Basement Membrane Matrix Ingekapselde Celaggregatie voor het onderzoeken van de vorming van miltweefsel bij muizen

Summary

Dit artikel beschrijft een protocol voor het samenvoegen en inkapselen van miltcellen in een halfvaste basaalmembraanmatrix. Basale membraanmatrixconstructies kunnen worden gebruikt in driedimensionale kweek voor het bestuderen van de ontwikkeling van organoïden, of voor in vivo transplantatie- en weefselregeneratiestudies.

Abstract

De milt is een immuunorgaan dat een sleutelrol speelt bij door bloed overgedragen immuunresponsen. Het anatomische of functionele verlies van dit weefsel verhoogt de vatbaarheid voor ernstige bloedinfecties en sepsis. Autotransplantatie van miltplakken is klinisch gebruikt om verloren weefsel te vervangen en de immuunfunctie te herstellen. Het mechanisme dat robuuste en immunologisch functionele miltweefselregeneratie aandrijft, is echter niet volledig opgehelderd. Hier willen we een methode ontwikkelen voor het samenvoegen en inkapselen van miltcellen in een halfvaste matrix om de cellulaire vereisten voor de vorming van miltweefsel te onderzoeken. Ingekapselde celconstructies met basale membraanmatrix zijn geschikt voor zowel in vitro weefselkweek van driedimensionale organoïden als transplantatie onder het nierkapsel om de weefselvorming in vivo direct te beoordelen. Door de inputcellen te manipuleren voor aggregatie en inkapseling, tonen we aan dat graft-afgeleide PDGFRβ⁺MAdCAM-1^– neonatale stromale cellen nodig zijn voor de regeneratie van miltweefsel onder diertransplantatiemodellen.

Introduction

Traumatische ruptuur van de milt en het verschijnen van meerdere miltknobbeltjes in het lichaam was een van de eerste aanwijzingen dat miltweefsel regeneratief vermogen had ^1,2. Automatische milttransplantaties werden later in de kliniek geïntroduceerd om miltweefsel te behouden bij patiënten die een spoedsplenectomie nodig hadden³. Maar ondanks het feit dat het al tientallen jaren deel uitmaakt van de klinische praktijk, is er heel weinig bekend over hoe de milt regenereert. Diertransplantatiemodellen hebben inzicht gegeven in meerdere parameters van miltregeneratie en immuunfunctie ^4,5. Met name experimentele wijzigingen in de methode voor de voorbereiding van het transplantaat hebben het mogelijk gemaakt weefselregeneratie gedetailleerder te bestuderen op cellulair en moleculair niveau.

Transplantaties waarbij hele miltplakken betrokken zijn, ondergaan een fase van massale necrose voordat een nieuwe miltstructuur wordt herbouwd⁶. De beginfase van transplantaatnecrose suggereert dat het grootste deel van het getransplanteerde weefsel grotendeels bestaat uit rode en witte bloedcellen en niet nodig is voor miltregeneratie. Dit werd experimenteel onderzocht door hematopoëtische cellen uit milttransplantaten uit te sluiten vóór transplantatie onder het nierkapsel van de muis. Hier bleek de niet-leukocyten/niet-erytrocytenfractie van de milt, die stromale en endotheelcellen omvat, voldoende te zijn om de novo weefselvorming te induceren⁷. Milt stromaal weefsel zou verder kunnen worden verwerkt tot een eencellige suspensie, waardoor het gebruik van celsorteertechnologieën mogelijk wordt om de samenstelling van cellulaire transplantaten te manipuleren. Door selectief kandidaat-celtypen te verwijderen, werden twee CD45-TER-119-stromale celpopulaties geïdentificeerd die onmisbaar waren voor de ontwikkeling van transplantaten: een endotheelachtige CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ celpopulatie en een breder gedefinieerde PDGFRβ⁺ mesenchymale celpopulatie⁸.

De constructie van transplantaten uit miltcellen varieert in termen van ondersteuningsmaterialen en celbelastingsprocessen. Weefselgemanipuleerde milten zijn eerder bereid door milteenheden op een polyglycolzuur/poly-L melkzuurpolymeersteiger ^5,9 te laden. Interessant is dat stromale cellen van de milt die in een collageenspons werden geabsorbeerd, er niet in slaagden om te implanteren, terwijl stromale cellen die werden geaggregeerd en over een collageenvel werden geladen,^{de regeneratie van} de milt vergemakkelijkten. Het is ook aangetoond dat de resuspensie van stromale cellen in een Matrigel-matrix celaggregatie induceert onder driedimensionale kweekomstandigheden¹⁰. Deze methode is echter niet getest voor gebruik in transplantatiemodellen. Het algemene doel van het huidige protocol is om stromale cellen van de milt rechtstreeks in de basale membraanmatrix te aggregeren en in te kapselen, die vervolgens kunnen worden overgebracht naar een driedimensionaal in vitro weefselkweeksysteem of kunnen worden gebruikt als voertuig voor transplantaties van diermodellen (aanvullende figuur 1).

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens experimentele protocollen die zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Universiteit van Queensland (UQBR/079/19). 1. Weefselafname en voorbereiding van stromale cellen Euthanaseer 0,5-1,5 dag oude mannelijke en/of vrouwelijke BALB/c neonatale donormuizen door onderkoeling op te wekken door dieren in het tissuepapier te wikkelen en ze gedurende >10 minuten onder gemalen ijs te plaatsen.OPMERKING: Dit protoc…

Representative Results

Celaggregatie is belangrijk voor het bevorderen van cel-tot-cel contact en signalering. Het omhullen van celaggregaten in de basale membraanmatrix ondersteunde beide 3-dimensionale culturen voor in vitro weefselorganoïdevorming en vergemakkelijkte de mechanische afgifte van cellen in het nierkapsel voor transplantaattransplantatie. Om deze constructies vast te stellen, werd de basaalmembraanmatrix eerst in een fluïdische toestand gehouden onder ijskoude omstandigheden. Celaggregatie werd vervolgens bereikt doo…

Discussion

De aggregatie van neonatale miltcellen in een halfvast medium vertegenwoordigt een levensvatbare methode voor het genereren van miltconstructen. Vergelijkbare protocollen op basis van basaalmembraanmatrix zijn gebruikt om driedimensionale miltculturen te initiëren¹⁰. Hier tonen we aan dat miltconstructen even geschikt zijn voor in vitro organoïdekweeksystemen als voor in vivo transplantatiemodellen. Merk op dat de transplantatie van in vitro gekweekte miltorganoïden n…

Materials

96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm