Summary
Burada, tendon temel araştırmaları için umut verici bir araç ve tendon dokusu mühendisliği için potansiyel bir iskele içermeyen yöntem sunan üç aşamalı bir organoid model (iki boyutlu [2D] genişleme, 2D stimülasyon, üç boyutlu [3D] olgunlaşma) gösteriyoruz.
Abstract
Tendonlar ve bağlar (T/L), kas-iskelet sistemini birleştiren güçlü hiyerarşik olarak organize edilmiş yapılardır. Bu dokular, sıkı bir şekilde düzenlenmiş kollajen tip I açısından zengin hücre dışı matrise (ECM) ve esas olarak paralel sıralar halinde konumlandırılmış T / L soy hücrelerine sahiptir. Yaralanmadan sonra, T/L, yüksek başarısızlık riski ve genellikle tatmin edici olmayan onarım sonuçları ile rehabilitasyon için uzun bir süre gerektirir. T / L biyoloji araştırmalarındaki son gelişmelere rağmen, kalan zorluklardan biri, T / L alanının, T / L oluşum sürecini in vitro olarak özetleyebilen standart bir farklılaşma protokolünden yoksun olmasıdır. Örneğin, mezenkimal öncü hücrelerin kemik ve yağ farklılaşması, sadece standart iki boyutlu (2D) hücre kültürü ve spesifik stimülasyon ortamının eklenmesini gerektirir. Kıkırdak farklılaşması için üç boyutlu (3D) pelet kültürü ve TGFß takviyesi gereklidir. Bununla birlikte, tendona hücre farklılaşması, ideal olarak dinamik mekanik stimülasyona da tabi olması gereken çok düzenli bir 3D kültür modeline ihtiyaç duyar. Kendi ECM, otokrin ve parakrin faktörlerine sahip doğal bir mikro ortam sağlayan, kendi kendine monte edilmiş bir hücre tabakasından 3D çubuk benzeri bir yapı oluşturmak için 3 adımlı (genişleme, stimülasyon ve olgunlaşma) bir organoid model oluşturduk. Bu çubuk benzeri organoidler, zengin ECM içinde çok katmanlı bir hücresel mimariye sahiptir ve statik mekanik gerilmeye maruz kalmak için oldukça kolay bir şekilde ele alınabilir. Burada, piyasada bulunan dermal fibroblastları kullanarak 3 aşamalı protokolü gösterdik. Bu hücre tipinin sağlam ve ECM açısından bol organoidler oluşturduğunu gösterebiliriz. Tarif edilen prosedür, kültür ortamı açısından daha da optimize edilebilir ve dinamik eksenel mekanik stimülasyona doğru optimize edilebilir. Aynı şekilde, alternatif hücre kaynakları, T/L organoidleri oluşturma potansiyelleri açısından test edilebilir ve böylece T/L farklılaşmasına uğrayabilir. Özetle, yerleşik 3D T / L organoid yaklaşımı, tendon temel araştırması ve hatta iskele içermeyen T / L mühendisliği için bir model olarak kullanılabilir.
Introduction
Tendonlar ve bağlar (T/L), vücuda temel destek ve stabilite sağlayan kas-iskelet sisteminin hayati bileşenleridir. Kritik rollerine rağmen, bu bağ dokuları dejenerasyona ve yaralanmaya eğilimlidir, bu da ağrıya ve hareketliliğin bozulmasına neden olur1. Ayrıca, sınırlı kan temini ve yavaş iyileşme kapasitesi kronik yaralanmalara yol açabilirken, yaşlanma, tekrarlayan hareketler ve yanlış rehabilitasyon gibi faktörler dejenerasyon ve yaralanma riskini daha da artırır2. Dinlenme, fizik tedavi ve cerrahi müdahaleler gibi geleneksel tedaviler, T / L yapısını ve işlevini tam olarak eski haline getiremez. Son birkaç yılda, araştırmacılar T / L bozuklukları için etkili tedaviler aramak için T / L'nin karmaşık doğasını daha iyi anlamaya çalıştılar 3,4,5. T / L, esas olarak tip I kollajen lifleri ve proteoglikanlardan oluşan, hiyerarşik olarak organize, hücre dışı matris (ECM) baskın bir yapı ile ayırt edilir, bu da in vitro6'da kopyalanması zor bir özelliktir. Geleneksel iki boyutlu (2D) hücre kültürü modelleri, T/L dokularının karakteristik üç boyutlu (3D) organizasyonunu yakalayamamakta, bu da translasyon potansiyellerini sınırlamakta ve T/L rejenerasyonu alanındaki yenilikçi ilerlemeyi engellemektedir.
Son zamanlarda, 3D organoid modellerin geliştirilmesi, çeşitli doku tiplerinin temel araştırmalarını ve iskelesiz doku mühendisliğini ilerletmek için yeni olanaklar sunmuştur7,8,9,10,11,12,13. Örneğin, miyotendinöz bileşkeyi araştırmak için, Larkin ve ark. 2006, sıçan kuyruğu tendonu10'dan türetilen kendi kendini organize eden tendon segmentleri ile birlikte 3D iskelet kası yapıları geliştirdi. Ayrıca, Schiele ve ark. 2013, mikro işlenmiş fibronektin kaplı büyüme kanallarını kullanarak, embriyonik tendon gelişiminin temel özelliklerini yakalayabilen bir yaklaşım olan 3D iskele yardımı olmadan hücresel lifler oluşturmak için insan dermal fibroblastlarının kendi kendine montajını yönlendirdi11. Florida ve ark. 2016 tarafından yapılan çalışmada, kemik iliği stromal hücreleri önce kemik ve bağ soylarına genişletildi, daha sonra kendi kendine monte edilmiş tek katmanlı hücre tabakaları oluşturmak için kullanıldı, bunlar daha sonra doğal ön çapraz bağı taklit eden çok fazlı bir kemik-bağ-kemik yapısı oluşturmak için uygulandı, bağ rejenerasyonunun daha iyi anlaşılmasını amaçlayan bir model12. Tendon mekanotransdüksiyon süreçlerini aydınlatmak için Mubyana ve ark. 2018, tek tendon liflerinin oluşturulduğu ve mekanik yükleme protokolüne tabi tutulduğu iskelesiz bir metodoloji kullandı13. Organoidler, dokuların doğal mimarisini, mikro çevresini ve işlevselliğini taklit eden, kendi kendini organize eden 3B yapılardır. 3D organoid kültürler, doku ve organ biyolojisinin yanı sıra patofizyolojiyi incelemek için fizyolojik olarak daha uygun bir model sağlar. Bu tür modeller, farklı kök/progenitör hücre tiplerinindokuya özgü farklılaşmasını indüklemek için de kullanılabilir 14,15. Bu nedenle, T/L biyolojisi ve doku mühendisliği alanında 3D organoid modellerin uygulanması çok çekici bir yaklaşım haline gelmektedir 9,16. Organoid montajı için alternatif hücre kaynakları uygulanabilir ve tenojenik farklılaşmaya doğru uyarılabilir. Bu çalışmada gösterim için kullanılan ilgili bir hücre tipi dermal fibroblastlar 7,17,18'dir. Bu hücrelere, kemik iliği ponksiyonu veya liposuction ile karşılaştırıldığında daha az invaziv olan ve iyi proliferatif kapasiteleri nedeniyle oldukça hızlı bir şekilde büyük sayılara çarpılabilen bir cilt biyopsisi prosedürü ile kolayca erişilebilir. Buna karşılık, T / L'de yerleşik fibroblastlar gibi daha özel hücre tiplerinin izole edilmesi ve genişletilmesi daha zordur. Bu nedenle, dermal fibroblastlar, indüklenmiş pluripotent embriyonik kök hücrelere yönelik hücre yeniden programlama teknolojileri için bir başlangıç noktası olarak da kullanılmıştır19. Dermal fibroblastların, T/L'nin oluşumu ve sürdürülmesi de dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçlerin anahtar bir düzenleyicisi olarak hareket ettiği bildirilen transforme edici büyüme faktörü-beta 3 (TGFß3) gibi spesifik 3D kültür koşullarına ve sinyal ipuçlarına tabi tutulması, tendona özgü genlerin ekspresyonuna ve T/L-tipik ECM20'nin birikmesine yol açan in vitro tenojenik farklılaşmalarını güçlendirebilir, 21.
Burada, hücre kaynağı olarak ticari olarak temin edilebilen normal yetişkin insan dermal fibroblastlarını (NHDF'ler) kullanarak önceden kurulmuş ve uygulanmış 3 aşamalı (2D genişleme, 2D stimülasyon ve 3D olgunlaşma) organoid protokolünü tanımlıyor ve gösteriyoruz ve in vitro tenogenez7. Bu model in vivo T/L dokusuna eşdeğer olmamasına rağmen, hücresel farklılaşma mekanizmalarını araştırmak, in vitro T/L patofizyolojisini taklit etmek ve T/L kişiselleştirilmiş tıp ve ilaç tarama platformları oluşturmak için kullanılabilecek fizyolojik olarak daha ilgili bir sistem sunmaktadır. Ayrıca, gelecekte, çalışmalar, 3D organoidlerin iskelesiz T/L mühendisliği için uygun olup olmadığını, daha fazla optimizasyon ile değerlendirebilir ve aynı zamanda doğal T/L dokularının boyutlarına ve yapısal ve biyofiziksel özelliklerine çok benzeyen ölçeklendirilmiş mekanik olarak sağlam yapıların geliştirilmesi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm adımlar aseptik teknikler kullanılarak gerçekleştirilmelidir.
1. NHDF'lerin kültürü ve ön genişlemesi
- Yetişkin kriyoprezervasyonlu normal insan dermal fibroblastlarını (NHDF'ler, 1 x 106 hücreli) içeren kriyo-şişeyi 37 ° C'de neredeyse çözülene kadar hızla çözün.
- %1 penisilin / streptomisin (kalem / strep) (NHDF ortamı) ile desteklenmiş 1 mL önceden ısıtılmış önceden ısıtılmış fibroblast büyüme ortamı 2 (bazal ortam,% 2 fetal buzağı serumu (FCS), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve insülin içeren kullanıma hazır kit) yavaşça hücrelere 37 ° C'de ısıtılır.
- Hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın. Hücre peletini 12 mL önceden ısıtılmış NHDF ortamında yeniden süspanse edin.
- Hücreleri bir T-75 şişesine aktarın ve çapraz şekilde kısa bir süre çalkalayın. T-75 şişesini 37 °C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatöre yerleştirin.
- Ortamı her 2 günde bir değiştirin. NHDF'leri% 70 -% 80 birleşmeye ulaşana kadar mikroskop altında gözlemleyin.
2. 2D genişletme
- İnkübatörün T-75 şişesini çıkarın ve NHDF ortamını çıkarın. Hücreleri önceden ısıtılmış fosfat tampon salin (PBS) ile yıkayın.
- Hücrelere 3 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Hücreleri% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de, hücreler şişeden ayrılana kadar (yaklaşık 3 dakika) inkübe edin.
- Tripsin etkisini nötralize etmek için 6 mL önceden ısıtılmış NHDF ortamı ekleyin. Hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
- 37 ° C'de önceden ısıtılmış% 10 fetal sığır serumu (FBS), 1x MEM amino asitleri,% 1 pen / strep ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagles Medium (DMEM) düşük glikozunda hücre peletini yeniden süspanse edin.
- NHDF'leri 10 cm'lik bir yapışkan hücre kültürü kabında 8 x 103 NHDFs/cm2 yoğunlukta (toplamda, 10 cm'lik tabak başına 4,4 x 105 NHDF) plakalayın. Çapraz bir şekilde nazikçe sallayın.
- 10 cm'lik hücre kültürü kabını 37 °C'de %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatöre yerleştirin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin
- Hücreleri% 100 birleşmeye ulaşana kadar (yaklaşık 5 gün) mikroskop altında izleyin.
3. 2D stimülasyon
- NHDF'leri içeren 10 cm'lik hücre kültürü kaplarını (adım 2.6 ve 2.7'den itibaren) inkübatörden çıkarın. Kültür ortamını çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.
- 37 ° C'de önceden ısıtılmış %10 FBS, 50 μg/mL askorbik asit ve %1 pen/strep ile desteklenmiş 10 mL DMEM yüksek glikozlu ortam ekleyin.
- Petri kabını 37 °C'de %5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosfere yerleştirin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
- NHDF'leri 14 gün boyunca mikroskop altında izleyin.
4. 3D olgunlaşması
- 10 cm'lik hücre kültürü kabını inkübatörden çıkarın ve DMEM yüksek glikoz ortamını çıkarın.
- Oluşan hücre tabakasını bir hücre kazıyıcı ile tabaktan nazikçe ve hızlı bir şekilde ayırın. Ayırırken, hücre tabakasını aynı anda 3D çubuk benzeri bir organoid haline getirin.
- NHDF organoidlerini alın ve 10 cm'lik yapışmayan (hücreler için) bir Petri kabına yerleştirin. Bu çanak türü, organoidden plastiğe hücre göçünü önlemek için kullanılır.
- Bu zaman noktasında veya bir gün sonra (3D olgunlaşmanın 0. günü veya 1. günü), ıslak ağırlık, histolojik değerlendirme (daha kompakt hale geldikleri için 1. gün organoidleri tercih edilir), RNA ve protein izolasyonu gibi daha ileri analizler için bazı organoidleri toplayın.
- Organoidin kenarlarını metal pimlerle aşağıdaki gibi sabitleyin:
- Organoidin bir tarafını bir cımbızla dikkatlice tutun ve başka bir cımbızla yaklaşık% 10 eksenel uzamayı manuel olarak gerdirin. %10 eksenel uzamayı tahmin etmek için bir milimetre kağıt veya cetvel kullanın.
- Ardından, cımbızla bir metal pim alın ve sabitlemek için organoid kenardan plastik tabağa manuel olarak bastırın. Bu işlemi ikinci pim ile organoidin ikinci kenarına tekrarlayın.
- 37 °C'de önceden ısıtılmış %10 FBS, 1x MEM amino asit, 50 μg/mL askorbik asit, 10 ng/mL TGFß3 ve %1 pen/strep ile desteklenmiş 10 mL DMEM yüksek glikoz ortamı ekleyin.
- 10 cm'lik tabağı 37 °C'de %5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosfere yerleştirin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
- Organoidleri 14 gün boyunca düzenli olarak izleyin.
NOT: Pimler gevşeyebilir, bu nedenle adım 4.5'te açıklanan tekniğin aynısını kullanarak yeniden sabitleyin. - 14 gün sonra, DMEM yüksek glikoz ortamını organoidlerden çıkarın. Organoidleri önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.
- Hassas bir terazi kullanarak 0. ve 14. günlerde ıslak ağırlık için organoidleri ölçün.
- Tartıya 10 cm'lik boş bir tabak yerleştirin ve yalnızca organoidlerin ağırlığının ölçüldüğünden emin olmak için ağırlığı sıfıra getirin. Kültür ortamını 10 cm'lik tabaktan tamamen çıkarın ve organoid ıslak ağırlığı tek tek ölçün.
NOT: Bu çalışmada, 0. günde, donör başına üç organoid ve 14. günde, donör başına iki organoid tartıldı.
- Tartıya 10 cm'lik boş bir tabak yerleştirin ve yalnızca organoidlerin ağırlığının ölçüldüğünden emin olmak için ağırlığı sıfıra getirin. Kültür ortamını 10 cm'lik tabaktan tamamen çıkarın ve organoid ıslak ağırlığı tek tek ölçün.
- Çalışma amaçlarına göre, NHDF organoidlerinin bir kısmını daha ileri histolojik analizlerde uygulayın veya sonraki DNA, RNA ve protein izolasyonu için steril DNA / RNA içermeyen tüpler kullanarak hemen sıvı nitrojen içinde dondurun ve ardından -80 ° C'de saklayın.
- Histolojik inceleme için, her bir organoidi 5 mL önceden soğutulmuş (4 ° C)% 4 paraformaldehit içinde PBS'de (nötr pH'a ayarlanmış) buz üzerinde 45 dakika boyunca sabitleyin, ardından RT'de PBS yıkayın (her biri 2 x 5 dakika).
- Organoidleri histoloji için cam kavanozlara yerleştirerek bir sükroz gradyanı kullanarak sabit organoidleri kriyoprotekte edin. Organoidleri 4 ° C'de 2 saat boyunca PBS çözeltisinde% 10 sükroz içinde inkübe edin, ardından% 20 sükroz / PBS'yi 4 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin ve son olarak, 4 ° C'de% 30 sükroz / PBS gece boyunca inkübe edin. Sükroz çözeltilerini önce pipetleyerek ve ardından yeni çözelti ile doldurarak değiştirin.
- Organoidleri kriyo-ortama gömün.
- Bir strafor kutudaki kuru buzun üzerine bakır bir plaka yerleştirin ve 10 dakika soğutun.
- Ardından, bakır plakanın üzerine kriyo-ortam ile önceden doldurulmuş plastik bir kriyo kalıbı yerleştirin ve organoidi cımbız kullanarak kriyokalıbın altına hafifçe bastırın. Kriyomedium tamamen donana kadar bekleyin.
- Uzun organoidler için, önce bir neşter ile ikiye bölün ve iki yarıyı kriyokalıba birbirine paralel hale getirin. Histolojik analize tabi tutulması amaçlanan her organoid için prosedürü tekrarlayın.
- Numuneleri kriyoseksiyona kadar -20 °C'de saklayın.
- Bir kriyotom kullanarak, organoidleri 10 μm kalınlığında kesitler halinde uzunlamasına kesin ve standart protokol8'i kullanarak hematoksilen ve eozin (H & E) gibi histolojik boyamaya tabi tutun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D T/L organoid modeli daha önce burada ticari olarak satın alınan NHDF uygulanarak kurulmuş ve gösterilmiştir (n=3, donör başına 3 organoid, NHDF 5-8 pasajlarında kullanılmıştır). Model iş akışı Şekil 1'de özetlenmiştir. Şekil 2 , T-75 şişelerinde ön genişleme sırasında (Şekil 2A) ve ayrıca 10 cm'lik hücre kültürü kaplarında 2D genişletme adımında kültürün başlangıcında ve 5 günlük kültürden sonra NHDF kültürünün temsili faz kontrast görüntülerini göstermektedir (Şekil 2B). Şekil 2C (temsili faz kontrast görüntüleri), 10 cm'lik hücre kültürü kaplarında 14 günlük kültürden sonra 2D stimülasyon sırasında NHDF'lerin birleştiğini göstermektedir. Daha sonra, hücre tabakaları manuel olarak ayrıldı ve aynı anda 14 gün boyunca% 10 statik gerilim altında yetiştirilen 3D çubuk benzeri organoidlere (0. günde, organoid uzunluğu yaklaşık 6 cm, genişlik yaklaşık 0.4 cm) yuvarlandı (Şekil 3, gün 0 ve gün 14, temsili makroskopik görüntüler). 3D olgunlaşma sürecinin 14. gününde, organoidler parlak beyaz bir görünüm sergiledi, büzüldü ve ilk organoidlerden daha yoğun göründü. Organoidlerin ıslak ağırlığı, oluşum sırasında (0. gün) ve tekrar 3D olgunlaşma aşamasının 14. gününde ölçüldü (Şekil 4). Islak ağırlıkta önemli bir azalma gözlendi, bu da bu protokol adımının zaman aralığı boyunca organoidler içinde kasılmayı ve ECM yapısal yeniden organizasyonunu gösteriyor. Kilo değişimine ek olarak, kasılma nedeniyle organoid uzunluğu da azalmıştır (14. günde, organoid uzunluğu yaklaşık 3,5 cm ve genişlik yaklaşık 0,3 cm'dir). Bu işlemde metal pimler gevşedi ve yeniden sabitlenmesi gerekiyordu; bu nedenle, 14 günlük 3D olgunlaşma boyunca, organoidleri sık sık izlemenizi öneririz. Organoidlerin morfolojisini değerlendirmek için, 3D olgunlaşma aşamasının 1. ve 14. günlerinde toplanan NHDF organoidlerinden uzunlamasına kesitler elde edildi ve H&E boyamaya tabi tutuldu (Şekil 5). 1. günde, organoidler, esas olarak düşük miktarda ECM ile çevrili hücrelerden oluşan bağlantısız katmanlar sergiledi. Ayrıca, organoid tabakalar içindeki hücreler, uygulanan statik gerilme yükü için yön olarak kullanılan uzunlamasına organoid ekseni boyunca hizalanmamıştır. NHDF çekirdekleri, çeşitli boyut ve şekillerde yuvarlak bir şekil sergiledi. 14. gün organoidlerinin H&E analizi, eozin sinyalinde gözle görülür bir artış olduğunu ortaya çıkardı ve bu da 3D olgunlaşma süreci sırasında ECM birikimini gösterdi. Bu zaman noktasında, organoidler, hizalanmış hücreler içeren alanlarla kaynaşmış katmanlar sergiledi. Hücreler sıklıkla gruplar halindeydi; Bununla birlikte, bazı yerlerde hücre sıraları halinde de düzenlenmişlerdi. Çekirdeklerin çoğu benzer boyutlara sahipti ve bazen uzamıştı.
Şekil 1: 3 adımdan oluşan 3D T/L organoid modelinin karikatürü: 2D genişletme, 2D stimülasyon ve 3D olgunlaşma. Başlangıçta, NHDF'ler, %70-80 birleşmeye ulaşana kadar bir T-75 şişesinde önceden genişletildi. Daha sonra, NHDF'ler, 5 gün boyunca 10 cm'lik bir hücre kültürü kabında (2D genişleme) Dulbecco'nun Modifiye Eagles Medium (DMEM) düşük glikoz ortamı kullanılarak yetiştirildi. Hücreler daha sonra 14 günlük kültür (2D stimülasyon) için askorbik asit ile takviye edilmiş DMEM yüksek glikoz ortamı ile uyarıldı. Daha sonra, NHDF 10 cm'lik yapışkan tabaktan ayrıldı, 3D çubuk benzeri bir organoid içine yuvarlandı, aktarıldı ve askorbik asit ve Dönüştürücü Büyüme Faktörü beta 3 (TGFß3) ile takviye edilmiş DMEM yüksek glikoz ortamı ile doldurulmuş 10 cm'lik yapışmaz bir hücre kültürü kabına sabitlendi. Oluşan 3D organoidler, 0, 1 ve 14. günler gibi farklı zaman noktalarında ıslak ağırlık, histolojik değerlendirme, RNA ve protein izolasyonu ve diğer analizlere (örneğin, transmisyon elektron mikroskobu, biyomekanik ölçümler) tabi tutulabilir. Çizgi film BioRender yazılımında oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ön genişletme, 2D genişletme ve 2D stimülasyon adımları sırasında NHDF'lerin temsili faz kontrast görüntüleri. (A) T-75 şişesinde ön genleşme sırasında NHDF'ler. (B) 10 cm'lik bir hücre kültürü kabında 2D genişletme adımının 1. ve 5. günlerinde NHDF'ler. (C) 10 cm'lik bir hücre kültürü kabında 2D stimülasyon adımının 1. ve 14. günlerinde NHDF'ler. Ölçek çubukları: 200 μm. Görüntüler, yüksek çözünürlüklü bir kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop ile çekildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: NHDF 3D organoidlerin brüt morfolojisi. 3D olgunlaşma aşamasının 0. ve 14. günlerinde NHDF organoidlerinin temsili makroskopik görüntüleri. Ölçek çubuğu: 1 cm. Görüntüler cep telefonu kamerası ile çekildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: NHDF 3D organoidlerin ıslak ağırlık analizi. Organoidlerin yaş ağırlık ölçümü, 3D olgunlaşma sürecinin sonu olan 0. gün ve 14. gündeydi. Grafik, ortalama değerleri ve standart sapmaları gösterir (NHDF n = 3, 0. günde 3 organoid/donör ve 1. günde histoloji için alınan 1 organoid/donör nedeniyle 14. günde 2 organoid/donör), her nokta bireysel organoidleri temsil ederken, her renkli şekil farklı bir bireysel donörü temsil eder. Veriler ortalama ± standart sapma olarak sunuldu ve eşleşmemiş parametrik t-testi kullanıldı. İstatistiksel farklılıklar: **p ≤0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: NHDF 3D organoidlerin histolojik analizi. Hematoksilen ve eozin (H & E) ile boyanmış NHDF organoidlerinin 1. ve 14. günlerdeki 3D olgunlaşma sürecinde kesitlerinin temsili görüntüleri. Sağ görüntü - düşük büyütmeli görüntüler, sol görüntü - aşağıdaki gibi göstergelerle büyütülmüş görünüm: sarı oklar - bağlantısız katmanlar; sarı ok uçları - çeşitli boyut ve şekillerde çekirdekler; siyah oklar - kaynaşmış katmanlar ve ECM biriktirme; siyah ok uçları - hücre sıraları, benzer boyut ve uzamaya sahip çekirdekler; siyah yıldızlar -gruplar halinde hücreler. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada gösterilen sonuçlar, T / L dokularını incelemek için NHDF 3D organoid modelinin kurulması ve karakterizasyonu hakkında değerli bilgiler sağlar. 3 aşamalı protokol, T / L nişinin tipik özelliklerini sergileyen 3D çubuk benzeri organoidlerin oluşumuna yol açtı. Bu model daha önce Kroner-Weigl ve ark. 20237 ve burada çok ayrıntılı olarak gösterilmiştir.
Şekil 2'de sunulan faz kontrast görüntüleri, genişleme ve stimülasyon adımları sırasında NHDF birleşmesinin ve tabaka oluşumunun ilerlemesini göstermiştir. 3D olgunlaşma işlemi, hücre tabakalarının manuel olarak 3D çubuk benzeri organoidlere yuvarlanmasıyla gerçekleştirildi ve bunlar daha sonra 14 gün boyunca statik gerilim altında kültürlendi. Organoidler parlak beyaz bir görünüm sergiledi ve 14. güne kadar yoğunluğu artırdı, bu da organoidler içinde daralma ve yapısal yeniden yapılanmayı düşündürdü. Bu, olgunlaşma döneminin daha organize ve T/L dokuyu taklit eden bir yapı elde etmek için kritik olduğunu gösterdi.
Ayrıca, ağırlık analizi, 0. ve 14. günler arasında organoidlerin ıslak ağırlığında önemli bir azalma olduğunu ortaya koydu, ancak yine olgunlaşma sürecinde organoidler içinde önemli bir kasılma ve ECM yeniden yapılanmasını gösterdi. Daha da önemlisi, ıslak ağırlık ölçümleri, organoid veya bulaşıklardaki kullanım ve kalıntı ortam nedeniyle deneyler arasında değişebilir. Ayrıca, organoid başlangıçta daha fazla ortam içerebilir, çünkü aşağıda tartışıldığı gibi, 0. günde, hücre tabakasının yuvarlanmasıyla oluşan katmanlar ayrılır ve kaynaşmaz. Zamanla, katmanlar birleşti ve daha kompakt hale geldi ve böylece ortam ekstrüde edilebilir.
H&E boyama ile morfolojik değerlendirme, organoid yapısal özellikler hakkında ek bilgiler sağladı. 1. günde, organoidler, esas olarak ince peri-hücresel ECM ile çevrili yuvarlak çekirdekli hücrelerden oluşan bağlantısız katmanlar sergiledi. Çekme yükünün eksenine paralel hücre hizalamasının olmaması, organoidlerin daha organize bir hücresel ve ECM mimarisini elde etmek için daha fazla olgunlaşmanın gerekli olduğunu düşündürdü. 1. ve 14. günler arasındaki kasılma ve organoid ağırlık ve boyut azalmasına rağmen, H&E boyaması eozin pozitif alanlarda bir artış gösterdi ve bu da ECM birikiminin arttığını düşündürdü. Dahası, artık görünür katmanlar yoktu ve bazen hücreler uzun çekirdeklere sahipti ve paralel hücre sıralarına yerleştirildi. Bu, organoidler içindeki hücrelerin, kendi düzenlemelerinin yanı sıra ECM birikimini, yapısını ve hizalamasını değiştirerek kendi kendini organize ettiğine ve böylece doğal T/L doku oluşumunun davranışını taklit ettiğine işaret etti.
Genel olarak, bu bulgular NHDF organoid modelinin, T/L biyolojisi, in vitro tenogenez ve hatta iskelesiz T/L mühendisliğinin daha da geliştirilmesi için değerli bir araç olarak potansiyelini vurgulamaktadır. Bununla birlikte, 3D organoid modelin başarılı bir şekilde ele alınması için üç kritik adım vardır: 1) Protokolün 2D stimülasyon aşamasında sıkı bir hücre tabakasının oluşturulması. Birincil hücreleri kullanırken, bu ağırlıklı olarak donör hücre özelliklerine bağlıdır; Bu nedenle, birden fazla bağışçıyı paralel olarak değerlendirmek önemlidir; 2) Hücre tabakasının manuel olarak haddelenmesi. Bu, hızlı bir şekilde, ancak aynı zamanda nazikçe, bir hücre sıyırıcı kullanarak hücre tabakasının yuvarlanmasını gerektirir. Bu nedenle, ilk önce bu prosedürü eğitmek için ilk organoidlerin planlanması tavsiye edilir; ve 3) Pimlerin organoid kenarlarda stabil bir şekilde sabitlenmesi. Bu fiksasyon, organoid aksiyel uzamayı sağlar ve deformitelerin yanı sıra yumru benzeri bir yapıya çökmeyi önler. Ayrıca, 3D olgunlaşma aşamasında, organoidler ECM'nin yeniden şekillenmesini deneyimlediğinden, pimler aniden ayrılabilir, bu nedenle her bir organoidi sık sık izlemek ve pimleri yeniden sabitlemek önemlidir.
Mevcut model henüz T/L dokusuna in vivo taklit seviyesine ulaşmamıştır ve bir takım sınırlamalar barındırmaktadır. Örneğin, prosedürün tamamlanması için organoid başına çok sayıda hücre ve 35 gün gerekirken, 3D kondrojenik pelet modeli gibi çoğu farklılaşma protokolü 21 gün22 olarak ayarlanmıştır. Protokol prosedüründeki yıkama adımları, tercihen, in vitro olarak yetiştirilen birincil insan hücreleri için metabolik sonuçlara yol açabilecek PBS yerine, örneğin Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) veya Earles Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) gibi fizyolojik olarak dengeli yıkama tamponu ile gerçekleştirilmelidir. Organoidde 2D stimülasyon ve 3D olgunlaşma aşamalarında kullanılan kültür ortamı ile ilgili olarak, DMEM artı% 10 FBS formülasyonu seçilmiştir, çünkü bu, yaygın olarak kabul edilen farklılaşma protokollerinin temelini oluşturur ve aynı zamanda organoidojenik özellikleri için farklı hücre tiplerini standartlaştırmak ve karşılaştırmak amacıyla yapılmıştır23. 3 aşamalı organoid protokolünün farklı laboratuvar ortamlarında çoğaltılması, kullanılan hücre tipi, hücre kalitesi ve geçişi ile donöre bağlı hücre özelliklerinden etkilenebilir. Ekipmandaki, özellikle 2D stimülasyon aşamasında kullanılan 10 cm'lik hücre kültürü kaplarının24 kalitesindeki değişiklikler, hücre tabakası oluşumunun sağlamlığını potansiyel olarak etkileyebilir. Ayrıca, 3D olgunlaşması üzerindeki ECM kasılması nedeniyle, organoidlerin pimler aracılığıyla eksenel fiksasyonu gevşeyebilir; Bu nedenle, yukarıda belirtildiği gibi, sık sık izleme önerilir. Çap ve mukavemet açısından farklı pimlerin test edilmesi ve seçilmesi de pimin ayrılma riskini azaltabilir25. Bununla birlikte, manuel germe için pimlerin kullanılması sağlam değildir ve değişkenliğe eğilimlidir; Bu nedenle, takip eden araştırmalarda, organoid kenarları tutmak için bir sıkıştırma mekanizması geliştirmek çok önemlidir, bu sadece bu adımın standardizasyonuna yol açmakla kalmaz, aynı zamanda organoidlerin dinamik olarak gerilmesine de izin verebilir. Genel olarak, organoid model modifikasyonunun iki yolunu araştırmak, biri küçültmek - organoid başına hücre sayısını ve prosedür süresini azaltmak, böylece özellikle in vitro çalışmalar için daha kullanıcı dostu hale getirmek; ve ikinci yükseltme - potansiyel tendon replasman stratejisi olarak büyük hayvan modellerinde davranışlarını test etmek için organoidlerin boyutlarını arttırmak.
Burada gösterilen model, organoidlerin farklı hücre tipleriyle birleştirilmesi ve mikro yırtılmalara maruz kalması durumunda tendon gelişiminin, patofizyolojinin ve belki de onarım ve rejenerasyonun altında yatan mekanizmaları araştırmak için bir platform sağlayabilir. Kroner-Weigl ve ark. 20237 , NHDF hücre tipiyle ilgili çeşitli sınırlamalar tanımlamıştır, yani NHDF'lerin oluşturduğu organoidler, T/L hücrelerinden türetilenlerden daha büyük ve daha hücreseldir, bu da hücre çoğalmasını ve davranışını kontrol etmeyi zorlaştırır. Hücre apoptozu ile ilgili olarak, terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik ucu etiketleme (TUNEL) bazlı tahlil, 147. günde organoid boyunca ölü hücrelere dair hiçbir kanıt göstermedi, bu da 3D olgunlaşma adımı sırasında besinlerin, atıkların ve oksijenin uygun şekilde difüzyonunu düşündürdü. İlginç bir şekilde, morfolojik farklılıklara rağmen, bir dizi T / L ile ilişkili genin (farklı kollajen tipleri, Skleraksi (SCX), Mohawk (MKX), vb. dahil) kantitatif PCR ile pilot taraması, NHDF ve T / L organoidleri arasında karşılaştırılabilir gen ekspresyonunu önerdi7, daha fazla araştırılması ve protein düzeyinde doğrulanması gereken bir bulgu. Bu nedenle, bu hücre tipi için, T / L farklılaşmasını desteklemek için daha fazla optimizasyon gereklidir ve 2D stimülasyon ve 3D olgunlaşma adımlarında kullanılan ortamın ayarlanmasına (örneğin, serum konsantrasyonu, büyüme faktörleri, vitaminler) dayanabilir, olgunlaşma süresinin uzatılmasına ve hatta organoidlerin dinamik mekanik gerilmeye tabi tutulmasına dayanabilir. Protokolün geliştirilmesi, organoid bileşimsel, yapısal ve fonksiyonel özellikleri daha da iyileştirebilir, böylece modelin kompleksi in vivo T/L doku nişini daha iyi taklit etmesini sağlayabilir. Ayrıca, alternatif hücre kaynakları, T/L organoidleri oluşturma kapasiteleri ve T/L farklılaşmasına uğrayıp uğramayacakları açısından araştırılabilir. Yan ve ark. 20209, genç/sağlıklı ve yaşlı/dejeneratif tendon kök/progenitör hücreleri (Y-TSPC'ler ve A-TSPC'ler) kullanarak 3D organoid modelini kullanarak hücresel davranışı 3D olarak araştırmak ve tendon oluşturma kapasitesinin T/L yaşlanması ile değişip değişmediğini araştırmak için kullandı. A-TSPC 3D organoidlerinin zayıf doku morfolojisi sergilediğini ve içindeki hücrelerin daha düşük bir proliferasyon hızına sahip olduğunu, ancak yüksek yaşlanma ile ilgili belirteçlere paralel olarak daha yüksek apoptoza sahip olduğunu bildirmişlerdir9. Bu nedenle, T / L 3D organoid modeli, tendon yaşlanmasında yer alan moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için umut verici bir platformdur ve ayrıca tendon onarımı ve rejenerasyonu için yeni farmakolojik tedavileri test etmek için kullanılabilir. Farklı bir yaklaşımda, Chu ve ark. 2021, ligamentojenik farklılaşmalarını değerlendirmek için 3D organoid modelde diş folikülü hücrelerini (DFC'ler) uyguladı. Bu hücre tipi çok iyi organize edilmiş organoidler oluşturmuştur, bu nedenle DFC'leri periodontal ligament (PDL) dokusunda farklılaşmak için çekici bir hücre kaynağı olarak düşündürmektedir ve bu da periodontitis8 için umut verici bir terapötik strateji geliştirebilir.
Gelecekte, model, hücreye özgü davranışlar ve organoidler içindeki hücresel karışma hakkında yeni bilgiler sunabilecek ve T/L biyolojisi, fizyolojisi ve patofizyolojisinin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunabilecek farklı hücre tiplerini (örneğin, miyofibroblastlar, makrofajlar) dahil ederek daha da karmaşık hale gelebilir 8,9,16,26.
3D organoid modeller, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp uygulamaları için çeşitli avantajlara sahiptir. İnsan dokularının hücresel bileşimi ve organizasyonunun yanı sıra hücreden hücreye ve hücreden matrise etkileşimlerini yakından taklit ederler, böylece hastalık mekanizmalarını ve ilaç tepkilerini incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir platform sunarlar27. Organoidler, farklı ilaçların etkinliğini ve aynı zamanda potansiyel yan etkilerini değerlendirmek ve hayvan testlerine güvenilir ve düşük maliyetli bir alternatif sağlamak için yüksek verimli bir tarama platformu olarak kullanılabilir. Ayrıca, sağlıklı ve hastalıklı durumlar arasında doğrudan karşılaştırmalara olanak tanıyarak, çeşitli patolojilerle ilişkili temel moleküler ve hücresel değişikliklerin keşfedilmesine, erken hastalık tespiti için biyobelirteçlerin tanımlanmasına ve hastalık mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasının kolaylaştırılmasına ve hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesine olanak tanır28,29.
Birlikte ele alındığında, T/L doku biyolojisi ve çeşitli hücre tiplerinin in vitro tenojenik süreçlerini incelemek için umut verici bir platform sağlayan daha önce kurulmuş 3D T/L organoid modelinin adımlarını ayrıntılı olarak gösterdik. Bu modelin daha fazla uygulanması, optimizasyonu ve araştırılması, iskele içermeyen T/L mühendislik stratejilerinin geliştirilmesine yol açabileceğinden ve bu da T/L tedavisinin iyileştirilmesine katkıda bulunabileceğinden, şiddetle teşvik edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
D.D. ve S.M.-D. BMBF Hibesi "CellWiTaL: İlaç araştırmaları için tekrarlanabilir hücre sistemleri - üç boyutlu hücresel yapılarda son derece spesifik tek hücrelerin transfer katmansız lazer baskısı" Teklif Nr. 13N15874'ü kabul edin. D.D. ve V.R.A., AB MSCA-COFUND Hibesini kabul etti: OSTASKILLS "Yeni nesil Osteoartrit araştırmalarının bütünsel eğitimi", GA Nr. 101034412. Tüm yazarlar teknik yardım için Bayan Beate Geyer'e teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H.
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
