используемых для демонстрации в этом исследовании, являются дермальные фибробласты 7,17,18. Эти клетки легко доступны с помощью процедуры биопсии кожи, которая менее инвазивна по сравнению с пункцией костного мозга или липосакцией и может довольно быстро размножаться в больших количествах благодаря их хорошей пролиферативной способности. Напротив, более специализированные типы клеток, такие как Т/L-резидентные фибробласты, сложнее изолировать и расширить. Таким образом, дермальные фибробласты также использовались в качестве отправной точки для технологий перепрограммирования клеток в направлении индуцированных плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток19. Воздействие на дермальные фибробласты специфических условий 3D-культивирования и сигнальных сигналов, таких как трансформирующий фактор роста-бета 3 (TGFß3), который, как сообщается, действует как ключевой регулятор различных клеточных процессов, включая образование и поддержание T/L, может потенцировать их теногенную дифференцировку in vitro, приводящую к экспрессии сухожиль-специфических генов и отложению T/L-типичной ECM20, 21.
Здесь мы описываем и демонстрируем ранее установленный и реализованный 3-этапный (2D-экспансия, 2D-стимуляция и 3D-созревание) органоидный протокол с использованием коммерчески доступных нормальных дермальных фибробластов взрослого человека (NHDF) в качестве источника клеток, предлагая ценную модель для изучения теногенеза in vitro 7. Несмотря на то, что эта модель не эквивалентна ткани Т/Л in vivo, она все же обеспечивает более физиологически значимую систему, которую можно использовать для исследования механизмов клеточной дифференцировки, имитации патофизиологии Т/Л in vitro и создания персонализированной медицины Т/Л и платформ для скрининга лекарств. Более того, в будущем исследования могут оценить, подходят ли 3D-органоиды для безкаркасной инженерии Т/Л путем дальнейшей оптимизации, а также могут ли они быть использованы для разработки увеличенных механически прочных конструкций, которые очень похожи по размерам, структурным и биофизическим свойствам нативных тканей Т/Л.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны выполняться с использованием асептических методов.
1. Культура и предварительное расширение NHDF
- Быстро разморозьте криофлакон, содержащий криоконсервированные нормальные дермальные фибробласты человека (NHDF, 1 x 106 клеток) при 37 °C до тех пор, пока они почти не разморозятся.
- Медленно добавьте в клетки 1 мл предварительно подогретой среды для роста фибробластов 2 (готовый к применению набор, включающий базальную среду, 2% эмбриональную телячью сыворотку (FCS), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и инсулин) с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина (ручка/стрептококка) (среда NHDF), предварительно подогретую до 37 °C.
- Переложите ячейки в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
- Удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 12 мл предварительно подогретой среды NHDF.
- Переложите ячейки в колбу Т-75 и коротко встряхните крест-накрест. Поместите колбу Т-75 при температуре 37 °C в инкубатор с увлажнением 5%CO2 .
- Меняйте среду каждые 2 дня. Наблюдайте за NHDF под микроскопом, пока они не достигнут 70-80% слияния.
2. 2D-расширение
- Выньте колбу Т-75 из инкубатора и извлеките среду NHDF. Промойте клетки предварительно подогретым фосфатным буферным раствором (PBS).
- Добавьте в клетки 3 мл 0,05% трипсина-ЭДТА. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% увлажнениемCO2 до тех пор, пока клетки не отсоединятся от колбы (примерно 3 мин).
- Добавьте 6 мл предварительно подогретой среды NHDF, чтобы нейтрализовать действие трипсина. Переложите ячейки в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 мин при RT и удалите надосадочную жидкость.
- Ресуспендируйте клеточную гранулу в модифицированной среде Dulbecco Eagles Medium (DMEM) с низким содержанием глюкозы, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1x аминокислотами MEM, 1% пером/стрептококком, предварительно подогретыми до 37 °C.
- Поместите NHDF в 10-сантиметровую чашку для клеточной культуры плотностью 8 x 103 NHDF/см2 (всего 4,4 x 105 NHDF на 10-сантиметровую чашку). Аккуратно покачивайте крест-накрест.
- Поместите 10-сантиметровую чашку для клеточных культур при температуре 37 °C в инкубатор с влажной концентрацией 5%CO2 . Меняйте носитель каждые 2 дня
- Наблюдайте за клетками под микроскопом до достижения 100% слияния (около 5 дней).
3. 2D-стимуляция
- Достаньте из инкубатора 10-сантиметровые чашки для клеточных культур, содержащие NHDF (из шагов 2.6 и 2.7). Снимите питательную среду и промойте клетки предварительно подогретым PBS.
- Добавьте 10 мл среды DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 1% пера/стрептококка, предварительно подогретого при 37 °C.
- Поместите чашку Петри при температуре 37 °C во влажной атмосфере с содержаниемCO2 5%. Меняйте среду каждые 2 дня.
- Наблюдайте за NHDF под микроскопом в течение 14 дней.
4. 3D созревание
- Достаньте из инкубатора 10-сантиметровую чашку для клеточных культур и удалите среду с высоким содержанием глюкозы DMEM.
- Аккуратно и быстро отсоедините образовавшийся клеточный лист от посуды скребком для ячеек. Одновременно сворачивая лист ячейки в 3D-стержнеобразный органоид.
- Возьмите и поместите органоиды NHDF в 10-сантиметровую неадгезивную (для клеток) чашку Петри. Этот тип чашки используется, чтобы избежать миграции клеток из органоида в пластик.
- В этот момент времени или на следующий день (день 0 или день 1 3D-созревания) соберите некоторые органоиды для дальнейшего анализа, такого как сырой вес, гистологическая оценка (органоиды 1-го дня предпочтительнее, так как они становятся более компактными), выделение РНК и белков.
- Зафиксируйте края органоида металлическими штифтами следующим образом:
- Осторожно удерживайте одну сторону органоида пинцетом, а другой пинцетом аккуратно применяйте ручное растяжение примерно на 10% осевого удлинения. Чтобы оценить осевое удлинение на 10%, используйте миллиметровую бумагу или линейку.
- Затем возьмите пинцетом один металлический штифт и вручную нажмите через край органоида на пластиковую тарелку, чтобы зафиксировать его. Повторите эту процедуру со вторым штифтом на втором краю органоида.
- Добавьте 10 мл среды DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS, 1x аминокислот MEM, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, 10 нг/мл TGFß3 и 1% пера/стрептококка, предварительно подогретого при 37 °C.
- Поместите 10-сантиметровую тарелку при температуре 37 °C во влажной атмосфере с содержаниемCO2 5%. Меняйте среду каждые 2 дня.
- Регулярно контролируйте органоиды в течение 14 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Штифты могут ослабнуть, поэтому повторная фиксация выполняется с помощью той же техники, что и в шаге 4.5. - Через 14 дней удалите из органоидов среду с высоким содержанием глюкозы DMEM. Промойте органоиды предварительно подогретым PBS.
- Измерьте органоиды для сырого веса на 0-й и 14-й день с помощью точных весов.
- Поставьте на весы пустую 10-сантиметровую тарелку и уменьшите вес до нуля, чтобы убедиться, что измеряется только вес органоидов. Полностью выньте питательную среду из 10-сантиметровой чашки и поочередно измеряйте сырой вес органоида.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании на 0-й день взвешивали три органоида на донора, а на 14-й день взвешивали два органоида на донора.
- Поставьте на весы пустую 10-сантиметровую тарелку и уменьшите вес до нуля, чтобы убедиться, что измеряется только вес органоидов. Полностью выньте питательную среду из 10-сантиметровой чашки и поочередно измеряйте сырой вес органоида.
- В соответствии с целями исследования, внедрить некоторые органоиды NHDF в дальнейший гистологические анализы или немедленно заморозить их в жидком азоте с использованием стерильных пробирок без ДНК/РНК для последующего выделения ДНК, РНК и белков, а затем хранить при -80 °C.
- Для гистологического исследования зафиксировать каждый органоид в 5 мл предварительно охлажденного (4 °C) 4% параформальдегида в PBS (отрегулированном до нейтрального pH) в течение 45 мин на льду, после чего следует промывка PBS в RT (2 x 5 мин каждый).
- Криозащита фиксированных органоидов с помощью градиента сахарозы, помещая органоиды в стеклянные банки для гистологии. Органоиды инкубируют в 10% сахарозе в растворе PBS в течение 2 ч при 4 °C, затем 20% сахарозу/PBS в течение 2 ч при 4 °C и, наконец, 30% сахарозу/PBS в течение ночной инкубации при 4 °C. Замените растворы сахарозы, сначала отпиливая, а затем заполняя их новым раствором.
- Встраиваем органоиды в криосреду.
- Поместите медную тарелку на сухой лед в пенопластовую коробку и остудите в течение 10 минут.
- Затем поместите пластиковую криоформу, предварительно заполненную криосредой, на медную пластину и аккуратно прижмите органоид к дну криомолда с помощью пинцета. Дождитесь полного замерзания криосреды.
- Для длинных органоидов сначала разрежьте скальпелем пополам и положите две половинки параллельно друг другу в криоформу. Повторите процедуру для каждого органоида, предназначенного для гистологического анализа.
- Храните образцы при температуре -20 °C до криосекции.
- Используя криотома, разрежьте органоиды в продольном направлении на срезы толщиной 10 мкм и подвергнуть гистологическому окрашиванию, такому как гематоксилин и эозин (H&E), используя стандартный протокол8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модель 3D Т/Л органоида была ранее создана и продемонстрирована здесь путем реализации коммерчески приобретенных NHDF (n=3, 3 органоида на донора, NHDF использовались в пассажах 5-8). Рабочий процесс модели обобщен на рисунке 1. На рисунке 2 показаны репрезентативные фазово-контрастные изображения культуры NHDF во время предварительного расширения в колбах Т-75 (рисунок 2A), а также в начале и после 5 дней культивирования на стадии 2D-расширения в 10-сантиметровых чашках для клеточных культур (рисунок 2B). На рисунке 2C (репрезентативные фазово-контрастные изображения) показано слияние NHDF во время 2D-стимуляции после 14 дней культивирования в 10-сантиметровых чашках для клеточных культур. Затем клеточные листы вручную отделяли и одновременно сворачивали в 3D-палочковидные органоиды (на 0-й день длина органоида составляет примерно 6 см, ширина около 0,4 см), которые культивировали при 10 % статическом напряжении в течение 14 дней (рис. 3, день 0 и день 14, репрезентативные макроскопические изображения). К 14-му дню процесса 3D-созревания органоиды показали блестящий белый вид, сократились и казались более плотными, чем первоначальные органоиды. Сырой вес органоидов измеряли во время формирования (день 0) и снова на 14-й день стадии 3D-созревания (рис. 4). Наблюдалось значительное снижение сырого веса, что указывает на сокращение и структурную реорганизацию ECM в органоидах в течение периода времени этого этапа протокола. Помимо изменения веса, из-за сокращения уменьшилась и длина органоида (на 14 день длина органоида составляет примерно 3,5 см, а ширина – примерно 0,3 см). В этом процессе металлические штифты ослабли, и их пришлось заново закрепить; следовательно, в течение 14 дней 3D-созревания мы рекомендуем часто контролировать органоиды. Для оценки морфологии органоидов были получены продольные срезы из органоидов NHDF, собранных на 1-й и 14-й день стадии 3D-созревания и подвергнутых окрашиванию H&E (рис. 5). В 1-й день органоиды показали разрозненные слои, в основном состоящие из клеток, окруженных низким количеством ВКМ. Кроме того, ячейки в слоях органоида не были выровнены вдоль продольной оси органоида, используемой в качестве направления для приложенной статической растягивающей нагрузки. Ядра NHDF имели круглую форму с различными размерами и формами. Анализ органоидов 14-го дня показал заметное увеличение сигнала эозина, что указывает на отложение ВКМ в процессе 3D-созревания. В этот момент органоиды демонстрировали слитые слои с областями, содержащими выровненные клетки. Ячейки часто были группами; однако в некоторых местах они также были организованы в ряды камер. Большинство ядер имели одинаковые размеры и иногда были удлинены.
Рисунок 1: Карикатура 3D Т/Л органоидной модели, состоящей из 3 этапов: 2D расширение, 2D стимуляция и 3D созревание. Первоначально NHDF предварительно расширялись в колбе T-75 до тех пор, пока они не достигали 70%-80% слияния. Впоследствии NHDF культивировали с использованием модифицированной среды Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) с низким содержанием глюкозы в 10-сантиметровой чашке для клеточной культуры в течение 5 дней (2D-расширение). Затем клетки стимулировали средой с высоким содержанием глюкозы DMEM с добавлением аскорбиновой кислоты в течение 14 дней культивирования (2D-стимуляция). Затем NHDF отделяли от 10-сантиметровой адгезивной чашки, сворачивали в 3D-стержнеобразный органоид, переносили и фиксировали в 10-сантиметровой неадгезивной чашке для клеточной культуры, заполненной средой DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением аскорбиновой кислоты и трансформирующего фактора роста бета 3 (TGFß3) в течение 14 дней (3D-созревание). Сформированные 3D-органоиды могут подвергаться оценке сырого веса, гистологической оценке, выделению РНК и белков и другим анализам (например, просвечивающей электронной микроскопии, биомеханическим измерениям) в различные моменты времени, такие как дни 0, 1 и 14. Мультфильм был сгенерирован в программном обеспечении BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные фазово-контрастные изображения NHDF во время этапов предварительного расширения, 2D-расширения и 2D-стимуляции. (A) NHDF во время предварительного расширения в колбе T-75. (B) NHDF на 1-й и 5-й день стадии 2D-экспансии в 10-сантиметровой чашке для клеточной культуры. (C) NHDF на 1-й и 14-й день этапа 2D-стимуляции в 10-сантиметровой чашке для клеточной культуры. Масштабные линейки: 200 μм. Изображения были сделаны с помощью перевернутого микроскопа, оснащенного камерой высокого разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Общая морфология 3D-органоидов NHDF. Репрезентативные макроскопические изображения органоидов NHDF на 0-й и 14-й дни стадии 3D-созревания. Масштабная линейка: 1 см. Снимки были сделаны камерой мобильного телефона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ влажного веса 3D-органоидов NHDF. Измерение сырого веса органоидов проводилось на 0-й и 14-й день, в конце процесса 3D-созревания. На графике показаны средние значения и стандартные отклонения (NHDF n = 3, 3 органоида/донор на 0-й день и 2 органоида/донор на 14-й день из-за 1 органоида/донора, взятого на гистологию в 1-й день), каждая точка представляет отдельные органоиды, а каждая цветная фигура представляет отдельного отдельного донора. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения, и был использован непарный параметрический t-критерий. Статистические различия: **p ≤0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Гистологический анализ 3D-органоидов NHDF. Репрезентативные изображения окрашенных гематоксилином и эозином (H&E) срезов органоидов NHDF во время процесса 3D-созревания на 1-й и 14-й день. Правое изображение - изображения с малым увеличением, левое изображение - увеличенное изображение с индикаторами: желтые стрелки - разъединенные слои; желтые наконечники стрелок – ядра с различными размерами и формами; черные стрелки - сплавленные слои и напыление ЭХМ; черные стрелки – клеточные ряды, ядра со схожими размерами и удлинением; черные звезды - ячейки в группах. Масштабные линейки: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Результаты, продемонстрированные в этом исследовании, дают ценную информацию о создании и характеристике 3D-модели органоида NHDF для изучения тканей T/L. 3-ступенчатый протокол привел к образованию 3D-палочковидных органоидов, которые демонстрируют типичные черты ниши T/L. Эта модель ранее была описана в Kroner-Weigl et al. 20237 и очень подробно продемонстрирована здесь.
Фазово-контрастные изображения, представленные на рисунке 2 , показали прогрессирование слияния NHDF и формирование листа во время этапов расширения и стимуляции. Процесс 3D-созревания выполняли путем ручного скручивания клеточных листов в 3D-стержнеобразные органоиды, которые затем культивировали под статическим напряжением в течение 14 дней. Органоиды показали блестящий белый вид и увеличили плотность к 14-му дню, что указывает на сокращение и структурную реорганизацию внутри органоидов. Это указывает на то, что период созревания имеет решающее значение для достижения более организованной структуры, имитирующей Т/Л ткань.
Кроме того, весовой анализ выявил значительное снижение сырого веса органоидов между 0 и 14 днями, что еще раз указывает на значительное сокращение и реорганизацию ВКМ в органоидах в процессе созревания. Важно отметить, что измерения влажного веса могут различаться в разных экспериментах из-за обработки и остаточной среды внутри органоида или в чашках. Более того, органоид может содержать больше среды в начале, потому что, как обсуждается ниже, в день 0 слои, образованные скручиванием клеточного листа, отделяются и не сливаются. Со временем слои соединялись и становились более компактными, и, таким образом, среда могла быть экструдирована.
Морфологическая оценка с помощью окрашивания H&E дала дополнительное представление о структурных характеристиках органоида. На 1-й день органоиды демонстрировали разъединенные слои, в основном состоящие из клеток с круглыми ядрами, окруженными тонкой периклеточной ВКМ. Отсутствие выравнивания ячеек параллельно оси растягивающей нагрузки предполагает, что для достижения более организованной клеточной и ECM-архитектуры органоидов необходимо дальнейшее созревание. Несмотря на сокращение и уменьшение массы и размеров органоидов между 1 и 14 днями, окрашивание H&E показало увеличение эозин-положительных областей, что свидетельствует об увеличении отложения ECM. Кроме того, больше не было видимых слоев, а иногда клетки имели удлиненные ядра и располагались в параллельных клеточных рядах. Это указывало на то, что клетки внутри органоидов подвергаются самоорганизации, изменяя свое собственное расположение, а также отложение, структуру и выравнивание ВКМ, таким образом, имитируя поведение нативного Т/Л тканевого образования.
В целом, эти результаты подчеркивают потенциал модели органоидов NHDF как ценного инструмента для изучения биологии Т/Л, теногенеза in vitro и даже для дальнейшего развития безкаркасной Т/Л-инженерии. Тем не менее, есть три критических шага для успешной работы с 3D-моделью органоида: 1) Формирование плотного клеточного листа на этапе 2D-стимуляции протокола. При использовании первичных клеток это преимущественно зависит от свойств донорских клеток; поэтому важно проводить оценку нескольких доноров параллельно; 2) Ручное скручивание листа ячейки. Для этого необходимо быстро, но в то же время аккуратно прокатывать клеточный лист с помощью скребка для ячеек. Поэтому рекомендуется планировать начальные органоиды, чтобы сначала обучить этой процедуре; и 3) Стабильная фиксация штифтов на краях органоидов. Такая фиксация обеспечивает осевое удлинение органоида и предотвращает деформацию, а также схлопывание в комковатую структуру. Более того, на стадии 3D-созревания, поскольку органоиды подвергаются ремоделированию ECM, контакты могут внезапно отсоединиться, поэтому важно часто контролировать каждый органоид и заново фиксировать контакты.
Текущая модель еще не достигла уровня мимикрии in vivo к ткани Т/Л и имеет ряд ограничений. Например, для завершения процедуры требуется большое количество клеток на органоид, а также 35 дней, в то время как большинство протоколов дифференцировки, таких как 3D-модель хондрогенной гранулы, установлены на 21 день22. Этапы промывки в процедуре протокола предпочтительно проводить с физиологически сбалансированным буфером для промывки, например, сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS) или сбалансированным солевым раствором Эрлза (EBSS), а не PBS, который может иметь метаболические последствия для первичных клеток человека, культивируемых in vitro. Что касается питательной среды, используемой на стадиях 2D-стимуляции и 3D-созревания в органоиде, она была выбрана в качестве DMEM плюс 10% FBS, поскольку это является основой широко распространенных протоколов дифференцировки, а также с намерением стандартизировать и сравнить различные типы клеток по их органоидогенным свойствам.. Воспроизведение 3-этапного протокола органоидов в различных лабораторных условиях может зависеть от типа используемых клеток, качества и пассажа клеток, а также от донорозависимых свойств клеток. Различия в оборудовании, особенно в качестве 10-сантиметровых чашек для клеточных культур24 , используемых на стадии 2D-стимуляции, потенциально могут повлиять на устойчивость формирования клеточного листа. Более того, из-за сжатия ECM в течение 3D-созревания осевая фиксация органоидов через штифты может ослабнуть; Поэтому, как упоминалось выше, рекомендуется частый контроль. Тестирование и выбор различных штифтов с точки зрения диаметра и прочности также может снизить риск отсоединения штифта25. Однако использование штифтов для ручного растяжения не является надежным и подвержено изменчивости; следовательно, очень важно разработать в последующих исследованиях зажимной механизм для удержания краев органоидов, который может привести не только к стандартизации этого этапа, но и может обеспечить динамическое растяжение органоидов. В целом, будет интересно исследовать два способа модификации органоидной модели, один из которых - уменьшить количество клеток на органоид и время процедуры, тем самым сделав ее более удобной для пользователя, особенно для исследований in vitro ; и второе масштабирование - для увеличения размеров органоидов с целью проверки их поведения на крупных животных моделях в качестве потенциальной стратегии замены сухожилий.
Продемонстрированная здесь модель может обеспечить платформу для исследования механизмов, лежащих в основе развития сухожилий, патофизиологии и, возможно, восстановления и регенерации, если органоиды объединяются с различными типами клеток и подвергаются микроразрывам. Важно отметить, что исследование Kroner-Weigl et al. 20237 выявило несколько ограничений в отношении типа клеток NHDF, а именно, органоиды, образованные NHDF, больше и более клеточны, чем органоиды, полученные из T/L-клеток, что затрудняет контроль пролиферации и поведения клеток. Что касается клеточного апоптоза, анализ на основе терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP nick end labeling (TUNEL) не показал признаков мертвых клеток по всему органоиду на 14-7 день, что свидетельствует о надлежащей диффузии питательных веществ, отходов и кислорода на стадии 3D-созревания. Интересно, что, несмотря на морфологические различия, пилотный скрининг с помощью количественной ПЦР ряда генов, связанных с T/L (включая различные типы коллагена, Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX) и т. д.), показал сопоставимую экспрессию генов между NHDF и органоидамиT/L. Следовательно, для этого типа клеток требуется дальнейшая оптимизация для поддержки дифференцировки T/L, которая может быть основана на корректировке среды, используемой в 2D-стимуляции и 3D-стадиях созревания (например, концентрация в сыворотке, факторы роста, витамины), увеличении времени созревания или даже воздействии на органоиды динамического механического растяжения. Развитие протокола может еще больше улучшить композиционные, структурные и функциональные свойства органоида, что позволит модели лучше имитировать тканевую нишу Т/Л комплекса in vivo. Кроме того, альтернативные источники клеток могут быть исследованы на предмет их способности образовывать органоиды Т/Л и того, могут ли они подвергаться дифференцировке Т/Л. Yan et al. 20209, использовали 3D-модель органоидов, используя молодые/здоровые и старые/дегенеративные стволовые/прогениторные стволовые/прогениторные клетки сухожилий (Y-TSPC и A-TSPC) для исследования клеточного поведения в 3D, а также того, изменяется ли способность формирования сухожилий со старением T/L. Они сообщили, что 3D-органоиды A-TSPC демонстрируют плохую морфологию тканей, а клетки внутри имеют более низкую скорость пролиферации, но более высокий апоптоз параллельно с повышенным уровнем маркеров, связанных со старением9. Таким образом, 3D-модель органоида T/L является многообещающей платформой для изучения молекулярных и клеточных механизмов, участвующих в старении сухожилий, и в дальнейшем может быть использована для тестирования новых фармакологических методов лечения восстановления и регенерации сухожилий. В другом подходе Chu et al. 2021 внедрили клетки зубного фолликула (DFC) в 3D-модель органоида, чтобы оценить их лигаментогенную дифференцировку. Этот тип клеток сформировал очень хорошо организованные органоиды, что позволяет предположить, что DFC являются привлекательным источником клеток для дифференцировки в ткани периодонтальной связки (PDL), что, в свою очередь, может разработать многообещающую терапевтическую стратегию для пародонтита8.
В будущем модель может стать еще более сложной, включив в нее различные типы клеток (например, миофибробласты, макрофаги), что может предложить новое понимание клеточно-специфического поведения и клеточных перекрестных помех в органоидах и способствовать более полному пониманию биологии, физиологии и патофизиологии Т/Л 8,9,16,26.
3D-модели органоидов имеют несколько преимуществ для применения в области тканевой инженерии и регенеративной медицины. Они точно имитируют клеточный состав и организацию, а также межклеточные и матричные взаимодействия тканей человека, тем самым предлагая физиологически значимую платформу для изучения механизмов заболеванияи реакции на лекарства. Органоиды можно использовать в качестве высокопроизводительной платформы для скрининга для оценки эффективности, а также потенциальных побочных эффектов различных лекарств и обеспечить надежную и недорогую альтернативу тестированию на животных. Кроме того, они позволяют проводить прямые сравнения между здоровыми и больными состояниями, позволяя обнаруживать ключевые молекулярные и клеточные изменения, связанные с различными патологиями, идентифицировать биомаркеры для раннего выявления заболеваний, а также способствовать более глубокому пониманию механизмов заболевания и разработке таргетной терапии.
В совокупности мы очень подробно продемонстрировали этапы ранее созданной 3D-модели Т/Л органоида, которая обеспечивает перспективную платформу для изучения биологии Т/Л тканей и теногенных процессов in vitro различных типов клеток. Настоятельно рекомендуется дальнейшее внедрение, оптимизация и исследование этой модели, поскольку они могут привести к продвижению стратегий безкаркасной инженерии Т/Л, что, в свою очередь, может способствовать улучшению Т/Л-терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Acknowledgments
Д.Д. и С.М.-Д. признательно за грант BMBF «CellWiTaL: Воспроизводимые клеточные системы для исследования лекарств — беспослойная лазерная печать высокоспецифичных одиночных клеток в трехмерных клеточных структурах», предложение No 13N15874. D.D. и V.R.A. признают грант EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS «Целостное обучение исследований остеоартрита следующего поколения» GA Nr. 101034412. Все авторы выражают благодарность г-же Беате Гейер за техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H.
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
