Agregação celular encapsulada da matriz da membrana basal para investigação da formação do tecido do baço murino

Summary

Este artigo descreve um protocolo para agregação e encapsulamento de células do baço dentro de uma matriz de membrana basal semissólida. Construções de matriz de membrana basal podem ser usadas em cultura tridimensional para estudar o desenvolvimento de organoides, ou para estudos de transplante in vivo e regeneração tecidual.

Abstract

O baço é um órgão imunológico que desempenha um papel fundamental nas respostas imunes transmitidas pelo sangue. A perda anatômica ou funcional desse tecido aumenta a suscetibilidade a infecções sanguíneas graves e sepse. O autotransplante de cortes de baço tem sido usado clinicamente para repor o tecido perdido e restaurar a função imunológica. No entanto, o mecanismo que conduz a regeneração robusta e imunologicamente funcional do tecido baço ainda não foi totalmente elucidado. Aqui, pretendemos desenvolver um método para agregar e encapsular células do baço dentro de uma matriz semissólida, a fim de investigar as necessidades celulares para a formação de tecido esplênico. Construções celulares encapsuladas em matriz de membrana basal são passíveis tanto de cultura in vitro de organoides tridimensionais quanto de transplante sob a cápsula renal para avaliar diretamente a formação de tecidos in vivo . Através da manipulação das células de entrada para agregação e encapsulamento, demonstramos que as células estromais neonatais PDGFRβ⁺MAdCAM-1^– derivadas do enxerto são necessárias para a regeneração do tecido esplênico em modelos de transplante animal.

Introduction

A ruptura traumática do baço e o aparecimento de múltiplos nódulos esplênicos no corpo foi um dos primeiros indícios de que o tecido esplênico abrigava capacidade regenerativa ^1,2. Os autotransplantes de baço foram posteriormente introduzidos na clínica para preservar o tecido esplênico em pacientes que necessitaram de esplenectomia de emergência³. No entanto, apesar de fazer parte da prática clínica há décadas, muito pouco se sabe sobre como o baço se regenera. Modelos de transplante animal têm fornecido informações sobre múltiplos parâmetros da regeneração do baço e da função imune ^4,5. Em particular, modificações experimentais no método de preparo do enxerto têm permitido que a regeneração tecidual seja estudada com mais detalhes em nível celular e molecular.

Os transplantes com cortes inteiros do baço passam por uma fase de necrose de massa antes da reconstrução de uma nova estrutura esplênica⁶. A fase inicial da necrose do enxerto sugere que a maior parte do tecido transplantado consiste em grande parte de glóbulos vermelhos e brancos e é desnecessária para a regeneração do baço. Isso foi investigado experimentalmente pela exclusão de células hematopoéticas de enxertos de baço antes do transplante sob a cápsula renal de camundongo. Aqui, a fração não leucocitária/não eritrocitária do baço, que inclui células estromais e endoteliais, mostrou-se suficiente para induzir a formação de novo ^tecido7. O tecido estromal do baço poderia ser processado em uma suspensão de célula única, permitindo o uso de tecnologias de classificação celular para manipular a composição do enxerto celular. Ao remover seletivamente os tipos celulares candidatos, foram identificadas duas populações de células estromais ^{CD45-TER-119–} indispensáveis para o desenvolvimento do enxerto: uma população de células CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ do tipo endotelial e uma população de células mesenquimais PDGFRβ⁺ mais amplamente^definida8.

A construção de enxertos a partir de células do baço varia em termos de materiais de suporte e processos de carregamento celular. Baços manipulados por tecidos foram previamente preparados carregando unidades esplênicas em um arcabouço poliglicólico de polímero de ácido poliglicólico/poli-L^de ácido lático ^5,9. Curiosamente, as células estromais do baço absorvidas em uma esponja de colágeno falharam em enxertar, enquanto as células estromais agregadas e carregadas sobre uma folha de colágeno facilitaram a regeneração do baço⁸. A ressuspensão de células estromais do baço dentro de uma matriz de Matrigel também demonstrou induzir agregação celular em condições de cultura tridimensional¹⁰. Entretanto, esse método ainda não foi testado para uso em modelos de transplante. O objetivo geral do protocolo atual é agregar e encapsular à força células estromais do baço diretamente na matriz da membrana basal, que posteriormente podem ser transferidas para um sistema tridimensional de cultura de tecidos in vitro ou usadas como veículo para transplantes em modelo animal (Figura 1 Suplementar).

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos experimentais aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Queensland (UQBR/079/19). 1. Coleta de tecidos e preparo de células estromais Eutanásia de camundongos doadores neonatais BALB/c machos e/ou fêmeas de 0,5-1,5 dias de idade por indução de hipotermia, envolvendo os animais dentro do papel higiênico e colocando-os sob gelo triturado por >10 min.NOTA: Este protoc…

Representative Results

A agregação celular é importante para promover o contato e a sinalização célula-a-célula. Os agregados celulares que envolvem o interior da matriz da membrana basal suportaram ambas as culturas tridimensionais para a formação de organoides teciduais in vitro e facilitaram a entrega mecânica das células na cápsula renal para o transplante do enxerto. Para estabelecer esses construtos, a matriz da membrana basal foi primeiramente mantida em estado fluídico sob condições geladas. A agregação celula…

Discussion

A agregação de células neonatais do baço dentro de um meio semissólido representa um método viável para a geração de construtos esplênicos. Protocolos semelhantes baseados em matriz de membrana basal têm sido utilizados para iniciar culturas tridimensionais do baço¹⁰. Aqui, demonstramos que construtos esplênicos são igualmente passíveis de sistemas de cultura de organoides in vitro , bem como de modelos de transplante in vivo . É importante ressaltar que o transpl…

Materials

96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm