박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 항균 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서의 핵분열 효모

Summary

핵분열 효모는 FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질을 GFP와 함께 번역 융합 단백질로 발현하여 중합을 시각화하는 이종 숙주로 사용됩니다. 또한 중합에 영향을 미치는 화합물은 형광 현미경을 사용하여 이미징하여 식별합니다.

Abstract

FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질은 세포 분열 및 세포 형태 유지와 같은 필수 기능을 수행합니다. 또한 FtsZ와 MreB는 새로운 항균제 발견을 위한 중요한 표적으로 부상했습니다. 이러한 세포골격 단백질의 뉴클레오티드 결합 및 중합을 표적으로 하는 화합물을 식별하기 위해 여러 분석법이 개발되었으며, 주로 FtsZ에 초점을 맞추고 있습니다. 더욱이, 많은 분석법은 힘들거나 비용이 많이 들며, 이러한 단백질이 약물의 세포 표적인지 여부를 확인하려면 여러 가지 방법이 필요한 경우가 많습니다. 마지막으로, 진핵 세포에 대한 약물의 독성도 문제를 제기합니다. 여기에서는 박테리아 세포골격을 표적으로 하는 새로운 분자를 발견하고 진핵 세포에 잠재적으로 독성이 있을 수 있는 공격을 최소화하기 위한 단일 단계 세포 기반 분석에 대해 설명합니다. 핵분열 효모는 현미경을 기반으로 한 고처리량 스크리닝에 적합하며, 육안 스크리닝은 FtsZ 또는 MreB의 중합을 변경하는 모든 분자를 쉽게 식별할 수 있습니다. 당사의 분석은 표준 96웰 플레이트를 사용하며 분열 효모와 같은 진핵 세포에서 중합하는 박테리아 세포골격 단백질의 능력에 의존합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 핵분열 효모에 대한 것이며 황색포도상구균 의 FtsZ와 대장균의 MreB를 활용하지만, 모든 진핵생물 발현 호스트에서 고분자로 쉽게 조립되는 다른 박테리아 세포골격 단백질에 쉽게 적용할 수 있습니다. 여기에 설명된 방법은 박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 새로운 항균제의 추가 발견을 촉진하는 데 도움이 될 것입니다.

Introduction

현재 세균 감염을 퇴치하기 위해 사용되는 거의 모든 항생제에 대한 광범위한 내성으로 인해 새로운 범주의 항생제가 즉시 필요하게 되었습니다. 2019년 보고서에 따르면 항생제 내성 감염으로 인해 127만 명이 목숨을 잃었으며, 내성 세균 감염으로 인한 합병증을 고려할 때 총 495만 명이 사망한 것으로 집계되었습니다¹. 임상에서는 여전히 효과적이지만, 현재 사용되는 항생제는 주로 세포벽, DNA 및 단백질 합성에 초점을 맞춘 좁은 범위의 세포 과정을 표적으로 합니다. 지난 반세기 동안 새로운 항균제 ^2,3 개발의 대상으로 상업적으로 이용된 단백질은 30개 미만입니다. 이처럼 실행 가능한 표적의 범위가 제한되어 있기 때문에 항생제 내성 박테리아와 싸우기 위한 새로운 항생제 또는 그 유도체를 발견하는 데 상당한 제약이 있습니다. 따라서 새로운 항생제 내성 문제를 극복하기 위해서는 새로운 표적과 작용 기전을 가진 새로운 항생제의 개발이 필요합니다.

항균 표적은 이상적으로 박테리아 세포 성장의 필수 구성 요소여야 하고, 계통 발생학적으로 다양한 종 전체에 걸쳐 보존되어야 하며, 진핵생물 상동성이 가장 적어야 하고, 항생제에 접근할 수 있어야 한다⁴. 세포 분열 및 세포 형태 유지에 관여하는 세균성 세포골격 단백질의 발견 이후, 항균 화합물 개발을 위한 유망한 초점으로 부상했다⁵. 이 단백질은 박테리아의 생존력에 필수적이며 진핵 세포의 세포골격과 유사한 세포 모양(MreB, CreS), 분열(FtsZ, FtsA) 및 DNA 분리(ParM, TubZ, PhuZ, AlfA)를 유지하는 데 중추적인 역할을 합니다. 특히, FtsZ는 광범위한 원핵 생물에서 매우 높은 수준의 보존을 보이는 반면, MreB는 거의 모든 막대 모양의 박테리아에서 발견됩니다. 세포 생존력에 대한 이러한 광범위한 분포와 관련성으로 인해 이러한 단백질은 항생제 연구에서 매력적인 표적이 됩니다 ^5,6,7.

in vivo 관찰, in vitro 상호작용 및 효소 실험을 결합한 다각적인 접근법을 채택하여 잠재적 억제제의 주요 표적인 박테리아 세포골격 단백질을 철저히 검증하는 것이 중요합니다⁷. 번거로운 절차나 상당한 비용 문제로 인해 이러한 목적을 위해 사용 가능한 많은 분석법이 어려움을 겪고 있습니다. 이는 박테리아 세포골격에 영향을 미칠 수 있는 납 화합물을 스크리닝하는 데 널리 사용되는 데 주목할 만한 장애물입니다. 이 중 현미경 검사는 세포 형태의 변화를 직접 검사하여 화합물의 효과를 평가하는 매우 효율적이고 신속한 방법으로 두드러집니다. 그러나 표적 단백질과 다른 세포골격 복합체의 이종 연관성, off-target 결합 및 막 전위의 변화로 인한 간접 효과, 세포에 효율적으로 침투하기 어려운 점, 특히 그람 음성 박테리아에서 유출 펌프의 존재로 인해 박테리아 세포 변형의 정확한 원인을 정확히 찾아내는 것이 총체적으로 복잡합니다 ^8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe 또는 일반적으로 알려진 핵분열 효모는 막대 모양의 단세포 진핵 생물입니다. 핵분열 효모는 세포주기 및 분열, 세포 조직 및 염색체 복제와 같은 세포 과정의 탁월한 보존으로 인해 세포 및 분자 생물학에서 모델 유기체로 널리 사용됩니다^11,12. 더욱이, Errington과 동료들은 핵분열 효모에서 극 국소화된 박테리아 세포골격 단백질 DivIVA를 발현하여 DivIVA가 음의 곡면¹³에 축적되었음을 입증했다. 다시 말하지만, Balasubramanian과 그의 연구는 MreB¹⁴ 및 tubulin homolog FtsZ¹⁵와 같은 E. coli actin cytoskeleton 단백질의 메커니즘, 조립 및 역학에 대한 새로운 통찰력을 제공하기 위해 세포 모델 시스템으로 핵분열 효모를 처음으로 확립했습니다. 또한 효모¹⁴에서 발현될 때 에피형광 현미경을 통해 MreB의 중합을 효율적으로 방해하는 A22의 능력을 보여줍니다. 그 후, 다른 그룹들도 엽록체 FtsZ1 및 FtsZ2 단백질의 조립 특성을 연구하기 위해 핵분열 효모를 성공적으로 사용하였다¹⁶. 보다 최근에는 황색포도상구균 및 헬리코박터 파일로리 ¹⁷에서 유래한 알려진 세 가지 FtsZ 억제제(sanguinarine, berberine 및 PC190723-on FtsZ protein)의 영향에 대한 포괄적인 평가를 수행하여 박테리아 세포골격 억제제를 특이적으로 스크리닝하기 위한 세포 플랫폼으로서의 핵분열 효모 사용의 실행 가능성에 대한 개념 증명을 확립했습니다. 또한 이 단일 단계 세포 기반 분석은 진핵 세포에 잠재적으로 독성이 있을 수 있는 화합물을 식별하는 위험을 최소화하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었습니다.

이 보고서에서는 핵분열 효모 시스템을 활용하여 황색포도 상구균의 FtsZ와 대장균의 MreB를 표적으로 하는 저분자 억제제의 효과에 대한 반자동 스크리닝 및 정량화를 위해 표준 96웰 플레이트를 사용하는 체계적인 워크플로우를 제안합니다. 여기에서는 각각 FtsZ와 MreB를 특이적으로 표적으로 하는 확립된 억제제인 PC190723 및 A22를 사용하여 반자동 워크플로우를 설정하고 최적화합니다. 이 워크플로우는 전동식 고정밀 스테이지가 장착된 에피형광 현미경을 사용하고 표준 96웰 플레이트에서 자동 이미지 획득을 통해 현재의 표준화를 개선합니다. 따라서 합성 화학 라이브러리의 중간 및 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있으며 위에 나열된 몇 가지 문제를 피할 수 있습니다.

Protocol

1. S. pombe에서 GFP 표지된 세균 세포골격 단백질의 발현

NOTE: 여기에 사용된 모든 plasmids 및 strain에 대한 정보는 표 1 을 참조하십시오. 모든 미디어 구성에 대해서는 표 2 를 참조하십시오.

1. N-말단 GFP 융합(GFP-MreB) 및 C-말단 GFP(SaFtsZ-GFP)를 운반하는 S. aureus FtsZ를 S. pombe 발현 벡터, pREP42에 앞서 설명한 바와 같이 중간 강도의 티아민-억제성 프로모터, nmt41^18,19로 클로닝을 수행합니다^14,15. ^20,21에 설명된 대로 E. coli 균주(DH10β)에서 플라스미드를 유지, 증폭 및 분리합니다.
   참고: DH5α, XL1Blue, TOP10 등과 같은 다른 대장균 균주 또는 분자 클로닝에 일상적으로 사용되는 기타 상업적으로 이용 가능한 세포도 사용할 수 있습니다.
2. 플라스미드 pREP42-GFP-EcMreB 및 pREP42-SaFtsZ-GFP를 S. pombe로 형질전환
   1. 아래 단계에서 언급한 바와 같이 리튬 아세테이트 방법²²를 사용하여 플라스미드 pCCD3(pREP42-GFP-EcMreB) 및 pCCD713(pREP42-SaFtsZ-GFP)을 S. pombe 균주(h-leu1-32 ura4-D18)로 형질전환시킵니다.
   2. 1일차 - 1차 배양: 고압멸균 효모 추출물 및 보충제(YES) 육수 3mL에 갓 줄무늬가 있는 S. pombe 배양액을 한 루프 가득 접종합니다. 30°C의 오비탈 셰이커에서 하룻밤(O/N)으로 배양합니다.
   3. 2일차:
      1. 2차 배양: 약 500μL의 1차 배양액을 30mL의 오토클레이브 YES 육수에 추가합니다. 30 °C에서 3 - 4 시간 동안 OD₆₀₀ 이 0.4 - 0.6이 될 때까지 흔들어 배양합니다.
         참고: 각 변환에 대해 30mL가 사용됩니다.
      2. 30mL 배양액을 2,500 x g 에서 실온에서 6-8분 동안 펠렛합니다. 상층액을 버리고 50mL의 멸균 증류수(D/W)로 세포를 세척합니다. 다시 펠릿을 아래로 내리고 상층액을 버립니다. 1mL의 멸균 D/W에 세포를 재현탁시키고 2mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 위와 같이 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다.
      3. 위와 같이 0.1M 아세트산 리튬 1mL, Tris-EDTA(LiAc-TE) 용액을 넣고 원심분리합니다. 상층액을 버리고 0.1M LiAc-TE의 1mL에 재현탁합니다. 상층액을 원심분리하고 버리고 100μL의 용액을 남깁니다.
      4. 10 - 20 μg의 캐리어 DNA(연어 정자 DNA, 얼음에서 변성 및 급속 냉각)와 형질전환이 필요한 플라스미드 DNA 2 - 3 μg을 추가합니다. 부드럽게 섞는다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
      5. 260 μL의 40 % PEG / LiAc-TE를 첨가하십시오. 부드럽게 섞는다. 셰이커 또는 30°C의 열교환기에서 부드럽게 섞으면서 60분 동안 배양합니다. 43 μL의 DMSO를 추가하십시오. 부드럽게 섞는다.
      6. 열교환기에서 42°C에서 10분 동안 열 충격을 가합니다. 2,500 x g 에서 6-8분 동안 펠릿하고 상층액을 버립니다. 멸균 D/W 1mL로 펠릿을 1번 세척합니다.
      7. 펠렛, 상층액을 버리고 펠릿을 200 μL의 멸균 D/W. 플레이트 100 μL에 재현탁시킵니다. 5 μg/mL 티아민( nmt41 프로모터를 억제하기 위해) 및 아미노산 보충제 아데닌(0.225 mg/mL), 히스티딘(0.225 mg/mL) 및 류신(0.225 mg/mL)이 포함되어 있지만 우라실(pREP42 플라스미드에 대한 선택 마커)이 부족합니다.
         참고: 또는 두 개의 다른 플레이트에 70μL 및 130μL를 플레이트합니다. 두 개의 서로 다른 부피(70 μL 및 130 μL)를 도금하여 형질전환 효율에 따라 플레이트 중 하나 이상에서 분리된 콜로니를 얻을 수 있으며, 이는 실험마다 다를 수 있습니다.
      8. 콜로니가 나타날 때까지 30 °C에서 2-3 일 동안 플레이트를 배양합니다. 단일 콜로니를 100μL의 멸균 D/W와 혼합하고 위에서 설명한 대로 티아민이 포함되어 있지만 우라실이 없는 새 EMM 플레이트에 펴 바릅니다.
      9. 완전한 잔디가 나타날 때까지 30 °C에서 2-3 일 동안 배양하십시오. 접종 루프를 사용하여 자란 세포의 잔디를 긁어내고 크라이오 바이알에 30% 글리세롤을 함유한 1mL의 YES 배지에 재현탁시킵니다.
      10. cryo-vial을 액체 질소에 급속 냉동하고 -80°C에서 보관하여 냉동 효모 스톡을 보존합니다.
3. 핵분열 효모에서 박테리아 세포골격 단백질의 발현
   1. 글리세롤 스톡의 패치를 새로운 효모 특정 플레이트에 무균 줄무늬로 줄무늬를 만들어 추가 실험을 위한 충분한 배양을 얻습니다.
      참고: pREP42의 경우, 우라실(pREP42에 선택 마커로 존재하는 우라실) 없이 아데닌, 히스티딘 및 류신( S. pombe 균주(h-leu1-32 ura4-D18) 사용)을 포함하는 EMM 한천 플레이트(최소 매체)를 사용했습니다. 우리는 한천 플레이트에 15 - 20 μM 티아민을 첨가합니다 (pREP42는 티아민 억제성 nmt41 프로모터를 가지고 있기 때문에). 플레이트에서 자랄 때 관심 유전자의 발현을 억제합니다.
   2. 줄무늬 패치에서 접종액의 작은 고리를 티아민이 부족한 5mL의 효모 특이적 EMM 배지에 접종하고 30 °C에서 10 - 12 시간 동안 배양합니다.
      참고: S. pombe의 nmt41 프로모터 하에서 다른 종에서 FtsZ 및 MreB의 발현은 일반적으로 16 내지 30 h까지 다양할 수 있습니다. S. pombe에서 GFP-EcMreB 및 SaFtsZ-GFP의 단백질 발현을 위한 최적의 시간은 티아민 없이 30 °C에서 각각 20 - 24 시간 및 16 - 20 시간입니다.

2. GFP 표지된 세균성 세포골격 단백질을 발현하는 S. pombe 배양물의 처리

참고: 다양한 약물 분자를 96웰 플레이트에서 하룻밤 동안 배양한 효모 배양액에서 테스트합니다.

1. 반자동 96웰 멀티채널 피펫팅 기기를 사용하여 150μL의 신선한 효모 EMM 배지가 들어 있는 96웰 플레이트의 각 웰에 50μL의 야간 배양액을 옮겨 신선한 배양액을 접종합니다.
2. 반자동 96웰 멀티채널 피펫을 사용하여 적절한 혼합을 위해 피펫팅을 하고 빼는 동안, 그림 1의 회로도에 표시된 것처럼 각각 세 번에 걸쳐 수행되는 다양한 농도의 약물을 증식 배양에 천천히 도입합니다.
3. 양성 대조군으로, 이미 알려진 약물, PC190723 (S. aureus FtsZ) 및 A22 ( E. coli MreB)를 중복하여 사용하십시오.
   참고: 이전에 보고된 바와 같이, PC190723 및 A22는 각각 56.2 μM¹⁷ 및 72.6 μM ^14,17의 농도로 사용되었다. 한편, SaFtsZ의 A22 처리와 EcMreB의 PC190723 처리는 각각 음성 대조군으로 작용했다.
4. 약물의 최저 농도와 최고 농도에 따라 세 가지 다른 농도에서 DMSO를 용매 제어로 사용하십시오.
   참고: 약물이 용해되는 용매는 용매 제어제로 사용됩니다.
5. 대조군 및 처리된 배양액을 30°C에서 6-10시간 동안(세포가 박테리아 형광 단백질의 발현을 보일 때까지) 배양한 다음 형광 현미경을 사용하여 이미지를 생성합니다.

3. 폴리머의 시각화

1. 광학적으로 투명한 바닥 96웰 플레이트(형광 이미징을 위한 검은색 벽)의 각 웰에 1mg/mL concanavalin A 20μL 코팅을 적용하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 액체를 흡입하고 10분 동안 자연 건조시킵니다.
2. 배양 플레이트에서 20μL의 세포를 각 웰로 옮기고 10분 동안 그대로 둡니다. 멸균 EMM 배지로 세포를 3x-4x 세척합니다.
3. 대물 렌즈를 장착한 상태에서(3.6단계 참조) 이미지 획득 소프트웨어의 획득 패널에서 네비게이터 모드를 사용하여 96-well plate alignment 및 well coverage를 확인하십시오. 네비게이터에서 가장자리를 잘 맞춥니다.
4. 다음으로, 웰에서 관심 영역의 다중 위치 선택을 포함하는 웰 커버리지 매개변수를 선택하고 온디맨드 모드와 함께 적응형 자동 초점 제어를 사용하여 이미징 중에 샘플의 초점을 유지합니다.
5. 미분 간섭 대비(DIC) 및 형광을 사용하여 이미지를 획득합니다. excitation 및 emission filter를 각각 475/28 nm 및 525/48 nm로 설정하여 효모에서 발현되는 GFP 태그 박테리아 단백질을 이미징합니다. 효모 세포의 두께(5μm)를 통해 0.2μm의 단계 크기에서 Z-stack을 얻습니다.
6. 100x, 1.4-NA 오일 이멀젼 대물렌즈와 2,000 x 2,000 sCMOS 카메라(6.5 μm x 6.5 μm 픽셀 크기)가 장착된 도립 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 형광단의 여기를 위해 LED 조명 시스템을 사용하십시오.
   참고: 정밀한 다지점 포지셔닝이 있는 96웰 플레이트용 전동 스테이지가 있는 모든 형광 현미경 시스템이 적합해야 합니다. 실험 변수를 최소화하고 일관성을 유지하기 위해 1 x 1의 비닝(binning) 및 15% - 20%의 조명에서 유사한 노출 시간(일반적으로 0.3 - 0.5초 범위)으로 대조군 및 약물 처리된 모든 세포 이미지를 획득합니다.

4. ImageJ를 사용한 이미지 정량화

1. 세포 영상을 처리하고 FtsZ¹⁷에 대한 세포당 반점 수와 밀도를 측정합니다. MreB의 경우 밀도와 이방성²³ 을 측정하고 Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)²⁴를 사용하여 대조 세포와 처리된 세포를 비교합니다.
2. DIC 채널의 이미지를 사용하여 먼저 자유형 그리기 도구를 사용하여 개별 효모 세포의 윤곽을 그리고 ROI 관리자에 관심 영역(ROI)으로 저장합니다. 이 단계는 아직 자동화되지 않았지만 기계 학습^25,26을 사용하여 최근에 개발 된 도구가 가까운 장래에 시도되고 통합 될 수 있습니다.
3. 셀의 외부 영역을 마스킹하고²⁷에 설명된 대로 검은색으로 채웁니다.
4. 피지의 내장 기능인 OPS 임계값 IJ1 분석 매크로를 사용하여^{스폿 수 24}를 계산합니다.
5. 자동 임계값을 지정하고 분할된 입자를 마스킹하기 위해 otsu 방법을 사용합니다. 매크로를 사용하여 플러그인 analyse particles를 실행합니다.
6. 폴리머 밀도(세포의 단위 면적당 세포골격의 양)를 측정하기 위해, 마스킹 및 골격화 단계^27,28을 포함하여 설명된 대로 이미지를 처리합니다. lpx 플러그인에서 Lpx 2Dfilter를 사용하여 이미지를 스켈레톤화합니다.
7. 자세한 내용은 최근 간행물¹⁷을 확인하십시오. ²³에서 앞서 언급한 대로 EcMreB 폴리머 정량화를 수행하고, 이전에²³에서 설명한 대로 FibrilTool²⁹를 사용하여 공간 조직을 정량화하기 위해 이방성을 사용합니다.
   참고: 이러한 분석 방법은 약물에 의해 처리되거나 처리되지 않은 다른 박테리아 세포골격 단백질을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

Results

약물 스크리닝을 위한 96웰 플레이트 설정
중-강도 티아민 억제성 프로모터 nmt41을 함유하는 벡터(pREP42)로부터 C-말단 GFP 표지된 S. aureus FtsZ를 발현하기 위한 S. pombe의 사용은 사전에 확립된¹⁷ 및 유사하게, N-말단 GFP로 표지된 E. coli MreB도 S. pombe¹⁴에서 발현되었다. 우리는 또한 SaFtsZ의 특정 억제제인 PC190723와 MreB 억제제인 A22가 효모^14,17에서 발현될 때 특정 방식으로 각각의 박테리아 세포골격 단백질에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었습니다.

여기에서 우리는 효모 발현 시스템을 사용하여 박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 항균 약물의 중간 또는 고처리량 스크리닝을 개발할 것을 제안합니다. 전동 스테이지가 있는 에피형광 현미경을 자동화하여 96웰 플레이트를 이미지화할 수 있으며, 상용 약물 라이브러리도 96웰 플레이트 형식으로 쉽게 사용할 수 있습니다. 따라서 우리는 제안된 약물 스크리닝을 위해 96웰 플레이트를 사용하는 것을 선호합니다. 플레이트는 그림 1과 같이 설정됩니다. 첫 번째 줄(그림 1A)은 효모 배양을 발현하는 SaFtsZ-GFP로 구성됩니다. 두 번째 줄(그림 1B)은 GFP-EcMreB를 발현하는 효모 배양물로 구성됩니다. 처음 두 행(A1:B2)의 처음 두 열은 미디어 공백으로 설정됩니다. 처음 두 행(A3:B12)의 다음 6개 열은 중복된 약물 희석액에 따라 3가지 다른 농도의 DMSO 제어로 설정됩니다. 다음으로, PC190723(56.2μM) 및 A22(72.6μM)를 SaFtsZ-GFP 또는 GFP-EcMreB를 발현하는 효모 세포에 첨가합니다. PC190723와 A22는 각각 FtsZ와 MreB에 대한 양성 대조군 역할을 합니다. 다른 모든 웰(C1:F12)은 박테리아 세포골격 단백질, SaFtsZ 또는 EcMreB의 효과 인자를 식별하기 위해 스크리닝에 사용되는 다양한 약물(세 가지 다른 농도 및 중복)을 추가하는 데 사용됩니다. GFP 태그가 부착된 SaFtsZ 또는 MreB를 발현하는 효모의 배양액을 이러한 96웰 플레이트에 분배하고 폴리머 조립에 대한 약물의 효과가 시각화될 때까지 성장시킵니다.

효모 세포에 대한 성장 효과 평가
30°C에서 6 내지 10시간 동안 96웰을 포함하는 하위 배양 세포를 배양한 후, 효모 배양의 광학 밀도(OD)를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정합니다. OD 측정은 진핵 효모 세포에 대한 약물의 성장 억제 효과와 인간 세포에 대한 해로운 영향을 평가하는 데 도움이 됩니다. 따라서 이 분석은 효모 시스템에서의 독성에 따라 여러 약물을 선별하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, PC190723 및 A22 모두 효모 세포에 대한 성장 효과나 독성을 나타내지 않으며, DMSO, PC190723 또는 A22로 처리된 SaFtsZ-GFP를 발현하는 배양물의 OD₆₀₀ 은 각각 0.38 ± 0.03, 0.44 ± 0.02 및 0.43 ± 0.06(N ≥4)이었다. 마찬가지로, GFP-EcMreB를 발현하고 DMSO, PC190723 또는 A22로 처리한 배양물의 OD₆₀₀ 은 각각 0.38 ± 0.04, 0.44 ± 0.07 및 0.41 ± 0.08(N ≥ 4)이었다.

S. pombe에서 발현된 SaFtsZ 및 EcMreB에 의해 조립된 고분자 구조에 대한 약물의 효과 시각화
SaFtsZ 또는 EcMreB의 중합에 대한 약물의 효과를 평가하기 위해, 약물을 함유하는 상술한 96-웰 플레이트로부터의 효모 세포의 부분 표본을 형광 이미징에 적합한 광학적으로 투명한 유리 바닥 96-웰이 있는 다른 96-웰 플레이트로 옮긴다. 이 96웰 플레이트는 또한 GFP 태그가 부착된 SaFtsZ 또는 EcMreB를 발현하는 효모 세포의 접착을 허용하기 위해 concanavalin A로 코팅되어 있습니다. 96-well plate는 이미지 획득 소프트웨어에 의해 제어되는 미리 결정된 위치에서 plate의 모든 96-wells를 커버하는 epifluorescence 현미경을 사용하여 이미징됩니다(그림 2). 대조군 웰(DMSO 처리)에서 SaFtsZ-GFP를 발현하는 효모 세포는 티아민이 없는 상태에서 16 - 18시간 성장 후 세포 전체에 분포된 반점 또는 패치 형태의 고분자 구조를 보여주었습니다. 그러나 티아민 결핍으로 성장한 후 10 - 12 시간에서 세포는 확산 형광 또는 약간의 패치만 나타냈으며, 이는 FtsZ-GFP 발현이 중합에 필요한 임계 농도에 도달하지 않았음을 시사합니다(그림 3A). 반대로, FtsZ 안정화 약물인 PC190723은 12시간 성장 후 DMSO 대조군에 비해 SaFtsZ-GFP의 고분자 구조(반점 또는 패치)가 상당히 증가하여 양성 대조군 역할을 했습니다(그림 3B). 대조적으로, A22로 처리된 세포는 조립된 SaFtsZ-GFP 구조에서 차이를 보이지 않았습니다(그림 3C). 그러나 PC190723로 처리한 배양과 달리 SaFtsZ-GFP는 장기간 유도된 경우에만 처리되지 않은 배양에서 패치로 조립되어 PC190723 SaFtsZ의 중합 임계 농도를 감소시키는 역할을 했음을 보여줍니다(그림 3D). 마찬가지로, S. pombe 에서 발현된 GFP-EcMreB는 핵분열 효모의 세로 축을 따라 긴 필라멘트의 선형 배열을 형성했습니다(그림 4A). PC190723는 EcMreB 중합에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌지만(그림 4B), A22로 세포를 처리하면 효모 세포의 세포질 전체에 걸쳐 확산된 형광이 발생했습니다(그림 4C). 나머지 96웰 플레이트의 이미지는 경우에 따라 SaFtsZ 또는 EcMreB에 대한 약물의 안정화 또는 억제 효과에 대해 육안으로 검사됩니다.

세균성 세포골격 단백질의 조립에 대한 약물의 영향은 이전에 SaFtsZ¹⁷ 및 EcMreB²¹에 대해 보고된 바와 같이 ImageJ 또는 Fiji의 이미지 분석 도구 및 플러그인을 사용하여 정량화할 수 있습니다. 96웰 플레이트 형식의 자동 이미지 획득과 이미지 처리를 위한 맞춤형 매크로 및 스크립트 구현은 이미징 시간을 단축하고 약물 효과의 정량화를 가속화할 수 있습니다. 따라서 단세포 진핵 효모인 S. pombe 를 숙주 시스템으로 사용하여 박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 소분자에 대한 중간 또는 고처리량 스크리닝을 성공적으로 수행할 수 있어 궁극적으로 새로운 항생제의 발견으로 이어질 수 있음을 제안합니다.

그림 1: 박테리아 세포골격 단백질 SaFtsZ 또는 EcMreB의 조립을 표적으로 하는 약물을 스크리닝하기 위해 핵분열 효모 세포를 사용하는 방법을 보여주는 개략도. S. aureus 로부터의 FtsZ 및 E. coli 로부터의 MreB를 효모 발현 벡터, C- 및 N- 말단에 각각 GFP 태그를 갖는 pREP42로 클로닝하고, 표현형 및 약물 연구를 위해 S. pombe 로 형질전환시켰다. 배양액은 8 - 12 시간 동안 재배되었습니다. 그 후, 배양액은 적절한 대조군과 다양한 약물을 스크리닝하는 96웰 플레이트에서 하위 배양했습니다. 또한, 플레이트를 30°C에서 OD₆₀₀ 이 0.5-0.6에 도달할 때까지 6-8시간 동안 배양하고, 효모 세포에 대한 약물의 독성을 평가하기 위해 마이크로플레이트 리더를 사용하여 광학 밀도를 측정하였다. 또 다른 광학적으로 투명한 유리 바닥 96-well 플레이트는 효모 세포를 부착하기 위해 concanavalin A로 사전 코팅되었습니다. 이 96웰 플레이트는 형광 현미경을 사용한 시각화 및 이미지 획득에 사용되었습니다. 그런 다음 얻은 이미지를 분석했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 96웰 플레이트의 자동 이미징을 위한 이미지 획득 소프트웨어의 개략도. 이미지 획득 소프트웨어의 네비게이터를 사용하여 가장자리를 표시하여 96웰 플레이트를 정렬했습니다. 각 웰에서 촬영해야 하는 이미지 수와 해당 위치(무작위 또는 웰 중심에서)와 같은 웰 커버리지 매개변수가 원하는 대로 선택되었습니다. 마지막으로, 사용할 필터 세트와 같은 이미지 매개변수(DIC 및 FITC-filter; Ex 475/28 nm 및 Em 525/48 nm), 이미지 캡처를 위한 조명광의 강도, 자동 초점 및 노출 시간을 설정했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: S. pombe에서 발현된 SaFtsZ-GFP에 대한 PC190723 및 A22 약물의 효과 시각화. SaFtsZ-GFP를 발현하는 S. pombe 배양액은 DMSO 및 약물 처리 전에 30°C에서 8 - 9시간 동안 티아민이 없는 상태에서 성장시켰습니다. 배양액은 약물의 존재 또는 부재 하에 30°C에서 7 - 9시간 동안 96웰 플레이트에서 추가로 성장시켰다. (A) 동일한 양의 DMSO가 첨가된 DMSO 대조군에서 세포는 몇 가지 고분자 구조를 나타냈습니다. (B) PC190723(56.2μM)의 존재 하에서, SaFtsZ는 DMSO 대조군보다 고분자 구조에서 상당한 증가를 보이는 효모 세포를 발현합니다. (C) MreB 억제제인 A22(72.6μM)는 SaFtsZ-GFP 구조에 영향을 미치지 않았습니다. (D) PC190723이 없는 경우 SaFtsZ-GFP 조립을 위해 더 긴 시간의 단백질 발현이 필요했기 때문에 DMSO가 포함된 96웰 플레이트에서 하위 배양 후 30°C에서 12 - 15시간 동안 성장한 대조 배양물에서도 FtsZ 폴리머가 나타납니다. 눈금 막대는 5 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: S. pombe에서 발현된 GFP-EcMreB에 대한 PC190723 및 A22 약물의 효과의 시각화. GFP-EcMreB를 발현하는 S. pombe 배양액은 DMSO 또는 약물(A22 또는 PC190723)을 첨가하기 전에 30°C에서 9 - 11시간 동안 티아민이 없는 상태에서 성장시켰다. 배양액은 대조군으로서의 약물을 사용하거나 사용하지 않고 30°C에서 8 - 10시간 동안 96웰 플레이트에서 추가로 성장시켰습니다. (A) 동등한 양의 DMSO가 대조군으로 첨가된 배양에서 세포는 효모 세포의 세로 축을 따라 배향된 EcMreB의 선형 필라멘트를 나타냈습니다. (B) GFP-EcMreB의 조립은 PC190723(56.2 μM)로 처리된 배양에서 영향을 받지 않았습니다. (C) MreB 중합 억제제로 알려진 소분자 A22 (72.6 μM)는 핵분열 효모 세포에서 GFP-EcMreB의 조립을 방지했습니다. 눈금 막대는 5 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 이 연구에 사용된 균주 및 플라스미드. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 이 연구에 사용된 매체 및 완충액의 구성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

항생제 내성(AMR)은 전 세계적으로 심각한 건강 위협이며, 새로운 표적을 가진 새로운 항생제가 시급히 필요합니다. 박테리아 세포골격은 TXA709와 같은 세포 분열 단백질 FtsZ의 저분자 억제제와 함께 새로운 항생제 개발을 위한 매력적인 대상으로 부상했으며, 이미 1상 임상시험에서³⁰. FtsZ^{중합 7,31}의 억제제를 확인하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 최근에는 세포 기반 분석에서 진핵생물 핵분열 효모를 사용하여 FtsZ 안정화 약물인 PC190723가 HpFtsZ¹⁷을 표적으로 할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 베르베린(berberine) 및 상귀나린(sanguinarine)과 같은 약물이 FtsZ의 중합에 영향을 미치지만 효모 세포의 형태에도 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다¹⁷. 이러한 연구와 관찰에 힘입어 우리는 핵분열 효모 발현 플랫폼을 사용하여 박테리아 세포골격의 저분자 조절인자를 스크리닝하기 위한 단일 단계 세포 기반 분석을 개발하기 시작했습니다. 스크리닝이 GFP 태그된 세포골격 단백질의 조립 억제에 의존하기 때문에 유사한 형광단 특성을 공유하는 작은 분자는 위양성을 유발할 수 있습니다. long-pass filter를 피하고 narrow band-pass filter를 선택하면 형광 소분자에서 발생하는 이러한 위양성(false positive)을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에서는 SaFtsZ 또는 EcMreB를 표적으로 하는 약물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있는 96웰 플레이트 스테이지 홀더가 장착된 에피형광 현미경을 사용하여 중간 처리량 스크리닝을 설정하는 단계를 보여줍니다. 워크플로우에는 반자동 이미지 획득 및 분석이 포함되며, 이는 로봇 액체 처리 시스템과 이미지 처리 파이프라인을 사용하여 향후 고처리량 스크린으로 쉽게 확장할 수 있습니다.

또한, 스크리닝은 플라스미드 유지 단백질 ParM³²를 함유하는 액틴 폴드(actin-fold)와 같은 다른 박테리아 세포골격 단백질 및 핵분열 효모에서 고분자 구조로 조립되는 모든 단백질에 대해 유용해야 합니다. 그러나 각 관심 단백질에 대한 최적의 발현 수준은 약물 스크리닝에 사용하기 전에 표준화해야 합니다. FtsZs의 경우 nmt41이 최적의 프로모터인 반면, 다른 관심 단백질의 경우 nmt1 프로모터의 더 강하거나 약한 버전(프로모터 강도(및 누출성): nmt1 > nmt41 > nmt81) 또는 효모 adh1 또는 act1^18,33과 같은 기타 구성 프로모터가 있음을 발견했습니다 고분자 구조의 최적의 발현 및 조립 수준을 얻기 위해 시도할 수 있습니다. 더욱이, episomal plasmids를 사용하는 동안, 세포 간 복제 수 변이는 균일한 유전자 발현에 문제를 제기합니다. 이러한 문제를 회피하기 위해, 다양한 강도의 프로모터를 운반하는 핵분열 효모 게놈(안정 통합 벡터를 위한 SIVs)에 통합될 수 있는 여러 벡터가 최근에 개발되었다³⁴. 이러한 벡터의 사용은 본 연구에서 사용된 에피솜 벡터에 비해 더 균일하고 정량적인 결과를 제공할 수 있습니다. SIV를 사용하면 세포 전체의 형광 강도의 변화로 보이는 발현 수준의 큰 이질성을 피할 수 있으며 고처리량 스크리닝에 더 적합해야 합니다.

또한 PC190723와 같은 약물은 FtsZ 폴리머를 안정화하는 역할을 하여 처리되지 않은 세포에 비해 FtsZ 필라멘트를 조기에 조립할 수 있습니다. 이 스크리닝은 박테리아 세포골격 단백질의 중합을 억제하는 약물을 스크리닝하는 데 적합하지만, 종말점에서 확산 형광의 시각적 평가로 인해 FtsZ 폴리머를 안정화하는 약물을 스크리닝하려면 단백질 발현 수준의 추가 최적화와 폴리머를 가진 최대 세포 수를 달성하는 데 필요한 시간이 필요합니다. 따라서 조립에 필요한 임계 농도를 달성하기 위해 단백질 발현에 필요한 시간을 합리적으로 추정하고 그에 따라 분석의 종말점을 결정하는 것이 중요합니다. 단백질의 중합에 필요한 임계 농도를 감소시키는 역할을 할 수 있는 약물의 경우, 종점의 선택은 일반적으로 시간이며, 처리되지 않은 세포의 상당한 집단이 확산 형광을 나타내지만 약물로 처리된 배양물은 고분자 어셈블리를 표시합니다.

워크플로우의 시간 집약적인 단계이기도 한 제한 사항 중 하나는 정량적 이미지 분석을 위해 개별 세포를 식별하고 분할해야 한다는 요구 사항입니다. 현재 제안된 계획에서 이는 개별 효모 세포를 식별하고 약물 효과의 정량화를 위한 관심 영역(ROI)을 할당하는 수동 단계입니다. 그러나 ilastik³⁵ 에서 구현할 수 있는 것과 같은 훈련 세트를 사용하여 최근에 개발된 기계 학습 알고리즘은 수동 개입의 필요성을 최소화해야 할 것으로 예상됩니다.

효모 플랫폼을 사용하는 우리의 접근 방식은 박테리아 세포골격을 표적으로 하는 히트 및 잠재적인 소분자를 식별하는 데 유용하지만, 결국에는 동물 모델에서 표준 최소 억제 농도 테스트 및 효능을 사용하여 항균 활성을 테스트해야 합니다. 그럼에도 불구하고 항생제 내성(AMR)의 전 세계적인 증가에 대한 가장 큰 도전은 여전히 그람 음성 박테리아의 외막 투과성과 많은 병원성 박테리아 종의 수많은 유출 펌프에 있습니다. 또한, 핵분열 효모의 유출 펌프도 유사한 문제를 일으킬 수 있으며 스크리닝 공정에 더 높은 약물 농도가 필요할 수 있습니다. 대안적으로, 4개의 수송체 유전자 및 전사 인자를 포함한 7개의 다제내성 유전자의 결실의 결과로, 약물에 과민한 핵분열 효모 균주(S. pombe MDR-supML)가 스크리닝을 위한 숙주로 사용될 수 있다(^32,33). 증가하는 항생제 내성을 해결하기 위해 표적 항균 발견을 결합하고 막 투과성과 같은 일반적인 현상으로 인한 내성을 해결하는 기술의 향후 개발이 필요할 것입니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96웰 CC2 광학 CVG 멸균, 뚜껑 포함. 블랙	써모 사이언티픽&트레이드;
96웰 플레이트	Corning
A22 하이드로클로라이드	시그마	SML0471	DMSO
아데닌	FormediumTM	DOC0229	225 mg/L의 배지에 용해됨
콘카나발린 A	시그마	C5275-5MG
DMSO	시그마
Edinburg 최소 매체 (EMM 한천 또는 EMM 국물)	FormediumTM	PMD0210	구성에 대해서는 아래를 참조하십시오
. EDTA	시그마	EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position slider	Eppendorf	5069000101
Histidine	FormediumTM		DOC0144 225 mg/L의 매체
Leica DMi8 반전 형광 현미경	Leica Microsystems		독일 회사
Leucine	FormediumTM	DOC0157	225 mg/L의 매체
리튬 아세테이트	시그마	517992-100G
PC190723	머크	344580	DMSO
폴리에틸렌 글리콜 (PEG)	그마
티아민	시그마	T4625	필터 멸균
Tris-Hydrochloride	MP	194855
Uracil	FormediumTM	DOC0214	225 mg/L의 매체, 저장 용액 36°C; C
YES (효모 추출물 + 보충제) Agar	FormediumTM	PCM0410	구성은 아래를 참조하십시오
예 (효모 추출물 + 보충제) Broth	FormediumTM	PCM0310	구성
Yeast (S. pombe) media  < / strong>
효모 추출물 + 보충제 (YES) < / strong >< / em >
	< strong > 구성< / strong >	< strong >g / L < / strong >
	효모 추출물	5
	포도당	30
	한천	17
	아데닌	0.05
	L-히스티딘	0.05
	L-류신	0.05
	L-라이신, HCl	0.05
	우라실	0.05
Edinburg 최소 매체(EMM)
	구성	g/L	농도
	potassium hydrogen phthallate	3	14.7mM
	Na2HPO4	2.2	15.5 mM
	NH4Cl	5	93.5 mM
	포도당	2% (w/v) 또는 20 g/L	111 mM
	소금 (재고 x 50)	20 mL/L (v/v)
	비타민 (재고 x 1000)	1 mL/L (v/v)
	미네랄 (재고 x 10,000)	0.1 mL/L (v/v)
<강한>소금 x 50	52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)	52.5	0.26 M
	0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)	0.000735	4.99 mM
	50 g/l KCl (0.67 M)	50	0.67 M
	2 g/l Na2SO4 (14.l mM)	2	14.1 mM
<강력한>비타민 x 1000	1 g/l 판토텐산	1	4.20 mM
	10 g/l 니코틴산	10	81.2 mM
	10 g/l 이노시톨	10	55.5 mM
	10 mg/l 비오틴	0.01	40.8 &마이크로; M
미네랄 x 10,000	붕산	5	80.9 mM
	MnSO4	4	23.7 mM
	ZnSO4.7H2O	4	13.9 mM
	FeCl2.6H2O	2	7.40 mM
	몰리브딕산	0.4	2.47 mM
	키	1	6.02 mM
	CuSO4.5H2O	0.4	1.60 mM
	구연산	10	47.6 mM
Strains/ Plasmids
Strains	Description	Reference
CCD190	Escherichia coli DH10β	인비트로젠
CCDY4	MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
	CCDY340 CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023
	CCDY346 MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]	Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3	pREP42-GFP-EcMreB	Srinivasan 외, 2007
pCCD713	pREP42-SaFtsZ-GFP	Sharma 외, 2023