Summary
Multiplex syklisk immunhistokjemi tillater in situ deteksjon av flere markører samtidig ved bruk av gjentatt antigen-antistoff inkubasjon, bildeskanning og bildejustering og integrasjon. Her presenterer vi operasjonsprotokollen for å identifisere immuncellesubstrater med denne teknologien i lungekreft og parrede hjernemetastaseprøver.
Abstract
Tumormikromiljøet involverer interaksjoner mellom vertsceller, tumorceller, immunceller, stromale celler og vaskulatur. Karakterisering og romlig organisering av immuncelleundergrupper og målproteiner er avgjørende for prognostiske og terapeutiske formål. Dette har ført til utviklingen av multipleksede immunhistokjemiske fargemetoder. Multiplex fluorescens immunhistokjemi tillater samtidig deteksjon av flere markører, noe som letter en omfattende forståelse av cellefunksjon og intercellulære interaksjoner. I denne artikkelen beskriver vi en arbeidsflyt for multiplex syklisk fluorescerende immunhistokjemianalyse og dens anvendelse i kvantifiseringsanalysen av lymfocyttundergrupper. Multiplex syklisk fluorescerende immunhistokjemifarging følger lignende trinn og reagenser som standard immunhistokjemi, som involverer antigengjenfinning, syklisk antistoffinkubasjon og farging på et formalinfast parafininnebygd (FFPE) vevslysbilde. Under antigen-antistoffreaksjonen fremstilles en blanding av antistoffer fra forskjellige arter. Forhold, som antigeninnhentingstid og antistoffkonsentrasjon, optimaliseres og valideres for å øke signal-støy-forholdet. Denne teknikken er reproduserbar og fungerer som et verdifullt verktøy for immunterapiforskning og kliniske applikasjoner.
Introduction
Hjernemetastaser (BM) representerer de vanligste svulstene i sentralnervesystemet (CNS), som forekommer i nesten halvparten av ikke-småcellet lungekreft tilfeller (NSCLC), med dårlig prognose1. Anslagsvis 10%-20% av NSCLC-pasientene har allerede BM på tidspunktet for den første diagnosen, og ca. 40% av NSCLC-tilfellene vil utvikle BM i løpet av behandlingen2. Tumormikromiljøet (TME) er nært forbundet med NSCLC-forekomst og BM, inkludert forskjellige komponenter, for eksempel blodkar, fibroblaster, makrofager, ekstracellulær matrise (ECM), lymfoid, benmargsavledede immunceller og signalmolekyler 3,4. Mikromiljømessige immunceller spiller en avgjørende rolle i å påvirke kreftcellevekst og utvikling. Hjernemetastaser presenterer mange potensielle behandlingsmål preget av komplekse immunologiske mikromiljøer og signalprosesser. For eksempel har PD-1-hemmere vist klinisk effekt for pasienter med lungekreft hjernemetastase (LCBM) som en immunkontrollpunkthemmer (ICI). Imidlertid varierer responsfrekvensen på PD-1-terapi mellom primær NSCLC og LCBM5, noe som tyder på at tumorimmunmikromiljøet fungerer som en kritisk ICI-regulator.
Immunhistokjemi (IHC) er et uvurderlig verktøy innen biologi, grunnmedisin og patologi6. Denne deteksjonsmetoden visualiserer antigenuttrykk gjennom samspillet mellom antigen-antistoff på et vevslysbilde7. IHC brukes til å diagnostisere prediktive markører, evaluere prognostiske markører, veilede målrettede terapier og utforske tumorcellers biologiske funksjoner8. Den tradisjonelle IHC-metoden kan imidlertid bare oppdage én biomarkør om gangen. For å møte denne begrensningen har innovasjonen av immunhistokjemisk teknologi ført til utviklingen av multiplex fluorescens immunhistokjemi (mfIHC), som muliggjør samtidig identifisering av flere proteinmarkører på samme vevslysbilde, både i lyse felt og fluorescerende felt9. Denne fremgangen gir nøyaktig analyse av cellesammensetning og molekylære interaksjoner mellom stromale celler, immunceller og kreftceller i TME.
I denne studien presenterer vi en protokoll for multiplex syklisk immunhistokjemi for å analysere den romlige fordelingen av immunceller. To primære antistoffer av forskjellige arter, som kanin og rotte, velges for inkubering samtidig, etterfulgt av fluorescensmerkede sekundære antistoffer. Antigenuthenting utføres etter hver runde med antigen-antistoffreaksjon. Autofluorescens er blokkert, og 4', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) brukes til farging av kjernene. Panelet inkluderer sekvensiell påvisning av CD3, CD8, CD20 og CK, celler er kategorisert i henhold til markørene: tumorceller (CK+), modne T-celler (CD3+), cytotoksiske T-celler (CD3+CD8+), B-celler (CD20+)10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen ble godkjent av den medisinske etikkomiteen ved Yunnan Cancer Hospital / Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University. Alle forsøkspersonene/vergene signerte informert samtykke.
1. Klargjøring av lysbilde
- Kutt seksjoner av parrede parafinblokker som inneholder primær lungetumor eller lungekreft hjernemetastaser celler i en tykkelse på 4 μm ved hjelp av en mikrotom. Fjern seksjoner til vann og skill med pinsett, velg den beste og fest den på det polylysinbelagte lysbildet.
- Plasser lysbildene av vev i en ovn ved 65 °C i 30 minutter for å forbedre vevsadhesjonen.
- Fordyp lysbildene i xylen gjennom tre endringer, som hver varer i 10 minutter.
- Reduser gradvis alkoholkonsentrasjonen og inkuber lysbilder i 100% etanol i 5 minutter, 90% etanol i 5 minutter, 75% etanol i 5 minutter og i avionisert vann i 3 minutter.
2. Varmeindusert epitoputhenting (HIER)
- Fortynn 100x natriumcitratbufferløsning (pH 6,0) til 1x (10 mM) i avionisert vann, og klargjør nok bufferløsning til å senke lysbildene helt.
- Plasser lysbildene i en trykkoker, og utsett dem for høy varme (100 °C) og trykk (~30 psi) i 2 minutter. Etter oppvarming, la lysbildene avkjøles til romtemperatur i destillert vann i 3 minutter.
- Løs opp en pakke med 52 g fosfatbufret saltvann (PBS; pulverisert) i 5 liter avionisert vann for fremstilling av PBS-bufferløsning (pH 7,0). Plasser lysbildene i PBS bufferløsning i 5 min, med 3 endringer.
3. Peroksidase blokkering
- Dekk seksjonene med 3% hydrogenperoksid og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Skyll lysbildene i PBS, 3x i 5 min hver.
- Bruk filterpapir for å absorbere overflødig vann vekk fra omkretsen av vevet. I mellomtiden må du sørge for at vevet er fuktig.
4. Primær antistoffinkubasjon for første runde
- Klargjør en arbeidsblanding av de primære antistoffene for CD8 (Rabbit monoklonalt antistoff, klon SP16) og CD20 (musmonoklonalt antistoff, klon L26), fortynnet 1:50 i Bond primære antistoff fortynningsmiddel.
- Legg antistoffkomplekset på seksjonene og inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Forbered en oppløsning av 0,1 % mellom-/fosfatbufret saltvann: 1 ml Tween i 1 liter PBS-bufferløsning.
- Vask seksjonene med 0,1% mellom-/fosfatbufret saltvann, 3x i 5 min hver. Bruk filterpapir for å trekke overflødig vann vekk fra omkretsen av vevet, i mellomtiden, sørg for at vevet er fuktig.
5. Sekundær antistoffinkubasjon for første runde
- Forbered en blanding av fluorescensmerket geitantikaninantistoff (eksitasjon (Ex): 495 nm) og geitantimusantistoff (Ex: 578 nm), fortynnet 1:50 i fosfatbuffersaltvann. Geitantikaninantistoffet festes til det primære antistoffet av CD8, og geitantimuseantistoffet festes til det primære antistoffet av CD20.
- Tilsett den sekundære antistoffblandingen dråpevis og inkuber ved romtemperatur i 1 time.
6. Varmeindusert epitoputhenting og peroksidaseblokkering
- Fortynn 100x natriumsitrat (pH 6,0) til 1x (10 mM) i avionisert vann, og klargjør nok bufferløsning til å senke lysbildene helt.
- Plasser lysbildene i en trykkoker og utsett dem for høy varme (100 °C) og trykk (~30 psi) i 1 min. Etter oppvarming legger du skliene i destillert vann for å avkjøles til romtemperatur i 3 minutter.
- Utfør peroksidaseblokkering som beskrevet i trinn 3.
7. Primær antistoffinkubasjon for andre runde
- Klargjør en arbeidsblanding av de primære antistoffene for CD3 (Rabbit monoklonalt antistoff, klon SP7) og CK (monoklonalt antistoff fra mus, MX005), fortynnet 1:50 i primært antistoff fortynningsmiddel.
- Legg antistoffkomplekset på seksjonene og inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Vask med 0,1 % mellom-/fosfatbufret saltvann, 3x i 5 minutter hver. Bruk filterpapir for å trekke overflødig vann vekk fra omkretsen av vevet, i mellomtiden, sørg for at vevet er fuktig.
8. Sekundær antistoffinkubasjon for andre runde
- Forbered geit anti-kanin (Ex: 652 nm) og geit anti-mus antistoff (Ex: 590 nm) blanding, fortynning 1:50 i fosfatbuffer saltvann. Geitantikaninantistoffet festes til det primære antistoffet av CD3, og geitantimuseantistoffet festes til det primære antistoffet av CK.
- Tilsett sekundær antistoffblanding dråpevis, inkuber ved romtemperatur i 1 time. Vask med 0,1 % mellom-/fosfatbufret saltvann, 3x i 5 minutter hver.
9. Autofluorescensslukking og DAPI-farging
- Tilsett reagens (0,15 M/L KMnO4) i vevsseksjonen i 1 min. Skyll med rennende vann i 5 min.
FORSIKTIG: KMnO4 er giftig og skader huden. Sørg for å bruke hansker når du håndterer lysbildene. Hvis væsken drypper på huden, tørk den av raskt med rene servietter og skyll med rennende vann. - Tørk lysbildet med økende konsentrasjoner av alkohol (70%, 90%, 100%), i 3 minutter i hver konsentrasjon.
- Legg til DAPI og coverslip for multispektral avbildning. Mengden DAPI avhenger av vevsstørrelsen. Forsikre deg om at vevet er helt dekket av DAPI etter at dekselet er tilsatt.
10. Skyv skanning
- Plasser lysbildene på et brett og skyv til det ikke kan skyves lenger.
- For å starte programmet, dobbeltklikk på programikonet på skrivebordet. Under oppstart vises modusvalgvinduet. Valgvinduet viser to lysfelt- og fluorescerende moduser: automatisk modus og manuell modus. I fluorescerende skannemodus klikker du på Automatisk modus.
- Flytte musepekeren over ? -knappen for å vise informasjonen om innstillingene. Klikk Filterinnstilling > Filterkanal for å velge Kanalnummer > Pseudofarge. Definer fargen og lagre.
- Klikk Rutinearbeid > skannemodus > Full automatisk. Klikk Rutinearbeid > lysbildenavn for å definere lysbildenavn for utdata. Klikk på Rutinearbeid > Kanalinnstillinger for å velge filtre.
- Klikk Rutinearbeid > Skannealternativer for å bestemme den resulterende kvaliteten og lagringsstedet for det virtuelle lysbildet.
- Klikk Forhåndsvisning for terskelinnstilling og valg av området som skal skannes.
- Klikk på Maskinvare > filtre > Live > Autofokus > Automatisk eksponering > Digital forsterkning > Merk av for bruk manuell eksponeringstid > Merk av for å begrense området > Still inn gjeldende.
- Klikk på Rutinearbeid > Start skanning. Velg forstørrelsesnivå som 20x eller 40x. Velg 20x for passende filstørrelser. MRXS-utvidelsen er definert av 3D Pannoramic MIDI-skanner. Bildeutvidelsen kan også endres til TIFF-bilde.
- Klikk Slide Viewer > Multiview Toolbox for å velge bildet for konfokal, og deretter justere og integrere bildet.
11. Kvantitativ evaluering av celletettheter
- Kvantifiser prosentandeler av positive immunceller (CD3+, CD3+CD8+, CD20+) i tumor- og stromaområder med Halo 10-skannerprogramvare. Valider CK-farging for å definere tumorvev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterer en protokoll for syklisk antigendeteksjon ved bruk av 5-farget multiplexfluorescens på et enkelt lysbilde. Gjennom vår optimalisering av analysen muliggjør vi inkubasjon av to antistoffer fra forskjellige arter (figur 1). De nødvendige enhetene for forsøksprosedyren inkluderer en trykkkomfyr og immunfargingsboks (figur 2A).
Etter å ha fullført analysen, definerer vi pseudofargen til de fire markørene før vi skanner lysbildene. Pseudofargene til CD3, CD8, CD20 og CK er henholdsvis gul, rød, grønn og cyan. Kjernene er merket med DAPI. Representative regioner av tumor og stroma er valgt for analyse. Fluorescerende spektrum ved 495 nm, 578 nm, 652 nm og 590 nm fanges opp ved hjelp av 3D automatisk digital lysbildeskanner. Representativt stabelbilde og enkeltmerkede bilder i lungekreftmetastaser er vist i figur 2B. Basert på bilder som inneholder enkeltmarkørfluorescenssignal, ekstraherte skannerprogramvaren cellefenotypeegenskaper basert på pseudofarge. Tilsvarende antall positive immunceller og totale immunceller ble også talt. Hvert farget proteinnivå kvantifiseres i de oppdagede vevene ved å beregne H-score12. Etter disse prosedyrene telles og analyseres antallet av hver tumorinfiltrerende lymfocyttertype og andelen av hver celletype i det totale antall målceller. Andelen av hver immuncelletype presenterer den effektive prosentandelen av tumorinfiltrerende lymfocytter. Prosentandelen av CD3+, CD3+CD8+ T-celler og CD20+ B-celler ble analysert i hjernemetastaser fra lungekreft sammenlignet med primære lungekreftseksjoner. Representative resultater er vist i figur 3. Tettheten av immunceller (CD3 + T-celler, CD3 + CD8 + T-celler) er lavere i lungekreft hjernemetastaser enn primær lungekreft. CD20+ B-celler er høyere i hjernemetastasegruppen enn den primære lungekreftgruppen. Resultatene er imidlertid ikke signifikant forskjellig mellom disse to gruppene for de begrensede utvalgene.
Figur 1: Arbeidsflyt for multiplekssyklisk fluorescens immunhistokjemifarging. De 4 μm seksjonene er kuttet og festet på lim lysbilde. Følgende operasjonstrinn utføres: deparaffinisering og rehydrering, antigeninnhenting, antigenhenting, antigenblokkering, inkubasjon av primær antistoffblanding, sekundær antistoffinkubasjon, deretter gjenta trinnene for antigeninnhenting, antigenblokkering, inkubasjon av primær antistoffblanding og sekundær antistoffinkubasjon, etterfulgt av å redusere autofluorescens, velge riktig filter for lysbildeskanning og analysere resultatene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Operasjonsmetoder for multiplex fluorescens immunhistokjemisk farging. Antigenbehandling utføres ved oppvarming av seksjoner i en trykkoker. (A) Trykkokeren brukes til varmeindusert epitoputhenting. I prosessen med antistoffinkubasjon plasseres lysbildene i immunfargingsboksen. (B) Representative sammensatte og enkeltfargede bilder for panelet som brukes i lungekreft hjernemetastaser vev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Immuncelleandel innen primær lungekreft og lungekreft hjernemetastaser. CD3+, CD3+CD8+, CD20+ immunceller andel i fire lungekrefthjernemetastaser vev er lavere enn paret primært lungekreftvev (feilfelt: Standardavvik). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet prosessen for multiplex syklisk fluorescens immunhistokjemi farging. Det primære antistoffvalget er et avgjørende aspekt ved fluorescensimmunhistokjemianalysen, og monoklonale antistoffer anbefales for bedre spesifisitet og repeterbarhet. For å optimalisere arbeidskonsentrasjonen av det primære antistoffet, har en rekke fortynninger blitt testet gjennom immunhistokjemiske eksperimenter. Både positive kontroller (for å vurdere målantigenuttrykk) og negative kontroller (ingen primær antistoffinkubasjon) er essensielle og bør settes opp.
I denne protokollen fortynnes de primære antistoffene og fremstilles for en blanding fra forskjellige arter. De fluorescensmerkede sekundære antistoffene er også samlet og inkubert på samme måte, avledet fra forskjellige arter. Så det kritiske trinnet er å velge arten for forskjellige primære antistoffer basert på antigenene, og det monoklonale antistoffet foretrekkes sammenlignet med polyklonalt antistoff. Disse kan sikre at kombinasjonen mellom primært antistoff og sekundært antistoff er spesifikk. Den blandede væsken skal oppnå arbeidskonsentrasjon for både primære antistoffer og kryssreaktivitet bør ikke eksistere mellom de to antistoffene samtidig. Hvis de primære antistoffene er av samme art, inkuberes ett sekundært antistoff først, deretter det andre. Ved bestemmelse av sekvensen av primær antistoffinkubasjon i et panel bør antistoffer som er følsomme for antigen-antistoffreaksjonen prioriteres, for lavuttrykksantigenene vil intensiteten styrkes under andre epitoputhenting. Før andre runde med antistoffinkubasjon tar gjentatt antigenuthenting kortere tid (1 min) sammenlignet med første operasjon (2 min). Fluorescensintensiteten fra tidligere syklisk farging vil ikke reduseres selv om seksjonene gjennomgår varmeindusert uthenting to ganger. For å unngå uspesifikk immunoreaktivitet må inkubasjonsbetingelsene optimaliseres, inkludert antistoffkonsentrasjon, inkubasjonstid og omgivelsestemperatur.
Ulike metoder for epitoputhenting har blitt utviklet de siste tiårene, primært delt inn i varmeindusert epitoputhenting (HIER) og proteaseindusert epitoputhenting (PIER). Oppvarming er en effektiv antigenuthentingsmetode som eksponerer antigenepitoper, noe som gjør dem mer effektivt påvist av antistoffer13. De to hovedalternativene for antigenuthenting er basert på citratbuffer og høy pH EDTA-buffer14. Den optimaliserte gjenfinningstilstanden identifiseres i henhold til målantigenet.
Autofluorescens kan forstyrre fluorescerende avbildning på seksjoner forårsaket av endogene fluoroforer og reagenser som brukes i vevsbehandling15. Bruk av et tilknyttet reagens er nødvendig for eluering. Fluoroforer velges med utslippstopper som unngår autofluorescenstopper (rundt 490 nm)16,17. Sudan Black B og NaBH4 er rapportert for slukking av vevsautofluorescens18,19. Kombinasjonen av Sudan Black B og NaBH4 reduserte fluorescensbakgrunnen i målrettet nyreformalinfiksert parafininnebygd vev20. I denne protokollen er vevsbehandlingen av KMnO4 i en konsentrasjon på 0,15 M / L tidsbesparende i 1 min. KMnO4 dekker et lag på vevet for å skjerme spontan fluorescens og reduserer bakgrunnsfluorescens, den spesifikke fargingen av detektert protein er mer visualisert.
Hele lysbildene skannes i fire forskjellige filterkanaler, bildejusteringsanalyse er nødvendig, det er en stor utfordring å justere lokaliseringen av enkeltcelle- og subcellulære strukturer. For multispektrale bilder fra denne teknikken er det nødvendig med profesjonelt lysbildeutstyr og kvantitativ analyseprogramvare for å unngå spektral krysstale. Den dyre kostnaden for instrumentet begrenser søknaden. Co-inkubasjon av to antistoffer sparer tid, spesielt når det gjelder et 6-markørpanel, som krever 3 inkubasjonssykluser. Denne teknikken brukes til å visualisere mer detaljert karakterisering av immunceller i tumorimmunmikromiljøer. I fremtiden vil metoden bli brukt til kvantitativ analyse av tumorassosierte tertiære lymfoide strukturer.
Oppsummert gjør multiplex syklisk fluorescens immunhistokjemi at flere mål kan farges av individuelt merkede fluoroforer på et enkelt lysbilde. Denne analysen gir en bedre forståelse av den romlige fordelingen av celler i tumorimmunmikromiljøet, og den romlige nærheten til tumorimmunceller bidrar til screening av pasienter som vil ha nytte av immunterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen kjente konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold som kunne ha syntes å påvirke arbeidet rapportert i denne artikkelen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (NO.81860413, 81960455), Yunnan Science and Technology Department Fund (202001AY070001-080), Scientific Research Foundation of Education Department of Yunnan Province (2019J1274).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
| 100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
| 3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
| 3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
| Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
| Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
| Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
| Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
| CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
| CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
| CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
| CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
| DAPI | sig-ma | D8417 | |
| ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
| Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
| PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
| slide viwer | 3D histech Ltd | ||
| xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |
References
- Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations. J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).
- Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic. J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).
- Vilariño, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic. Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).
- Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).
- Goldberg, S. B., et al. Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).
- Sukswai, N., Khoury, J. D. Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection. Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology. Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).
- Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry. J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).
- Wong, P. F., et al. Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).
- Sanchez, K., et al. Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer. Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).
- Zhang, W., et al. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).
- Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue. MethodsX. 5, 1-7 (2018).
- McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone. J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).
- Clarke, G. M., et al. A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer. Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).
- Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).
- Ahrens, M. J., Dudley, A. T. Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity. J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).
- Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
